大肠杆菌的培养和分离
实验1 大肠杆菌的培养和分离
B．划线上一定会出现单个突变菌株
C．此法不能除去污染的杂菌
D．划线上一定会出现细菌单菌落
7．将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入37℃恒温箱的目的是…… …( )
A．对比观察培养基有没有被微生物利用 B．对比分析培养基是否被杂菌污染
C．没必要放入未接种的培养基
D．为了下次接种时再使用
实验2 分离以尿素为氮源的微生物
平均菌落数÷涂布的稀释液体积×稀释倍数 （3）利用鉴别培养基确定细菌种类： 在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了 氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高 。因此，我们可以通过检测培 养基pH变化来判断该化学反应是否发生。在以尿素为唯一氮源的培养基 中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红，说 明该细菌能够分解尿素。 3．思考题： （1）农作物不能直接吸收利用尿素，但尿素却是农业生产上的重 要氮肥。农作物如何利用尿素中的氮？
2．实验原理：
使用通用的细菌培养基（如LB液体培养基）可扩大培养大肠杆菌，使大肠杆菌迅速扩增。 在LB固体平面培养基上对大肠杆菌进行划线分离，经培养后培养基上每一个菌体会形成一 个单独的菌落。这是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选突变菌株的最简便方法之一。 为保证配制的培养基上只生长大肠杆菌，而不被其他微生物污染，实验过程中要进行无菌 操作。
到（ ）
A．无一定形态的群体 B．菌丝 C．单个细菌 D．菌落
4．以下叙述中对尿素培养基进行灭菌的不正确操作是( )
A．对配制好的尿素培养基进行高压蒸汽灭菌
B．用内置滤膜的玻璃漏斗过滤尿素溶液
【实验记录】 请课代表将在37℃恒温培养箱中培养12－24h的培养结果用相机拍摄下 来，传给任课教师。 【结果分析】 1.你的培养基上是否有杂种污染？如何判断？
实验一大肠杆菌的分离和培养
细菌
2.微生物涉及五类 放线菌
真菌
原生动物
(二)培养基
• 1.分类(按物理形态分) • (1)液体培养基 • (2)固体培养基
①常用旳固体培养基: 琼脂固体培养基.
②微生物在固体培养基 表面生长,能够形成 肉眼可见旳菌落.
2.培养基内所含旳基本物质
• (1)水 • (2)碳源 • (3)氮源 • (4)无机盐
a.灼烧灭菌
注意合用范围
微生物旳接种工具 (接 种环、接种针)或其 他金属用具直接在火 焰旳充分燃烧层灼烧
b. 干热灭菌 160－170℃ ；1－2h
能耐高温旳需要保持干 燥旳物品( 玻璃器皿)
c.高压蒸汽灭菌 100kPa 121℃ 15-30min
一般用于培养基旳灭菌
二、试验操作 • （一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
• 计算－称量－溶化－灭菌－倒平板
• （二）分离纯化大肠杆菌
• 接种措施有：
• 划种未接 种旳培养基放入37℃恒温箱中培养12h 和24h后，观察并统计
三、课题延伸：菌种旳保藏
• 1、斜面保藏 • （临时保存） • 2、甘油保藏
（长久保 存）
试验1：大肠杆菌旳培养和分离
角烧瓶旳液体培养基中，三角烧瓶在37℃摇床振荡培养 12h。 • (4) 划线分离：将摇床上培养12h旳菌液在固体培养基旳 平板上连续划线，然后将盖好旳培养皿倒置，放在37℃ 恒温培养箱中进行培养。 • (5)单菌落接种培养：在无菌操作下将单菌落用接种环取 出，再用划线法接种在空白斜面上，在37℃下培养24h, 4℃冰箱保存。
设备及用具：
灭菌锅或高压锅、250ml旳三角瓶、封口膜和橡皮圈、 直径90mm旳培养皿、接种环和玻璃三角刮刀、恒温培 养箱、摇床、酒精灯和超净台、一次性塑料手套、装有 酒精棉球旳广口瓶、镊子、有棉塞旳试管 （15mm×120mm）5支
《大肠杆菌的培养和分离》实验设计
《大肠杆菌的培养和分离》实验设计实验目的：1. 掌握大肠杆菌的培养方法和分离技巧。
3. 培养和分离大肠杆菌是许多生物技术实验的基础，通过本实验的学习，同学们可以更好地开展相关生物技术实验工作。
实验原理：大肠杆菌是一种常见的肠道细菌，在微生物学及相关学科的研究中具有重要意义。
为了能够更好地开展生物技术实验，需要掌握大肠杆菌的培养方法和分离技巧。
在培养大肠杆菌时，我们一般选用LB培养基（Luria-Bertani培养基），它是一种营养丰富的培养基，可以满足大肠杆菌的营养需求。
在制备LB培养基时，需将适量的蛋白胨、酵母提取液和纯化水混合均匀后加热至沸腾约1分钟，然后加入适量琼脂糖，搅拌均匀后装入烧瓶中。
分离纯化大肠杆菌时，需要将样品（如肠道内容物、污水等）进行稀释，使其细菌浓度达到一定范围，然后在LB培养基上进行平板培养。
在培养过程中，需要控制培养温度、时间和氧气浓度等因素，以促进大肠杆菌的生长和繁殖。
随着时间的推移，大肠杆菌会在平板上生长成大量的细菌菌落，此时，我们可以将单个细菌菌落挑选出来进行分离纯化，以得到单一纯化的大肠杆菌。
实验材料与仪器：材料：LB培养基、螺旋细胞均一器、平板培养基、霉菌试验纸、吸管、医用酒精、胶体金离子分离剂等仪器：高压灭菌器、移液管、显微镜、细胞计数板实验步骤：1. 制备LB培养基。
2. 取样和稀释。
取样品（如肠道内容物、污水等），取适量于吸管中，并将其进行稀释，使其细菌浓度达到一定范围。
3. 平板培养。
将LB培养基倒入平板中，恰好覆盖平板的整个表面。
待培养基凝固后，使用螺旋细胞均一器将取样液均匀滴在培养基表面上。
将平板置于37℃恒温箱中，控制温度和氧气浓度等因素，待大肠杆菌细菌菌落生长到足够数量时，进入下一步。
4. 分离纯化。
将平板上的大肠杆菌细菌菌落挑选出来，使用吸管将细菌菌落转移到新的平板中进行分离纯化。
一般建议选择较小的细菌菌落进行挑选，这样可以减少细菌间的竞争，提高挑选单一菌株的成功率。
大肠杆菌培养和分离
大肠杆菌培养和分离超净台实验准备工作2灭菌和消毒无菌操作目的：为了避免被杂菌污染。
1对实验操作空间：超净台：紫外线灭菌，过滤风桌面：酒精擦拭，酒精灯外焰附近操作2.操作者衣服和手进行：清洁和消毒，70%酒精3.避免已灭菌处理的材料用具和周围物品的接触消毒的方法1、100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法70-75℃下煮30min或80℃下煮15min3、用70%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒4、氯气、高锰酸钾消毒……（1）消毒：利用化学或物理方法，杀死大部份致病微生物的过程。
消毒与灭菌的区别（2）灭菌：灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。
以化学剂或物理方法消灭所有微生物，包括所有细菌的繁殖体、芽孢、霉菌及病毒，而达到完全无菌的过程。
实验1大肠杆菌的培养和分离超净台上紫外灯和过滤风实验过程：准备阶段：1培养基的配制，2灭菌和消毒操作阶段：1倒平板：分装固体培养基倒平板：将已灭菌的固体培养基倒入培养皿的过程。
分装培养基：1倒平板：将灭菌后的固体培养基倒入培养皿培养基冷却到60度时倒入2培养基的分装（试管，三角瓶，培养皿）倒入三角瓶和试管（漏斗法）1.培养基灭菌后，需要冷却到60℃左右时，才能用来倒平板。
你用什么办法来估计培养基的温度？答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。
2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
朊病毒就是蛋白质病毒，是只有蛋白质而没有核酸的病毒。
1997年诺贝尔医学/生理学奖的获得者美国生物学家斯垣利·普鲁辛纳(S.B.Prusiner)就是由于研究朊病毒作出卓越贡献而获此殊荣的。
细菌细胞壁的主要成分是肽聚糖，它使得这层壁坚韧并富有弹性。
一旦失去细胞壁，所有的细菌都将变成球形。
细菌细胞壁的主要功能是保护细胞、维持细胞形状、协助鞭毛运动等，而且还与细菌的抗原性、致病性和对噬菌体的敏感性有关。
大肠杆菌的分离及培养条件的优化
结果的比较与讨论
05
结论与展望
authoritarian, however, will be applied to name of which this article's authoritive, however, will be applied to name of which this article_nameOf(其他
含有伊红和美蓝两种染料，对大肠杆菌具有选择性吸附作用，使菌落呈现紫色。
LB培养基
是一种营养丰富的培养基，适用于细菌的大量繁殖，有利于大肠杆菌的生长。
富集培养基
划线分离法
通过在固体培养基上划线，使菌落分散成单个菌落，便于分离纯化。
涂布分离法
将细菌悬浮液均匀涂布在培养基表面，形成单层菌落，便于分离纯化。
通过添加不同营养成分，发现培养基中含适量氨基酸和维生素时，大肠杆菌生长最佳。
pH值对生长的影响
在pH值为7.0时，大肠杆菌的生长最佳，酸碱度过高或过低都不利于其生长。
培养条件优化效果
经过优化后，大肠杆菌的生长速度和菌落数量明显增加。
比较不同分离纯化方法的效果
实验结果表明，划线分离法与液体培养基分离法相比，前者分离纯度更高，但操作繁琐，后者操作简便，纯度也较高。
03
01
02
03
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结论与展望
结论与展望
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结论与展望
实验1大肠杆菌的分离和培养
接种方法有：
平板划线法和稀释涂布平板法
平板划线法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续画线的操作,将聚集的菌钟逐步稀释分散到培养基的表面.
在数次画线后,可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是菌落.
微生物的接种技术
2、纯化大肠杆菌
平板划线的操作方法 交叉划线法 连续划线法
9．倒平板:
倒平板技术
培养基灭菌后，需要冷却到50 ℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？ 答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。
为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？ 答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
问题讨论
4.培养基的用途
液体培养基：增菌 固体培养基：纯化，增菌 半固体培养基：动力检测，保种
二、无菌技术
无菌技术的概念 无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。无论是随后将要学到的倒平板、平板划线操作，还是平板稀释涂布法，其操作中的每一步都需要做到“无菌”，即防止杂菌污染。只有熟练、规范地进行无菌操作，才可能成功地培养微生物。
将50ml培养基用玻棒转移至三角锥瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮纸，再放入高压蒸气灭菌锅，在压力为100kPa、温度为121℃，灭菌15～30min。将培养基用旧报纸包裹，放入干热灭菌箱内，在160～170 ℃下灭菌2h。
8．灭菌:
待培养基冷却到50 ℃左右时，在酒精灯附近倒平板。（倒平板操作见课本）2d后观察平板，无杂菌污染才可用来接种. 无菌检查： 将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24—48小时，以检查灭菌是否彻底。
真菌
培养基
实验1,大肠杆菌的培养和分离
实验1,大肠杆菌的培养和分离篇一：实验1 大肠杆菌的培养和分离实验教学提纲实验1 大肠杆菌的培养和分离教学提纲实验目的1. 进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培养的操作。
2. 进行大肠杆菌的分离，用固体培养基进行细菌的划线培养。
3. 说明大肠杆菌的培养条件和操作要求的原理。
实验材料1. 配制LB液体培养基，蛋白胨0.5g，酵母提取液0.25g，氯化钠0.5g，加水50mL溶解。
2. 配制LB固体培养基，蛋白胨0.5g，酵母提取液0.25g，氯化钠0.5g，琼脂1g，加水50mL溶解（配制LB固体培养基是用来倒平板和倒试管斜面）。
实验步骤1. 培养基灭菌。
在两个150mL的三角瓶中分别装入50mL LB液体培养基和50mL LB 固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上封口膜(一种塑料薄膜，中间有小孔的滤膜。
既可以通气，又不使细菌进入。
)。
将培养皿用牛皮纸包好，放入高压灭菌锅中，1kg压力灭菌15min（有压力时开始计时）。
同时将需要灭菌使用的培养皿、试管、三角瓶等和所用器械（接种环、镊子等）等一块灭菌。
2. 倒平板，倒斜面。
灭菌后。
待高压锅压力与大气压相同时，打开锅盖，将有培养基的三角瓶、试管、培养皿等放在灭菌后的超净工作台上。
超净工作台操作：打超净工作台的紫外灯（注意：打开紫外灯后人必须离开），持续30min，关闭紫外灯，打开过滤风和白炽灯。
将有培养基的三角瓶和培养皿放在灭菌后的超净工作台上后，点燃酒精灯，用镊子夹出酒精棉球擦拭桌面，并用酒精棉球擦手。
待固体培养基冷却到60℃时（手放上还有些热的时候），在酒精灯火焰旁，以右手无名指及小指夹持含有固体培养基的三角瓶的封口膜，右手其他三个手指拿着三角瓶；左手拿着培养皿，并打开上盖的一边，将三角瓶的培养基约10～20mL倒入1 个培养皿中。
倒入后立即置于水平位置上，轻轻摇晃，使培养基铺满培养皿底，待凝，使之形成平面。
倒斜面（试管内空白斜面），用玻璃漏斗倒入试管内，每试管2mL。
微生物的利用-大肠杆菌的培养与分离
实验原理
① 培养基 ② 大肠杆菌 ③ LB液体培养基和LB固体培养 基 ④ 划线分离法 ⑤ 菌种的低温保存 ⑥ 无菌技术
一、培养基定义及营养成分
1、定义 人们按照微生物对营养物质的不同需求，配置出供其生长 繁殖的营养基质，称为培养基。 2、营养成分 培养基中的营养物质包括水、无机盐、碳源、氮源、生长 因子等
• 主要方法：无菌室 无菌柜 超净工作台
• ② 无菌实验器材： 凡是实验中使用的器材，能灭菌处理的必须 灭菌。 • 如玻璃器皿 （包括注射器、吸管、滴管、三角瓶、试管等）、培 养基、无菌衣 、口罩等，无法灭菌处理的，使用前必须经消毒处 理，例如无菌室内的凳、试管架、天平等，这些虽然无法灭菌， 但是可以消毒，可用化学药品熏蒸、喷洒或擦拭。
• 2、营养成分 • ① 碳源 • 为微生物提供碳元素的物质，可分为有机碳源和无机碳源 • 。如 CO2、NaHCO3 等无机碳源； • 糖类、石油、花生粉饼等有机碳源，异养微生物只能利用有机碳 源；单质碳不能作为碳源。 • 注意：碳源&能源的辨析
• 2、营养成分 • ② 氮源 • 为微生物提供氮元素的物质，可分为有机氮源和无机氮源 • 。有机氮源包括牛肉膏，蛋白胨等， • 无机氮源包括 N2、NH3、NH4+、NO3-等，只有固氮微生物才能利 用 N2。
微生物的利用
1大肠杆菌的培养和分离 2分离以尿素为氮源的微生物
大肠杆菌的培养和分离
• 实验目的 • 实验原理 • 实验器具与材料 • 实验步骤 • 实验结果和结论 • 知识拓展
实验目的
• 利用LB液体培养基进行大肠杆菌的扩增培养的操作 • 利用LB固体平面培养基划线培养进行大肠杆菌的分离 • 说明大肠杆菌培养的条件和操作要求的原理
大肠杆菌的培养和分离
1
2.请你判断以下材料或用具是否需要 消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的 方法。
（1） 培养细菌用的培养基与培养皿 （2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管 （3） 实验操作者的双手
答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。
二、大肠杆菌的培养和分离实验操作
（一）培养基的配置与灭菌
取2个250ml的三角瓶中分别装入50mlLB液体培养 基和50mlLB固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上 封口膜，牛皮纸包装后高压锅灭菌15min。
划线分离法注意事项:
1.接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不 同位置连续划线多次.
2.划线首尾不能相接
3.划线后,培养皿倒置培养12~24h
1.培养基灭菌后，需要冷却到50 ℃左右时， 才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的 温度？
答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶， 感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可 以进行倒平板了。
一、大肠杆菌（E. coli）
兼性厌氧的肠道内的共生菌群
合成维生素B和维生素K，供机体利用； 产生大肠杆菌素，抑制肠道致病菌和 腐生菌滋生。
革兰氏阴性菌
作为一种工程菌， 在基因工程技术中被广泛采用。 例：大规模生产治疗糖尿病的药物——胰岛素
培养基（culture media）
按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的 供其生长繁殖的营养基质。
b. 干热灭菌 160－170℃ ；1－2h
能耐高温的需要保持干 燥的物品( 玻璃器皿)
c.高压蒸汽灭菌 100kPa 121℃ 15-30min
通常用于培养基的灭菌
高压蒸汽灭菌法
高压蒸汽灭菌法为湿热灭菌法，其优点有三： 1、湿热灭菌时菌体蛋白容易变性； 2、湿热穿透力强； 3、水蒸汽变成水时可放出大量热增强杀菌效 果，因此，2）灭菌：
试验1大肠杆菌的培养与分离
.实验1：大肠杆菌的培养和分离一、教学要求二、基本内容1．培养基的种类和化学成份培养基的种类有很多划分标准，按物理性质分：固体培养基和液体培养基（加入琼脂多少）。
液体培养基用于扩大培养和工业生产，固体培养基用于菌种分离，鉴定，计数（菌落数量）。
培养基的化学成分包括水、无机盐、碳源、氮源、生长因子等。
按照微生物的同化作用类型是自养还是异养，碳源不同，自养微生物为无机碳源，如硝化细菌是二氧化碳或碳酸盐，异养微生物为有机碳源，如大肠杆菌是葡萄糖等有机物。
2．常见微生物类群原核生物（如细菌大肠杆菌――二分裂、革兰氏阴性、异养兼性厌氧性肠道杆菌、蓝藻、支原体、衣原体、放线菌等）、原生生物（草履虫、变形虫等）、真菌（酵母菌――出芽生殖.异养兼性厌氧性微生物、霉菌、食用菌）、病毒等。
细菌是单细胞的原核生物，有细胞壁（肽聚糖）、细胞膜、细胞质，无成型的细胞核，只有一环状DNA分子（拟核）。
以分裂（二分裂）的方式繁殖，分裂速度很快。
用革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性菌（革兰氏染液染色后，再脱色处理，细菌仍保留染色液的颜色）和革兰氏阴性菌两大类，区别在细胞壁的成分不同。
大肠杆菌是革兰氏阴性（细胞壁薄，有荚膜）、兼性厌氧的肠道杆菌。
3．无菌技术对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌；为避免周围微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰附近旁进行；避免已灭菌处理的材料用具与周围物品相接触。
灭菌方法：。
灼烧灭菌法①接种环、接种针、试管口等使用..②玻璃器皿、金属用具等使用干热灭菌法，所用器械是干热灭菌箱。
③培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅。
④表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法，所用器械是紫外灯。
4．培养基的配制原则目的要明确：根据培养的微生物种类、培养的目的等确定培养基的类型和配制量。
营养要协调：培养基中各种营养物质的浓度和比例要适宜。
pH要适宜：细菌培养基pH中性或偏碱性，霉菌培养基呈酸性。
《大肠杆菌的培养和分离》 学历案
《大肠杆菌的培养和分离》学历案一、学习目标1、了解大肠杆菌的生物学特性和在生物技术中的重要性。
2、掌握大肠杆菌培养的基本原理和操作方法。
3、学会大肠杆菌分离的技术和方法。
4、培养无菌操作的意识和实验技能。
二、学习重难点1、重点（1）大肠杆菌培养的条件和培养基的制备。
（2）无菌操作技术在大肠杆菌培养和分离中的应用。
2、难点（1）大肠杆菌的分离和纯化方法。
（2）如何确保实验操作的无菌环境。
三、知识准备1、微生物的基本概念微生物是指肉眼难以看清，需要借助显微镜才能观察到的微小生物，包括细菌、真菌、病毒等。
2、细菌的结构和生理特点细菌通常具有细胞壁、细胞膜、细胞质和核质等结构。
其生理活动包括营养摄取、代谢、生长和繁殖等。
3、培养基的类型和作用培养基是人工配制的、适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质。
常见的培养基类型有固体培养基、液体培养基和半固体培养基等，它们分别适用于不同的实验目的。
四、学习过程1、大肠杆菌的培养（1）培养基的制备首先，准备LB培养基（LuriaBertani培养基）的成分，包括胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠等。
按照一定的比例将这些成分溶解在蒸馏水中，调节pH值至适当范围。
然后，将培养基进行高压蒸汽灭菌，以杀灭其中的微生物和芽孢。
（2）接种在无菌环境下，使用无菌接种环或移液器，从保存的大肠杆菌菌种中吸取少量菌液，接入已灭菌的液体培养基中。
接种过程要迅速，避免杂菌污染。
（3）培养条件将接种后的培养基置于恒温培养箱中，在37℃下进行振荡培养。
振荡培养可以增加培养基中的氧气含量，促进大肠杆菌的生长。
2、大肠杆菌的分离（1）平板划线法在无菌操作台上，将已灭菌的固体培养基倒入培养皿中，待其冷却凝固。
用接种环蘸取少量大肠杆菌培养液，在固体培养基表面进行连续划线。
通过多次划线，将细菌逐步稀释，最终在培养基表面形成单个菌落。
（2）稀释涂布平板法首先，将大肠杆菌培养液进行一系列梯度稀释。
然后，取适量不同稀释度的菌液，分别涂布在固体培养基表面。
实验1：大肠杆菌的培养和分离
04 实验结果与分析
大肠杆菌的培养结果
培养基上生长情况
大肠杆菌在培养基上生长良好，菌落 形态呈圆形、湿润、表面光滑，颜色 为乳白色。
生化反应
大肠杆菌能够发酵乳糖产酸，在生化 反应中表现出特定的特征性变化。
菌落计数
通过菌落计数，我们得到了大肠杆菌 的菌落数量，菌落数量在适宜的条件 下随着培养时间的延长而增加。
详细描述
将接种后的培养皿放置在恒温培养箱中，保持适宜的温度和湿度。在培养过程中，要定期观察大肠杆 菌的生长情况，记录生长曲线，以便后续分析。培养过程中要保持培养皿的清洁，防止杂菌污染。
大肠杆菌的分离
总结词
分离是通过一定的技术手段将目标微生物从混合菌群中单独 获取的过程。
详细描述
在大肠杆菌培养完成后，采用涂布法或划线法将菌落分离， 获得单菌落。分离过程中要保证无菌操作，避免交叉污染。 分离得到的单菌落可用于后续的鉴定和实验研究。
了解大肠杆菌的生物学特性
了解大肠杆菌的形态、染色、生化反 应等生物学特性，能够通过实验结果 判断所分离的菌株是否为大肠杆菌。
了解大肠杆菌的致病性，包括其产生 的毒素、侵袭力、抵抗力等方面的特 性，为后续实验和研究提供基础。
掌握微生物实验的基本操作
掌握微生物实验的基本操作，包括无菌操作、显微镜使用、细菌计数、菌种保存 等，能够独立完成微生物实验。
条件致病菌
在特定条件下，大肠杆菌可引 起肠道外感染，如败血症、新
生儿脑膜炎等。
抗原结构
大肠杆菌具有O抗原、H抗原 和K抗原，可用于血清学分型
。
大肠杆菌的培养基
01
02
03
基础培养基
如肉汤培养基、营养琼脂 培养基等，提供大肠杆菌 生长所需的基本营养成分。
高中生物 第一部分《实验一 大肠杆菌的培养和分离》课件13 浙科版选修1
①常用的固体培养基:
琼脂固体培养基. ②微生物在固体培养基
表面生长,可以形成
肉眼可见的菌落.
第七页，共38页。
2.培养基内所含的基本物质
• (1)水 • (2)碳源
• (3)氮源
• (4)无机盐
第八页，共38页。
3.培养基内所需的其他条件 • (1)pH值 • 如:培养霉菌需酸性、培养细菌需中性或微碱
α-固定化酶的使用 α-固定化酶 条件和效果
枯草杆菌
果酒和果醋的制作 果酒:酵母菌+天然 干酵母 果醋:醋化醋杆菌 菌种或醋曲
泡菜的腌制和亚硝 假丝酵母、乳酸菌 天然微生物 酸的测定
植物组织培养
菊花
第二页，共38页。
实验1 大肠杆菌的培养和分离
• 实验目的： • 1.进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进
的铅笔上，冷却后使培养基形成斜面。
第二十页，共38页。
步骤:
１、配制培养基; 培养基灭菌、器具灭菌
2、冷却，倒平板 (编号,无菌环境操无菌环境操作)
４、划线分离、恒温培养箱培养12~24h
(无菌环境操作)
５、接种斜面,4℃冰箱保存(目的:为了保存菌种)
6、实验完成后，接触过细菌的器皿均应灭菌处理后丢失。
4℃冰箱保存。
视频
6.实验完成后，接触过细菌的器皿均应灭菌处 理后丢弃。 目的：为了防止实验菌残留于接种环而污染环境 和感染实验人员。
第三十一页，共38页。
1为了获得纯净的培养物，其关键是防止外来杂菌的入侵 污染： 1）培养皿； 2）培养基； 3）接种过程是无菌的 2请思考：培养基、培养皿、手、接种环分别如何消毒或 灭菌？
大肠杆菌的培养和分离-25页精选文档
凝固剂 琼脂
固体培养基 分离纯化，鉴定菌种，计数，保藏
选择培养基 鉴定培养基
天然培养基 合成培养基
培养基成分
成分
作用
碳源
主要作能源物质
氮源
合成含N类化合物
无机盐
调节渗透压等
水
生长因子
调节促生长
主要来源
无机碳(CO2) 或有机碳(糖类) N2，NH3，铵，硝酸盐 尿素，牛肉膏，蛋白胨
实验1：大肠杆菌的培养和分离
微生物
放线菌
单细胞原核，分支状的菌丝（基内~、气生~）
芽孢
芽孢：细菌的休眠体
大肠杆菌
结构 异养型，兼性厌氧型，革兰氏阴性(红色)(G-) 物质(元素)组成：C H O N P S…
培养基类型
按照微生物灼烧接种环是为了避免接种环上可 能存在的微生物污染培养物
• 每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束 后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接 种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而 通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目 逐渐减少，以便得到菌落
• 划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残 留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者
倒平板过程总结
紫外灯，过滤风，酒精灯，酒精棉球 在火焰旁右手3指拿锥形瓶，2指拿封口膜 使锥形瓶的瓶口迅速通过火焰 左手将培养皿打开一条缝隙，右手将培养基倒入培
养皿，立刻盖上皿盖 待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置
步骤二：大肠杆菌的扩大培养
从大肠杆菌斜面→锥形瓶中的液体培养基 接种好后在37度摇床振荡培养12h 工具：接种环在接种前要灭菌
维生素，AA，碱基等
大肠杆菌的培养和分离
4．用电炉或煤气加热，并同时打开排气阀，使水沸腾 以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上 排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。 当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力 至所需时间。因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀 压，所以，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于 饱和蒸汽的温度。 5．灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌 锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时，打开 排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。如 果压力 未降到0时，打开排气阀，就会因锅内压力 突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡 而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发 生污染。 6．将取出的灭菌培养基放入 37℃温箱培养24小时， 经检查若无杂菌生长，即可待用。
2、无菌操作 打开滤风机，点燃酒精灯
用酒精棉球擦拭双手。打开培养皿、试管外包纸， 平放。 转接过程中，瓶塞和封口膜只能夹持手上，不许 落台面；操作过程在酒精灯火焰旁操作；接种环 接种前，环头烧红，环柄火焰上穿梭1~2次，放 入试管和培养皿中稍冷却后接触菌落或菌液，使 用完毕后，重复使用前操作，避免菌外泄；使用 玻璃刮刀和镊子时，从酒精中取出后燃尽其上酒 精即可。 胆大心细，动作快捷
平板培养基倒好冷却凝固后，不论接种还 是恒温培养，都需倒放，如正方，水蒸气 在盖上凝成水滴，滴到接种后的培养基表 面会冲散菌落，失去分离菌株的效果。
灭菌与消毒
杀死或除去一切微生物的方法——灭菌 杀死病原菌的方法——消毒
灭菌方法分类 （1）干热灭菌法 （2）湿热灭菌法 （3）过滤灭菌法 （4）紫外光灭菌法 （5）化学药剂灭菌法
多数细菌、酵母菌不形成菌丝，其菌落仅 生长在固体培养基表面，可用接种工具将 其全部挑起，即与培养基结合不紧密 。菌 落表面光滑而湿润，有黏稠性。
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一、大肠杆菌的培养和分离
用__________扩大培养，再用__________分离，形成一个个单独的菌落。
__________培养基是细菌通用培养基；__________培养基是植物组织培养通用培养基2.细菌分离方法比较
__________分离法---方法简单；
__________分离法—单菌落易分离，操作复杂
3.灭菌操作
①灭菌操作的首要条件是各种器皿必须是无菌的
②各种培养基必须是无菌
4.培养和分离步骤
__________→__________→__________培养__________分离→培养保存
5.灭菌与消毒
二、分离以尿素为唯一氮源的微生物
1.实验原理
（1）利用尿素的细菌含有__________，通过降解_______作为其生长的氮源，其反应式如下：（NH2）2C=O+H2O----脲酶→____________________2
（2）利用指示剂（______）颜色变化检验脲酶所催化的反应，若酚红由__________色变为__________色，证明尿素以被脲酶水解产生__________
2实验步骤
制备__________培养基和以______为唯一氮源固体培养基→制备细菌__________，并稀释至10-3、10-4、10-5、10-6→__________分离→培养保存
注意：在恒温箱中培养时，培养皿要__________—防止凝结的蒸馏水滴到培养基上
3预测结果：
①LB全素固体培养基上__________；
②以尿素为唯一氮源固体培养基__________；
③一定时间内，菌落周围出现__________区域；
④用浓度为10-4和10-5土壤稀释液接种，__________土壤稀释液更容易形成单菌落。
高考及高考模拟题
1.（16年10月32T）回答下列（一）（二）小题
（一）请回答从土壤中分离产脲酶细菌和脲酶固定化实验的有关问题
（1）LB固体培养基：取适量的蛋白胨、酵母提取物、NaCl，加入一定量的蒸馏水溶解，再加，灭菌备用。
（2）尿素固体培养基：先将适宜浓度的尿素溶液用灭菌过的G6玻璃砂漏斗过滤，因为G6玻璃砂漏斗，故用于过滤细菌。
然后将尿素溶液加入到已经灭菌的含有酚红的培养基中，备用。
（3）取适量含产脲酶细菌的10-4、10-5两种土壤稀释液，分别涂布接种到LB固体培养基和尿素固体培养基上，培养48h，推测固体培养基上生长的菌落数最少的是（A. 10-5稀释液+尿素固体培养基 B. 10-5稀释液+LB固体培养基 C. 10-4稀释液+尿素固体培养基 D. 10-4稀释液+LB固体培养基）。
在尿素固体培养基上产脲酶细菌菌落周围出现，其原因是细菌产生的脲酶催化尿素分解产生所致。
（4）制备固定化脲酶时，用石英砂吸附脲酶，装柱。
再用蒸馏水洗涤固定化酶柱，其作用是。
答案：（一）（1）琼脂（2）高压蒸汽孔径小，细菌不能滤过（3）A 红色环氨（或NH3）（4）除去游离的脲酶
2.（17届选择题3月32T）（一）生活饮用水的微生物安全性日常检测是很重要的。
请回答
下列问题：
（1）培养大肠杆菌所用的LB培养基一般用法灭菌。
检验大肠杆菌的含量时，通常将水样用进行一系列的梯度稀释。
（2）将稀释后的水样分别用玻璃刮刀到LB固体培养基，于恒温培养箱，在℃条件进行培养。
用该方法统计样本菌落数时（填需
要或不需要）设置对照组。
（3）下图表示培养和纯化大肠杆菌的部分操作步骤，下列相关叙述正确的是_________。
A．步骤①倒平板操作时，倒好后应立即将其倒过来放置
B．步骤②接种环火焰上灼烧后迅速蘸取菌液后划线
C．步骤③多个方向划线，使接种物逐渐稀释，培养后出现单个菌落
D．步骤④恒温培养箱培养后可用来对大肠杆菌进行计数
答案：（1）高压蒸汽灭菌无菌水（2）涂布倒置37 需要（3）C
3.（金华市17年1月期末32T）(1)在“分离以尿素为氮源的微生物”的实验中，配制好的尿素固体培养基加上封口膜后用方法灭菌，冷却后加入用G6玻璃纱漏斗过滤的尿素溶液。
玻璃纱漏斗角后需用适宜浓度的浸泡，再用冲洗，干燥后保存。
答案：高压蒸汽灭菌 HCl 蒸馏水
4.（湖州市17年1月32T）(一）随着社会的发展，石油产品的使用越来越多，石油烃污染也越来越严重。
为了筛选出分解石油烃能力强的微生物，人们不断地进行研究。
下图为获取能分离出分解石油烃的微生物的土壤样品后的研究过程，请回答有关问题：
(1)获取土壤样品的取样地点最好选在。
为了能有效地分离出分解石油烃的微生物,过程①④所用的选择培养基只能以石油烃作为唯一碳源，其原因是。
(2)根据⑤平板上生长的菌落，对④进行接种采用的方法是 ,若发现在⑤中无法区分菌落，可以将图中③取出的菌液。
(3)纯化菌株时，通常使用的划线工具是。
采用方法对其进行灭菌。
划线的某个平板培养后,第一划线区域的划线上都不间断地长满了菌落,第二划线区域所划的第一条线上无菌落，其他划线上有菌落。
造成划线无菌落可能的操作失误是
(写出一点即可)。
答案：（1）石油烃污染明显处只有能利用石油烃的微生物能正常生长繁殖（2）涂布分离进行（梯度）稀释
（3）接种环灼烧接种环灼烧后未冷却；划线未从第一区域末端开始划线
5.（浙江省17届模拟卷二32T）(一）脲酶是催化尿素分解的特异性水解酶。
该酶主要从刀豆等豆科植物提取，现被广泛应用于尿素废水的净化过程。
请分析回答以下问题：
(1)脲酶可以催化尿素分解为，其中碱性物质可以能使酌红指示剂变为。
(2)为了提高脲酶的利用效率，可以釆用固定化酶技术将其固定。
酶的固定化方法有：吸附法、共价偶联法、包埋法和。
(3)实验室中可以采用吸附法将该酶制成固定化酶柱，让尿素废水过柱前，先用10倍体积的蒸馏水洗涤酶柱，目的是。
(4)脲酶除了从植物获取外，还可以来源于土壤中的微生物。
为了从土壤中分离得到队尿素为氮源的微生物,采用的分离方法操作最简便的是。
下列有关该分离方法的操作叙述错误的是。
A.必须使用固体培养基
B.必须在酒精灯火焰旁接种
C.必须将接种后的培养皿倒置培养
D.必须将接种前的培养皿、培养基、土壤悬浮液等进行灭菌处理
答案：(1)NH3和CO2（1分，顺序可对换，错答或漏答不得分）红色（1分）
(2)交联法（1分）（3)除去未吸附的游离尿酶（1分）(4)划线分离法（1分） D(2分）6.（超级全能王16年12月联考32T）(一)漆酶属于木质降解酶类，在环境修复、农业生产等领域有着广泛用途。
下图是分离、纯化和保存漆酶菌株的过程。
(1)在步骤①中，用稀释制成不同浓度的样品悬液。
(2)步骤②中将保存在70%酒精中的放在酒精灯火焰上，待火焰熄灭，将菌液涂布到整个平面，将培养皿在37°C恒温培养箱中培养24〜48小时，观察菌落数。
(3)步骤③应选择挑取涂布平板上长出的，再通过划线进一步。
(4)步骤④中，将菌种接种在培养基中，在37°C恒温培养箱中培养24h后，置于冰箱中保存。
(5)若该漆酶大量应用于环境修复，可先用石英砂对漆酶进行 (A.包埋B.共价偶联
C.吸附
D.交联)法固定，再进行工业化使用。
答案：（1)无菌水(2)玻璃刮刀倒置(3)单菌落纯化(4)斜面 4°C (5)C
7.（宁波市17年8月32T）（一）下表是用于从土壤中分离纯化细菌的培养基配方。
请回答：
（1）培养基的类型很多，按照“细菌喜▲，霉菌喜▲”的原则配制上述培养基后，一般还要调节 pH 并对培养基进行▲处理。
（2）分离纯化微生物最常使用的划线分离法中，接种环在菌液中蘸菌液▲（A．一 B．二C．三 D．四）次；若用涂布分离法，则制备细菌悬液时，一般需进行▲处理，为确保操作过程不被杂菌污染，接种必须在▲附近操作。
（3）假设培养结束后，发现培养基上菌落连成一片，可能的原因是什么？(列举一项) ▲。
答案：（1）荤素高压蒸汽灭菌（2）A 稀释酒精灯火焰（3）稀释倍数不够（第一次划线后没有灭菌接着第二次划线或培养过程中灭菌不严格受到微生物污染）。