实验1-大肠杆菌的培养与分离

菌种扩增
•摇床震荡培养12h（于LB液体培养基中）
本图来自十一学校
（四）大肠杆菌的划线分离
分离方法:划线分离法和涂布分离法
1、划线分离法无菌操作台上用接种环取菌后在固体培养基的 平板上连续划线.
不能使用脱 脂棉，否则 容易吸水， 造成污染。
一旦划破，会造成划线不均匀，难 以达到分离单菌落的目的；
2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。 如果需要，请选择合适的方法。
（1） 培养细菌用的培养基与培养皿 （2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管 （3） 实验操作者的双手
答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。
实验用具
LB固体培养基 大肠杆菌菌液（LB
液体培养基） 培养皿 接种环 酒精棉 酒精灯 镊子、火柴、记号笔
第一部分 :微生物的应用
实验1 大肠杆菌的培养与分离
实验目的:
1.进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进 行细菌培养的操作
2.进行大肠杆菌的分离,用固体平板培养基 进行细菌的划线培养
3.说明大肠杆菌培养的条件和操作要求的原 理
一、基础知识： (一)微生物 ：是一切肉眼看不见或看不清 楚的微小生物的总称．
所有接触过菌的器皿都要先高压灭菌后 再洗涤（特别是培养基）；使用后的废
弃物也要高压灭菌后再抛弃
5.如果分离的是转基因的大肠杆菌,如何保证不被普通的 大肠杆菌所污染?
转基因用的质粒不是细菌中原有的，而是经 过改造的，通常加入了抗性基因的DNA序列， 所以可用含有相应抗生素的培养基对菌体进 行培养。
【课堂练习】
病毒
病毒界
细菌 微生物包括哪五类： 放线菌
原核生物界
真菌
真菌界
原生动物 原生生物界
特点：结构都相当简单,个体多数十分微小.通常要用 光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细 胞结构.
(二)细菌的常识
1、结构
2、分裂
3、生殖
4、变异类型 5、在基因工程中的
应用
大肠杆菌
细菌的外形与大小
大肠杆菌属于杆状菌
大肠杆菌属于革兰氏阴性菌
(三)细菌的培养 ☆ 培养基 培养基（培养液）是由人工方法配制 而成的，专供微生物生长繁殖使用的混 合营养液。
1.培养基的类型
固体培养基和液体培养基、半固体培养基。
成分区别：琼脂
2.不同的微生物往往需要采用不同的 培养基配方
细菌喜荤，霉菌喜素
大肠杆菌配方：酵母提取物 0.25g 蛋白胨 0.5g Nacl 0.5g 琼脂 1g 水:50ml
答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接 种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划 线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后， 接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种 环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而 通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数 目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧 接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避 免细菌污染环境和感染操作者。
细菌的营养类型
根据细菌所利用的能源和碳源的不同 将细菌分为两大营养类型。
自养菌:
光能自养型:光合细菌
化能自养型:硝化细菌,铁细菌,硫细菌
异养菌:
腐生菌
寄生菌
大部分病原菌
大肠杆菌属于异养兼性厌氧菌
细菌的革兰氏染色
革兰氏染色法是一种用于细菌的染 色法。此法将细菌分为两类，即革兰 氏阳性菌和革兰氏阴性菌。所谓革兰 氏阳性菌就是用革兰氏染液染色后， 再用脱色液处理，细菌仍保留染色液 的颜色；革兰氏阴性菌则相反。这两 种菌的差别在于细胞壁的成分不同。
例1．关微生物营养物质的叙述中，正确的是（ D） A.是碳源的物质不可能同时是氮源 B.凡碳源都提供能量 C.除水以外的无机物只提供无机盐 D.无机氮源也能提供能量
例2．下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是 （ B）
A.防止杂菌污染
B.接种前菌种要进行灭菌
C.培养基和发酵设备都必须灭菌
D.灭菌必须在接种前
（五）大肠杆菌分离后保存
1、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成 后置于4℃冰箱保存。 2、长期保存：甘油冷冻管藏法
1.如何操作才可以尽量避免被杂菌污染?
(1)胆大心细，操作快捷。（2）注意灭菌操作 原则，灭菌彻底，降低环境污染概率。（3） 注意微生物生长条件，如PH、渗透压、温度等。 细菌喜碱，喜蛋白质，喜37度；霉菌喜酸，喜 糖，喜25-30度
实验流程
配制培养基 包器材
菌种扩增
灭菌
倒平板 接种、划线
培养 观察记录
Hale Waihona Puke Baidu
二、大肠杆菌的培养和分离实验操作
（一）培养基的配置与灭菌
取2个250ml的三角瓶中分别装入50mlLB液体培养 基和50mlLB固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上 封口膜，牛皮纸包装后高压锅灭菌15min。
LB液体培养基——细菌的扩大培养 LB固体培养基——细菌的划线分离 封口膜：既通气 又不使菌进入
（二）倒平板
灭菌后的培养基在无菌操作台上倒入4个培养皿中，倒 后立即置于水平位置上，轻轻晃动，使培养基铺满平皿底 部，待凝，使之形成平面
注意事项：
1.培养基灭菌后，需要冷却到60 ℃左右时，才能用来 倒平板
2.灭菌及消毒：无菌操作台用超净紫外灯和过滤风灭 菌；桌面及人手用酒精棉球消毒
3.操作时右手无名指和小指夹住封口膜,另外三指持三 角瓶,左手拿培养皿并打开上盖的一边,在酒精灯火焰旁 操作.
4.需要使锥形瓶的瓶口通过火焰，灼烧灭菌
5.平板冷凝后，要将平板倒置,既可以使培养基表面的 水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养 基，造成污染.
（三）大肠杆菌的扩大培养
将斜面上培养的大肠杆菌菌种接种到灭菌后的液体 培养基中,使其在37℃摇床培养12小时。
注意事项: 1.火焰旁从斜面上用接种环取菌; 2.取菌前接种环要用酒精灯灼烧 灭菌,冷却后方能取菌; 3.取菌后封口膜和棉塞复原.
3.进行恒温培养时为什么要将培养皿倒置?
恒温培养时，培养基中的水分会以水蒸气 的形式蒸发，倒放培养皿则会使水蒸气凝 结成水滴留在盖上；如果正放，则水分形 成的水滴会落入培养基表面并扩散开。如 果培养皿中已形成菌落，则会导致菌随水 扩散，很难再分成单菌落，达不到分离目 的。
4.实验完成后,接种过细菌的器皿应如何处理?
3.常用的消毒与灭菌的方法
消毒的方法：
1、100℃煮沸5-6min 2、巴氏消毒法：70-75 ℃下煮30min或 80 ℃ 下煮15min 3、用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒 4、氯气消毒水源 5、紫外线消毒 ……
灭菌的方法：
1、灼烧灭菌 2、干热灭菌：160-170 ℃下加热1-2h。
菌落是鉴定菌种的重要依据。
液体培养基：
表面生长
均匀混浊生长
沉淀生长
☆ 无菌技术 1.无菌技术的概念
无菌操作泛指在培养微生物的操作中， 所有防止杂菌污染的方法。
成功地培养微生物的关键。
2.消毒与灭菌的概念及两者的区别
（１）消毒定义：
是指杀灭大部分病原微生物的方法。
（2）灭菌的定义：
是指杀灭或清除环境中一切微生物（包括芽胞、孢子） 的方法
2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后 再进行划线？
答：以免接种环温度太高，杀死菌种。
3.在作第二次以及其后的划线操作时，为 什么总是从上一次划线的末端开始划线？
答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起 始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能 使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少， 最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
例3．右表是某微生物培 编号 养基成分，请据此回答：
（1）右表培养基可培养 ①
的微生物类型
②
是 自养型微生。物
（2）若不慎将过量
③
NaCl加入培养基中。
④
如不想浪费此培养基， ⑤
可再加入含碳有机.物
⑥
⑦
成分
粉状硫
（NH4） 2SO4
K2HPO4 MgSO4 FeSO4 CaCl2
H2O
含量 10g
3、高压蒸气灭菌：100kPa、121 ℃下维持15-30min.
灭菌的方法： 1、灼烧灭菌
2、干热灭菌： 160-170 ℃下加热 1-2h。
3、高压蒸气灭菌： 100kPa、121 ℃下 维持15-30min.
1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他 外来微生物污染外，还有什么目的？
答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。
分离后,一个菌体 便会形成一个菌 落,这是消除污染 杂菌的通用方法, 也是用于筛选高 表达量菌株的最 简便方法之一
2、涂布分离法:是指将培养的菌液稀释一定的倍数,然后取一定量 稀释液加在固体培养基上,用玻璃刮刀涂布在培养基平面上.
划线分离法和涂布分离法哪个更好呢？
划线分离：方法简单，但单菌落较难分开。 涂布分离：单菌落更易分开，但操作复杂。
二是存留在划破处的单个细胞无法 形成规矩的菌落，菌落会沿着划破 处生长，会形成一个条状的菌落。
（四）大肠杆菌的划线分离
1、划线分离法
注意事项: 1.接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划 线多次. 2.划线首尾不能相接 3.划线后,培养皿倒置培养12~24h
1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前 都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需 要灼烧接种环吗？为什么？
3.不管哪种培养基，一般都含有水、碳 源、和氮源、 无机盐、生长因子等营养 物质，另外还需要满足微生物生长对 pH 、氧气、渗透压的要求．
4.培养基的用途
液体培养基：扩增细菌、工业生产
固体培养基：纯化（分离），鉴定、保 藏菌种
☆ 菌落
单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖 时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定 形态结构的子细胞群体，叫做菌落。
0.4g
4.0g 9.25g 0.5g 0.5g 100ml
（3）若除去成分②，加入（CH2O）， 该培养基可用于培养 固氮微生物。 （4）表中营养成分共有 3 类。 （5）不论何种培养基，在各种成分都 溶化后分装前，要进行的是 调整pH。 （6）右表中各成分重量确定的原则 是 依微生物的生长需要确定 。 （7）若右表培养基用于菌种鉴定，应 该增加的成分 琼脂（或凝固剂）。
2.在培养后如何判断是否有杂菌污染?
（1）菌落的形态看，是否湿润，透明，粘稠，颜色 等。是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。
（2）显微镜观察其形态、大小、看是否有菌丝、孢 子、芽孢。是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键 指标。
（3）上述方法较难区别同类的不同物种，需借助化 学和进一步的形态观察，如用革兰氏染色法等。