大肠杆菌的培养和分离

一、大肠杆菌的培养和分离

用__________扩大培养，再用__________分离，形成一个个单独的菌落。

__________培养基是细菌通用培养基；__________培养基是植物组织培养通用培养基2.细菌分离方法比较

__________分离法---方法简单；

__________分离法—单菌落易分离，操作复杂

3.灭菌操作

①灭菌操作的首要条件是各种器皿必须是无菌的

②各种培养基必须是无菌

4.培养和分离步骤

__________→__________→__________培养__________分离→培养保存

5.灭菌与消毒

二、分离以尿素为唯一氮源的微生物

1.实验原理

（1）利用尿素的细菌含有__________，通过降解_______作为其生长的氮源，其反应式如下：（NH2）2C=O+H2O----脲酶→____________________2

（2）利用指示剂（______）颜色变化检验脲酶所催化的反应，若酚红由__________色变为__________色，证明尿素以被脲酶水解产生__________

2实验步骤

制备__________培养基和以______为唯一氮源固体培养基→制备细菌__________，并稀释至10-3、10-4、10-5、10-6→__________分离→培养保存

注意：在恒温箱中培养时，培养皿要__________—防止凝结的蒸馏水滴到培养基上

3预测结果：

①LB全素固体培养基上__________；

②以尿素为唯一氮源固体培养基__________；

③一定时间内，菌落周围出现__________区域；

④用浓度为10-4和10-5土壤稀释液接种，__________土壤稀释液更容易形成单菌落。

高考及高考模拟题

1.（16年10月32T）回答下列（一）（二）小题

（一）请回答从土壤中分离产脲酶细菌和脲酶固定化实验的有关问题

（1）LB固体培养基：取适量的蛋白胨、酵母提取物、NaCl，加入一定量的蒸馏水溶解，再加，灭菌备用。

（2）尿素固体培养基：先将适宜浓度的尿素溶液用灭菌过的G6玻璃砂漏斗过滤，因为G6玻璃砂漏斗，故用于过滤细菌。然后将尿素溶液加入到已经灭菌的含有酚红的培养基中，备用。

（3）取适量含产脲酶细菌的10-4、10-5两种土壤稀释液，分别涂布接种到LB固体培养基和尿素固体培养基上，培养48h，推测固体培养基上生长的菌落数最少的是（A. 10-5稀释液+尿素固体培养基 B. 10-5稀释液+LB固体培养基 C. 10-4稀释液+尿素固体培养基 D. 10-4稀释液+LB固体培养基）。在尿素固体培养基上产脲酶细菌菌落周围出现，其原因是细菌产生的脲酶催化尿素分解产生所致。

（4）制备固定化脲酶时，用石英砂吸附脲酶，装柱。再用蒸馏水洗涤固定化酶柱，其作用是。

答案：（一）（1）琼脂（2）高压蒸汽孔径小，细菌不能滤过（3）A 红色环氨（或NH3）（4）除去游离的脲酶

2.（17届选择题3月32T）（一）生活饮用水的微生物安全性日常检测是很重要的。请回答

下列问题：

（1）培养大肠杆菌所用的LB培养基一般用法灭菌。检验大肠杆菌的含量时，通常将水样用进行一系列的梯度稀释。

（2）将稀释后的水样分别用玻璃刮刀到LB固体培养基，于恒温培养箱，在℃条件进行培养。用该方法统计样本菌落数时（填需

要或不需要）设置对照组。

（3）下图表示培养和纯化大肠杆菌的部分操作步骤，下列相关叙述正确的是_________。

A．步骤①倒平板操作时，倒好后应立即将其倒过来放置

B．步骤②接种环火焰上灼烧后迅速蘸取菌液后划线

C．步骤③多个方向划线，使接种物逐渐稀释，培养后出现单个菌落

D．步骤④恒温培养箱培养后可用来对大肠杆菌进行计数

答案：（1）高压蒸汽灭菌无菌水（2）涂布倒置37 需要（3）C

3.（金华市17年1月期末32T）(1)在“分离以尿素为氮源的微生物”的实验中，配制好的尿素固体培养基加上封口膜后用方法灭菌，冷却后加入用G6玻璃纱漏斗过滤的尿素溶液。玻璃纱漏斗角后需用适宜浓度的浸泡，再用冲洗，干燥后保存。

答案：高压蒸汽灭菌 HCl 蒸馏水

4.（湖州市17年1月32T）(一）随着社会的发展，石油产品的使用越来越多，石油烃污染也越来越严重。为了筛选出分解石油烃能力强的微生物，人们不断地进行研究。下图为获取能分离出分解石油烃的微生物的土壤样品后的研究过程，请回答有关问题：

(1)获取土壤样品的取样地点最好选在。为了能有效地分离出分解石油烃的微生物,过程①④所用的选择培养基只能以石油烃作为唯一碳源，其原因是。

(2)根据⑤平板上生长的菌落，对④进行接种采用的方法是 ,若发现在⑤中无法区分菌落，可以将图中③取出的菌液。

(3)纯化菌株时，通常使用的划线工具是。采用方法对其进行灭菌。划线的某个平板培养后,第一划线区域的划线上都不间断地长满了菌落,第二划线区域所划的第一条线上无菌落，其他划线上有菌落。造成划线无菌落可能的操作失误是

(写出一点即可)。

答案：（1）石油烃污染明显处只有能利用石油烃的微生物能正常生长繁殖（2）涂布分离进行（梯度）稀释

（3）接种环灼烧接种环灼烧后未冷却；划线未从第一区域末端开始划线

5.（浙江省17届模拟卷二32T）(一）脲酶是催化尿素分解的特异性水解酶。该酶主要从刀豆等豆科植物提取，现被广泛应用于尿素废水的净化过程。请分析回答以下问题：

(1)脲酶可以催化尿素分解为，其中碱性物质可以能使酌红指示剂变为。

(2)为了提高脲酶的利用效率，可以釆用固定化酶技术将其固定。酶的固定化方法有：吸附法、共价偶联法、包埋法和。

(3)实验室中可以采用吸附法将该酶制成固定化酶柱，让尿素废水过柱前，先用10倍体积的蒸馏水洗涤酶柱，目的是。

(4)脲酶除了从植物获取外，还可以来源于土壤中的微生物。为了从土壤中分离得到队尿素为氮源的微生物,采用的分离方法操作最简便的是。下列有关该分离方法的操作叙述错误的是。

A.必须使用固体培养基

B.必须在酒精灯火焰旁接种

C.必须将接种后的培养皿倒置培养

D.必须将接种前的培养皿、培养基、土壤悬浮液等进行灭菌处理

答案：(1)NH3和CO2（1分，顺序可对换，错答或漏答不得分）红色（1分）

(2)交联法（1分）（3)除去未吸附的游离尿酶（1分）(4)划线分离法（1分） D(2分）6.（超级全能王16年12月联考32T）(一)漆酶属于木质降解酶类，在环境修复、农业生产等领域有着广泛用途。下图是分离、纯化和保存漆酶菌株的过程。