5.生物催化的介质系统(Xu)

● 逆水解反应
◆ Βιβλιοθήκη Baidu解反应
4． 可防止由水引起的副反应
有机介质中使用酶的不同方式
(a) 水与水溶性溶剂的均相混合物 (b) 水-有机溶剂两相系统 (c) 悬浮于溶剂中的酶粉 (d) 悬浮于溶剂中的载体固定化酶 (e) 酶增溶于由水、有机溶剂和表 面活性剂组成的微乳状液 (f) 可溶于有机溶剂的共价修饰酶
2. 可调控酶的底物专一性
硝苯地平
3． 可改变反应平衡的移动方向
OH HO HO 1 O OH OH + HO NO2 Almond glucosidase HO HO 6 OH O O OH 19 + H2O NO2
100 80
Conv. (%)
60 40 20 0 0 48 96 Time (h) 144
49.6 10.6
30.6 19.8 73.6 18.8
49.6 0.9
2.7 1.8 11.7 1.7
2.6 超临界流体系统
除了亲脂性有机溶剂外，超临界流体 (supercritical fluids)，如二氧化碳、 氟里昂(CF3H)，烷烃类(甲烷、乙烯、丙 烷)或无机化合物(SF6，N2O)等，都可以 作为酶催化亲脂性底物的溶剂，酶在这 些溶剂中就像在亲脂性有机溶剂中一样 稳定。 超临界流体的粘度介于气体与液体之间， 其扩散性比一般溶剂高1-2个数量级。超 临界气体在临界点附近的温度或压力有 一点微小的变化都会导致底物和产物溶 解度的极大变化，因而很容易调控超临 界流体中酶催化反应的特性，如反应速 率和选择性。
一般而言，酶在微水有机溶剂体系中稳定性较好，但催化活力 要比水相中低得多，部分原因是因为酶在有机相不溶，许多酶 分子聚结成团，影响了颗粒内部酶分子的催化效率。因此，如 何保持固态酶粉在有机相中的高度分散状态，成为激活有机相 酶活力的一项重要课题。
酶制剂
酶用量 (mg/ml)
蛋白含量 初速度 (μg protein/mg) (μM/min)
固相酶在结构上仍是柔性的，酶分子内部的柔性足以保证酶和 底物结合时酶能产生微小的构象变化，形成酶和底物结合的中 间复合体。酶分子的比表面积约为(1～3)×106 m2· -1，与活 kg 性炭相当，酶分子体积的1/3～2/3是空的，充满了溶剂，因此 足够的搅拌将保证底物能与酶表面或内部的活性中心结合，并 起催化反应。
超临界流体对多数酶都能适用，酶催化的酯化、转酯、醇 解、水解、羟化和脱氢等反应都可在此体系中进行，但研究 得最多的是水解酶的催化反应。这种溶剂体系最大的优点是 无毒、低粘度、产物易于分离。
该体系的缺点是需要有能耐受几十个兆帕的高压容器，并 且减压时易于使酶失活。此外，有些超临界流体如二氧化碳 可能会与酶分子表面的活泼基团发生反应而引起酶活性的丧 失
可防止由水引起的副反应 可扩大反应pH值的适应性 酶易于实现固定化 酶和产物易于回收 可避免微生物污染
1． 可提高酶的热稳定性
溶剂3 溶剂2 溶剂1
Zaks A, Klibanov AM. Enzymatic catalysis in organic media at 100 oC. Science, 224: 1249 (1984)
(B)
in biphaisc system (150 mM) in aqueous system (10 mM)
80 60 40 20 0 0 10
-1
in biphasic system (50 mM)
-1
20
30
Reaction time (h)
2.4 乳状液或微乳液系统
反相胶束体系能够较好地模拟酶 的天然状态，在逆胶束系统中，大 多数酶能够保持催化活性和稳定性， 甚至表现出“超活性”(super activity)。
酶可以在含有各种有机溶剂和微量水分的非水介质系统中发 挥催化作用，并且所表现出的催化性能(如活力、选择性、稳定 性)与在常规水溶液介质中的性能截然不同，从而极大地扩展了 生物催化剂的应用范围。
介质工程
在设计、优化工业生物催化的反应介质系统时，我们不应 简单地从一个极端(100%水)走向另一个极端(100%有机溶剂)， 必须根据反应底物/产物和生物催化剂的特性，具体情况具体 分析。 通过非水相介质系统的多样性变化，也可以在很大程度上 调控酶的催化性能，达到“蛋白质工程”所欲达到的类似效 果，因此才提出了“溶剂工程”、“介质工程”或“微环境 工程”等概念。
自1974年Wells发现磷脂酶A2在 卵磷脂-乙醚-水逆胶束系统中具有 催化卵磷脂水解活性以来，胶束酶 学(micelle enzymology)的研究和 应用在国内外引起广泛的关注。
逆胶束系统是含有表面活性剂与少量水的有机溶剂系统。表 面活性剂分子由疏水性尾部和亲水性头部两部分组成，在含 水有机溶剂中，它们的疏水性基团与有机溶剂接触，而亲水 性头部形成极性内核，从而组成许多个逆胶束，水分子聚集 在逆胶束内核中形成“微水池”，里面容纳了酶分子，这样 酶被限制在含水的微环境中，而底物和产物可以自由进出胶 束。
非水相生物催化技术
长期以来,人们一直错误地认为酶只能在水溶液中使用; 若与 有机溶剂接触，就会变性失活。 由于大多数有机化合物在水中很难溶解，有些还不稳定，因 此化学合成大多使用有机溶剂作为反应介质，从而忽略了对生 物催化剂的开发和应用。 1984年， A.M.Klibanov在Science上发表“Enzymatic Catalysis in Organic Media at 100℃” ，使原来认为生物催化必 须在水溶液中进行的酶学概念发生了革命性的变化。
Protein Engineering Solvent (Medium) Engineering Microenvironment Engineering
有机介质中生物催化的优点
有利于疏水性底物的反应
可提高酶的热稳定性
能催化水中不能进行的反应
可改变反应平衡移动方向
可调控酶的底物专一性
产物
天然化合物 or 非天然化合物
许多天然或合成的有机化合物，其生物转化客观上 要求在非水介质中进行！
构象工程 (Conformational Engineering)
酶在溶液中的空间构象是柔性 可变的：环境结构功能！ 通过改变反应环境(溶液性质) 即有可能调节酶的空间构象, 优化强化酶的催化性能。
2.3 水-有机溶剂两相系统
水-有机溶剂两相系统已成功地用于强疏水性底物(如甾体、 脂类、烯烃类和环氧化合物)的生物转化。 例如，在两相体系中已成功地实现微生物催化的烯烃不对称 环氧化：珊瑚诺卡氏菌(Nocardia corallina)生物转化烯烃 产生的环氧化物被及时转移到有机相中，使得产物环氧化物 对微生物的毒性降低到最低程度。 巨大芽孢杆菌环氧水解酶催化的缩水甘油苯基醚的对映选择 性开环水解反应也适合于在两相系统中进行，由于不稳定的 环氧底物大部分溶解在异辛烷中，因此不但可以减少其自发 水解，而且可以减轻其对酶的抑制，从而便于大幅度增加有 机相中底物和产物的浓度，有助于提高生物催化的效率
乳状液系统
对映体选择率 (E值)
1000 100 10 1 0 5 10 [Tween-80] (%,w/v)
纯酶 粗酶
在脂肪酶催化拆分酮 基布洛芬酯的水解反 应中,使用添加剂，可 使脂肪酶活性和选择 性提高1-2个数量级！
J Mol Catal B: Enzymatic 2000
2.5 微水有机溶剂单相系统
2.3 水-有机溶剂两相系统
水-有机溶剂两相系统是指由水相和非极性有机溶剂相 (烃、醚、酯等)组成的非均相反应系统; 两相的体积比 可以在很宽的范围内变动。
底物和产物则主要溶于有机相中; 酶溶解于水相中， 这样可使酶与有机溶剂在空间上相分离，以保证酶处在 有利的水环境中，而不直接与有机溶剂相接触。
2.7 离子液体介质系统
在最近的10年中，离子液体(Ionic Liquids, ILs)作为一种 新型的反应介质，被用于各种类型的反应，并常常产生显著 的效果，从而引起人们的广泛注意。
逆胶束系统优点
①组成的灵活性：大量不同类型的表面活性剂、有机溶剂甚至是不同极性的 物质，都可用于构建适宜于酶反应的逆胶束系统； ②热力学稳定性和光学透明性：逆胶束是自发形成的，因而不需要机械混合， 有利于规模放大； ③逆胶束有非常高的比界面积：远高于有机溶剂-水两相系统，使底物和产物 在相间的转移变得极为有利； ④逆胶束的相特性随温度而变化：这一特性可以简化产物和酶的分离纯化。 例如马肝醇脱氢酶在AOT或C12E5逆胶束系统中催化4-甲基环己酮还原生成4甲基环己醇，反应后通过温度诱导可使产物回收到有机相中，而酶、辅酶在 水相中，并可多次循环反复使用，每一次循环酶活性损失很小。 逆胶束中的酶催化反应可用于油脂水解、辅酶再生、消旋体拆分、肽和氨基 酸合成和高分子材料合成。色氨酸合成可采用色氨酸酶催化吲哚和丝氨酸缩 合而成，由于吲哚在水中溶解度很低、且对酶有抑制作用。Eggers运用BrijAliguat 336-环己醇为逆相胶束系统，建立了膜反应器中逆胶束酶法合成色 氨酸的生产工艺。
非水介质系统 100%有机溶剂
均相的有机溶剂体系是指用与水不互溶的有机溶剂取代所有 的溶剂水(＞98%)，形成固相酶分散在有机溶剂中的非均相反 应体系。
处于这种体系中的酶，其表面必须有残余的结构水，才能保 证其催化活性。一般有机溶剂中含有小于2%的微量水。
常用的与水不互溶的有机溶剂有烃类、醚、芳香族化合物、 卤代烃等，它们的疏水指数(logP)较大。
8 4 0
pH 4.0 pH 2.2
活性提高 选择性提高
对映选择率
80
12
2.2 均相水-有机溶剂系统
增加亲脂性底物溶解度的一个最简单办法是向反应混合 物中加入与水互溶的有机溶剂，通常被称为有机助溶剂 (organic cosolvent)。 常用的助溶剂有二甲亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、 四氢呋喃(THF)、二氧六环(dioxane)、丙酮和低级醇等。 一般来讲，该系统中与水互溶有机溶剂的量可达总体积 的10%-20%(体积分数)，有的甚至高达90%.
两相体系中苯甲硫醚的不对称氧化
胃溃疡 药物
MeO N N H O S Me OMe Me N
Esomeprazole
pO2
pH
Air
pO2
pH
有机相
(S)-PMSO
Air
O2
PMS
PMS
SMO
PMSO
O2
O2
O2
单一水相体系
水-有机两相体系
100
Specific production rate (μmol h g wet cell)
2.典型的生物催化介质系统
生物催化介质系统种类
① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧ ⑨ ⑩ 水或缓冲溶液系统； 水-有机溶剂单相系统 水-有机溶剂两相系统; 乳状液或微乳液系统 微水有机溶剂单相系统; 超临界流体系统 离子液体介质系统 无溶剂反应系统 双水相系统; 浊点系统
2.1 单一的水或缓冲溶液系统
生物催化工程
讲课教师: 许建和、郁惠蕾 等
联系方式: jianhexu@ecust.edu.cn
第五章 生物催化的介质系统
2012.10.16
1.生物催化的介质系统概述
生物催化反应系统的组成
系统构成三要素：反应物、催化剂和反应介质
生物催化剂
底物
天然化合物 or 非天然化合物
生物催化反应
生理条件 or 非生理条件
比活 (μM.min-1.μg-1)
硬脂酸包被酶
DGG包被酶
2.0
2.0
0.96
0.79
353.0
294.4
91.8
93.2
硅藻土吸附酶
NaCl 冻干酶 K2SO4 冻干酶 KCl 冻干酶 微晶酶 自由酶
2.0 10.0
10.0 10.0 4.0 2.0
0.25 0.11
0.11 0.11 0.16 2.75
由于酶的构象与其离子化状态密切相关，因此 酶的体外实验研究通常在一定浓度的缓冲溶液 体系中进行，这样可保证酶在最佳pH附近发挥 最大的活力。
Lipase OF催化酮洛芬氯乙酯水解
O CH3 COOCH2CH2Cl
O
CH3 COOH
O
CH3 COOCH2CH2Cl
+
RS
S
R
100
相对活性(%)
60 40 20 0 1 3 5 7 pH 9 11