显微镜直接计数和平板菌落计数
微生物计数方法
微生物计数方法微生物计数是许多领域中重要的分析方法，包括环境科学、食品科学、医学和生物技术。
正确的计数方法能够准确地估计样品中微生物的数量，对于研究和工业应用都是至关重要的。
下面将介绍几种常用的微生物计数方法。
血细胞计数器法是一种使用显微镜进行微生物计数的经典方法。
该方法使用血细胞计数器对微生物样品进行计数，每个格子中的微生物数量被计算出来，然后进行统计分析。
此方法的优点是准确性高，但是耗时长，操作繁琐，需要熟练的操作人员。
流式细胞术是一种使用流式细胞仪进行微生物计数的现代方法。
该方法将微生物样品通过流式细胞仪进行计数和分析，能够快速准确地测定样品中的微生物数量和种类。
此方法的优点是速度快、精度高、可自动化操作，但是设备成本高，维护成本也较高。
自动细胞计数器法是一种使用自动细胞计数仪进行微生物计数的现代方法。
该方法使用自动细胞计数仪对微生物样品进行计数，能够快速准确地测定样品中的微生物数量和种类。
此方法的优点是速度快、精度高、可自动化操作，而且设备相对较为经济实惠，易于推广应用。
平板计数法是一种常用的细菌计数方法。
该方法将微生物样品涂布在平板上，培养后计算菌落数量，从而得出样品中的细菌数量。
此方法的优点是简单易行、成本低，但是结果受培养条件和操作者技能水平的影响，准确性相对较低。
不同的微生物计数方法具有不同的优缺点，应根据具体的研究目标和实际情况选择合适的方法。
为了提高计数的准确性，需要注意样品的采集、保存、制备和处理等方面的问题，确保样品的质量和代表性。
微生物的分离与计数是微生物学中重要的实验技术之一。
通过分离和计数，我们可以获得微生物群体的相关信息，如种类、数量、生长状况等，对于微生物学研究、应用以及工业生产等领域都具有重要的意义。
选择合适的培养基：根据目标微生物的种类和生长需求，选择适合的培养基。
培养基应具有营养丰富、透明度高、易于观察等特点。
制备样品：从目标环境中采集样品，如土壤、水、食品等，并进行预处理，以去除不需要的杂质和大型生物。
显微镜的直接计数和细菌大小测定-精选文档
四、操作方法
(一)酵母菌大小测定的操作方法 1.测微尺的构造和使用方法 (1)目镜测微尺的构造 目镜测微尺是一块圆形玻片， 其中央刻有精确的刻度，通常是将5mm划分为50 格，实际每格等于100μm。刻度的大小是随使用 的接目镜和接物镜的放大倍数而改变，用前必须用 物镜测微尺来标定，如图。 (2)物镜测微尺的构造 物镜测微尺为一块特制的 载玻片，其中央有一小圆圈。圆圈内刻有分度，将 长1mm的直线等分为100小格，每小格等于10μm， 如图 。
五、实验报告及思考题
1、微生物大小测定实验结果
（1）将目镜测微尺校正结果填入下表：
接物镜 接物镜倍数 目镜测微尺格 镜台测微尺格
数
数
低倍镜
高倍镜
油镜
目镜测微尺每格代表 的长度(μm)
接目镜的放大倍数________
（2） 酵母细胞大小的测量结果：
微生物 名称
目镜测微尺每 格代表的长度
/μm
宽
目镜测微 尺格数
2.目镜测微尺的标定
(1)取下接目镜，旋下目镜上的目透镜，将目镜测微 尺放人接目镜的中隔板上，使有刻度的一面朝下， 再旋上目透镜，并装入镜筒内。 (2)将物镜测微尺置于显微镜的载物台上，使有刻度 的一面朝上，同观察标本一样，使具有刻度的小圆 圈位于视野中央。 (3)先用低倍镜观察，对准焦距，待看清物镜测微尺 的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺的刻度与物镜 测微尺的刻度相平行，并使两尺的左边第一条线相 重合，再向右寻找两尺的另外一条重合线。如图 (4)记录二条重合线间的目镜测微尺的格数和物镜测 微尺的格数。
4.酵母菌大小的测定
(1)取下镜台测微尺，换上酵母菌水浸制片。
(2)测量菌体的长度和宽度各占目镜测微尺 几格，然后换算出菌体的实际长度。
细菌计数方法实验报告
一、实验目的1. 掌握细菌计数的基本原理和方法。
2. 了解不同细菌计数方法的优缺点。
3. 培养实验操作技能，提高实验数据处理和分析能力。
二、实验原理细菌计数是微生物学研究中的一项基本技能，常用的细菌计数方法有直接计数法、活菌计数法和间接计数法等。
本实验主要介绍平板菌落计数法（CFU法）和显微镜直接计数法。
1. 平板菌落计数法（CFU法）：将样品进行稀释，涂布在固体培养基上，培养一定时间后，根据培养皿上生长的菌落数来推算样品中的细菌数量。
2. 显微镜直接计数法：将样品进行稀释，用计数板或计数仪直接计数，根据计数室内的细菌数来推算样品中的细菌数量。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：大肠杆菌菌液、牛肉膏蛋白胨培养基、生理盐水、计数板、显微镜、移液器、培养箱等。
2. 实验仪器：培养皿、移液器、酒精灯、镊子、无菌操作台、培养箱、显微镜等。
四、实验步骤1. 平板菌落计数法（CFU法）：（1）将牛肉膏蛋白胨培养基倒入培养皿，制成平板。
（2）用移液器吸取适量的大肠杆菌菌液，进行一系列的倍比稀释。
（3）用无菌镊子取适量稀释液，涂布在平板上。
（4）将平板倒置放入培养箱，培养一定时间。
（5）计算平板上生长的菌落数，根据稀释倍数计算样品中的细菌数量。
2. 显微镜直接计数法：（1）将牛肉膏蛋白胨培养基倒入计数板，制成涂片。
（2）用移液器吸取适量的大肠杆菌菌液，进行一系列的倍比稀释。
（3）用移液器吸取适量稀释液，滴加在计数板的计数室上。
（4）将计数板置于显微镜下，观察计数室内的细菌数。
（5）根据计数室内的细菌数和稀释倍数计算样品中的细菌数量。
五、实验结果与分析1. 平板菌落计数法（CFU法）：（1）稀释倍数：10^-4（2）菌落数：30（3）样品中的细菌数量：30 × 10^4 = 3 × 10^52. 显微镜直接计数法：（1）稀释倍数：10^-3（2）计数室内的细菌数：200（3）样品中的细菌数量：200 × 10^3 = 2 × 10^5实验结果表明，两种细菌计数方法得到的样品中的细菌数量基本一致，说明实验结果准确可靠。
几种常用的细菌计数方法
几种常用的细菌计数方法常用的细菌计数方法主要有显微镜计数法、平板计数法、膜过滤法和浑浊度法等。
下面将逐一介绍这些方法。
显微镜计数法是最基本的细菌计数方法之一、将细菌培养液取少量放在显微镜载玻片上，用显微镜观察并计数细菌个数。
这种方法需要操作技巧熟练，适用于较稀疏的细菌培养液，但不适用于高密度的细菌培养液，并且仅能得到一个粗略的细菌数量。
平板计数法是一种较为常用的细菌计数方法。
将稀释后的细菌培养液均匀涂在含有培养基的平板上，经过一段时间的培养后，可以通过数独落在平板上形成的菌落数量来估计初始细菌数量。
通常将膨胀菌落数乘以相应的稀释倍数从而得到细菌的数量。
平板计数法的优点是简单易行，适用于大量细菌的计数，但该方法只适用于能够在固体培养基上生长的细菌。
膜过滤法是一种通过滤除细菌并计数膜上细菌数量的方法。
将细菌培养液通过微孔膜过滤器，在膜上滤除细菌，然后将膜放在富含营养物的培养基上进行培养，形成菌落后进行计数。
与平板计数法相比，膜过滤法更适用于含有颗粒物的液体或空气中的细菌计数。
膜过滤法的优点是操作相对简单，适用于含有较多颗粒物或固体物质的液体的细菌计数，但该方法仅适用于能够通过过滤的培养液。
浑浊度法是一种通过测量培养液的浑浊度来估计细菌数量的方法。
利用光密度计或比色计测量细菌培养液的吸光度或浑浊度，并通过细菌密度与浑浊度之间的关系来计算细菌数量。
这种方法不需要进行涂片或过滤步骤，适用于细菌数量较多的情况。
然而，浑浊度法有一定的局限性，因为细菌的大小、形状和组成可能对浑浊度产生影响，而且需要事先建立浑浊度和细菌数量间的校准曲线。
除了以上介绍的方法，还有一些其他的细菌计数方法，如Flow cytometry（流式细胞仪）、Most probable number（最可能数）等，这些方法各有特点，可以根据实际需要选择合适的方法进行细菌计数。
细菌计数方法的选择应根据实验的目的、样品性质和操作条件等因素来确定。
微生物实验思考题参考答案及知识要点
微生物实验思考题参考答案及知识要点一．酵母菌形态观察及死活细胞鉴别1.吕氏碱性美蓝染液浓度和作用时间的不同对酵母菌死细胞数量有何影响?是分析其原因。
美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。
用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变成为无色的还原型。
因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色，借此即可对酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别。
美蓝浓度高了，代谢不太活跃的活细胞也会被染色，从而使观察到的死细胞较多，活细胞较少；反之，则代谢微弱的细胞也能还原美蓝，不被染色，从而使观察到的死细胞较少，活细胞较多。
二. 细菌的简单染色和革兰氏染色1. 革兰氏染色中那一步是关键?为什么？你是如何操作的？革兰氏染色的关键步骤是：乙醇脱色（是脱色时间）。
如果脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阳性菌。
脱色时间的长短还受涂片的厚薄，脱色是玻片晃动的快慢及乙醇用量的多少等因素的影响，难以严格规定（脱色是应当控制速度，脱色时间一般为20—30s）。
2. 固定的目的之一是杀死菌体，这与自然死亡的菌体有何不同？自然死亡的菌体本身已经部分自溶，结构已经改变。
固定杀死细菌时细菌结构是保持死亡时的状态的。
3. 不经复染这一步能否区分革兰氏阳性菌和阴性菌？能。
在酒精脱色后，不被酒精脱色而保留紫色者为革兰氏阳性菌（G＋），被酒精脱色为革兰氏阴性菌。
最后一步用番红染液复染，是为了让结果更清楚。
4. 涂片为什么要固定，固定适应注意什么问题？a 杀死细菌并使菌体黏附与玻片上；b 增加其对染料的亲和力。
固定时应注意：手持玻片，菌膜朝上，在微火过3次（手指触摸玻片反面，不烫手为宜），固定时应尽可能维持细胞原有形态，防止细胞膨胀或收缩。
三. 霉菌、放线菌的形态观察1. 镜检时，如何区分基内菌丝与气生菌丝？一般气生菌丝颜色较深，直生或分枝丝状，比基内菌丝粗；而基内菌丝色浅、发亮，可看到横隔膜，继而断裂成球状或杆状小体。
实验技术十显微镜直接计数法
一、目的要求：
1. 理解血球计数板的计数原理 2. 学会并掌握使用血球计数板进行准确计数 3. 了解其在生产实践中的应用
生产实践中测定微生物生长繁殖的方法
测生长
间接法：平板菌落计数法 直接法 ：显微镜直接计数
二、基本原理
利用血球计数器在显微镜下直接计数， 这是生产实践中常用的一种微生物计数 方法。
1000mm3（1mL）相当于多少个计数室的体积？
设菌悬液稀释倍数为B
则：原菌液含菌数 个/毫升=每小格平均菌数 ×4×106×B
若数中方格 则：
原菌液含菌数 个/毫升=每中方格平均菌数 ×25（16）× 104×B
优点： 方便、迅速、直接 缺点： 不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细胞浓度； 个体较小的细菌在显微镜下难以观察；
计繁殖数
利用血球计数板，在显微镜下计算一定 容积里样品中Βιβλιοθήκη 生物的数量。血球计数板的构造
25中格× 16小格计数室 16中格×25小格计数室
计数室边长为1mm，则计数室的面积为l mm2高 度为0.1mm，所以每个计数室的体积为0.1mm3，
1mL=1cm3=1000mm3
1mL原菌液含菌数？
常用的微生物分离纯化方法[整理版]
![常用的微生物分离纯化方法[整理版]](https://img.taocdn.com/s3/m/ec2e55d38ad63186bceb19e8b8f67c1cfbd6ee53.png)
(一) 常用的微生物分离纯化方法菌种分离纯化的方法有：稀释混合倒平板法、稀释涂布平板法、平板划线分离法、稀释摇管法、液体培养基分离法、单细胞分离法、选择培养分离法等。
其中前三种方法最为常用,不需要特殊的仪器设备, 分离纯化效果好, 现分别简述如下1. 稀释混合倒平板法平板是指经熔化的固体培养基倒入无菌培养皿中, 冷却凝固而成的盛有固体培养基的平皿。
该法是先将待分离的含菌样品, 用无菌生理盐水作一系列的稀释(常用十倍稀释法, 稀释倍数要适当), 然后分别取不同稀释液少许(0.5-1.0ml)于无菌培养皿中, 倾入已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基, 迅速旋摇, 充分混匀。
待琼脂凝固后, 即成为可能含菌的琼脂平板。
于恒温箱中倒置培养一定时间后, 在琼脂平板表面或培养基中即可出现分散的单个菌落。
每个菌落可能是由一个细胞繁殖形成的。
挑取单一个菌落, 一般再重复该法1-2次, 结合显微镜检测个体形态特征,便可得到真正的纯培养物。
若样品稀释时能充分混匀,取样量和稀释倍数准确,则该法还可用于活菌数测定。
图4 混合倒平板操作法示意图图5 涂布平板操作法示意图2. 稀释涂布平板法采用上述稀释混合倒平板法有两个缺点，一是会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间,缺乏溶氧而生长受影响,形成的菌落微小难于挑取；一是在倾入熔化琼脂培养基时，若温度控制过高,易烫死某些热敏感菌，过低则会引起琼脂太快凝固, 不能充分混匀。
在微生物学研究中, 更常用的纯种分离方法是稀释涂布平板法。
该法是将已熔化并冷却至约50℃(减少冷凝水)的琼脂培养基, 先倒入无菌培养皿中, 制成无菌平板。
待充分冷却凝固后,将一定量(约0.1 ml)的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面, 再用三角形无菌玻璃涂棒涂布,使菌液均匀分散在整个平板表面, 倒置温箱培养后挑取单个菌落。
另一种简单快速有效的涂布平板法, 可省去含菌样品悬液的稀释, 直接吸取经振荡分散的样品悬浮液l滴加入1号琼脂平板上, 用一支三角形无菌玻璃涂棒均匀涂布, 用此涂棒再连续涂布2号、3号、4号平板(连续涂布起逐渐稀释作用，涂布平板数视样品浓度而定), 翻转此涂棒再涂布5号、6号平板, 经适温倒置培养后挑取单个菌落。
统计菌落数目的方法
统计菌落数目的方法一、引言菌落是微生物繁殖形成的可见现象，可以用来估计菌落的数量。
统计菌落数目是微生物学中的重要研究方法之一。
本文将介绍统计菌落数目的方法及其应用场景。
二、直接计数法直接计数法是最简单、直接的方法之一，适用于较少数量的微生物菌落计数。
该方法通常使用显微镜和计数盘来进行菌落计数。
具体步骤如下：1.准备好培养基，并将待测样品在培养基上均匀涂布。
2.将培养基放置在适宜的环境中，培养一段时间，使菌落生长。
3.使用显微镜观察培养基，使用计数盘对菌落进行计数。
4.根据计数盘上的单位格数和菌落的平均大小计算总菌落数量。
三、稀释平板法稀释平板法适用于菌落数量较多的情况。
该方法通过连续稀释样品，将其均匀涂布在培养基上，然后计算每个稀释液中的菌落数量。
具体步骤如下：1.准备一系列含有不同菌落数量的稀释液。
2.取一定体积的稀释液，将其均匀涂布在培养基上。
3.培养一段时间后，使用计数盘对菌落进行计数。
4.根据每个稀释液中的菌落数量，绘制菌落数量与稀释倍数的曲线图。
5.根据曲线图中最合适的稀释倍数，计算原始样品中的菌落数量。
四、膜过滤法膜过滤法适用于水样和空气样品等液态或气态样品。
该方法通过将样品过滤，将菌落过滤在膜上，再将膜转移到培养基上进行培养和计数。
具体步骤如下：1.准备适用的膜过滤器，并将其放置在过滤装置中。
2.将待测样品通过过滤装置过滤，将菌落过滤在膜上。
3.将膜转移到培养基上，进行培养。
4.培养一段时间后，使用计数盘对菌落进行计数。
5.根据计数盘上的单位格数和菌落的平均大小计算总菌落数量。
五、应用场景统计菌落数目的方法在许多领域都有广泛应用，包括：1.食品卫生检验：通过统计菌落数量可以评估食品的卫生状况，判断是否符合相关标准。
2.环境监测：统计空气、水和土壤中的菌落数量，可以评估环境的卫生状况，指导环境治理工作。
3.医疗卫生：统计医院空气、器械和手术室中的菌落数量，可以评估感染风险，采取相应的防控措施。
微生物实验显微镜直接计数法
3.计数时，格线上的菌体只数上方和右边线上的；
4.如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，作
为两个菌体计算；
5.清洗计数板时切勿用手或硬物刷洗。在水龙头上用
水柱清洗，直到洗净为止。 6.一个样品要从两个计数室中计得的平均值来计算。
特别注意
血球计数板均有编号，一人一 个，务必小心使用，若损坏，需 原价赔偿或赔偿原物！
25×16型：25个中方格，每个中方格分16个小格。
计数室
（3）计数和计算方法
我们采用的是25×16的，计数时查5个中方格的总
菌数。如图：
5个方格的总菌数
计算：1个计数室的总菌数=A/5×25×B
稀释倍数
1g（ml）样品中的总菌数=A/5×25×10×1000×B
=50,000A×B个
计数室均能充满菌液。注意不可有气泡产生。
将酵母菌稀释液由盖玻片边缘点一小滴（不宜过多），
4.显微镜计数 静置几分钟，将计数板放在显微镜下，先用低
倍镜找到计数室，再换成高倍镜进行计数。
5.清洗血球计数板
计数完毕，将计数板在水龙头下冲洗干净后自
行晾干，镜检观察每小格内无残留物为止。
五、注意事项
1.加样前先摇匀菌液，计数室中不可有气泡产生；
三、实验材料
1.菌种：酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）悬液(已
稀释100倍)
2.器具：显微镜、血球计数板、吸管、盖玻片。
四、实验步骤
1.检查计数板
检查计数板是否有破损。
2.镜检计数室
在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物， 则需清洗后才能进行计数。
3.加样品
在清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用细口滴管 让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，一般
第6章微生物的生长繁殖习题[整理]
![第6章微生物的生长繁殖习题[整理]](https://img.taocdn.com/s3/m/ee2fba39dc36a32d7375a417866fb84ae45cc3f9.png)
第六章微生物的生长繁殖及其控制习题填空题：1．一条典型的生长曲线至少可分为迟缓期、对数生长期、稳定生长期和衰亡期 4个生长时期。
2．测定微生物的生长量常用的方法有单细胞计数、细胞物质的重量和代谢活性。
而测定微生物数量变化常用的方法有培养平板计数法、膜过滤法、液体稀释法和显微镜直接计数；以生物量为指标来测定微生物生长的方法有比浊法、重量法和生理指标法。
3．获得细菌同步生长的方法主要有(1) 机械法和(2) 环境条件控制法，其中(1)中常用的有离心法、过滤分离法和硝酸纤维素滤膜法。
4．控制连续培养的方法有恒浊法和恒化法。
5．影响微生物生长的主要因素有营养物质、水活性、温度、pH和氧等。
6．对玻璃器皿、金属用具等物品可用高压蒸汽灭菌法或干热灭菌法进行灭菌；而对牛奶或其他液态食品一般采用超高温灭菌灭菌，其温度为135-150~C，时间为2—6s。
7．通常，细菌最适pH的范围为6．5—7．5，酵母菌的最适pH范围为4．5～5．5，霉菌的最适pH 范围4．5—5．5。
8．杀灭或抑制微生物的物理因素有温度、辐射作用、过滤、渗透压、干燥和超声波等。
9．抗生素的作用机制有抑制细菌细胞壁合成、破坏细胞质膜、作用于呼吸链以干扰氧化磷酸化和抑制蛋白质和核酸合成。
10．抗代谢药物中磺胺类是由于与对氨基苯甲酸相似，从而竞争性地与二氢叶酸合成酶结合，使其不能合成叶酸选择题：1．以下哪个特征表示二分裂? ( (3) )(1)产生子细胞大小不规则 (2)隔膜形成后染色体才复制(3)子细胞含有基本等量的细胞成分 (4)新细胞的细胞壁都是新合成的2．代时为0.5h的细菌由103个增加到109个时需要多长时间?( (3) )(1)40h (2)20h (3)10h (4)3h3．某细菌2h中繁殖了5代，该菌的代时是( (2) )。
(1)15 min (2)24min (3)30min (4)45min4．代时是指( (4) )。
(1)培养物从接种到开始生长所需要的时间 (2)从对数期结束到稳定期开始的间隔时间 (3)培养物生长的时间(4)细胞分裂繁殖一代所需要的时间5．如果将处于对数期的细菌移至相同组分的新鲜培养基中，该批培养物将处于哪个生长期?( (4) )(1)死亡期 (2)稳定期 (3)延迟期 (4)对数期6．细菌细胞进入稳定期是由于：①细胞已为快速生长作好了准备；②代谢产生的毒性物质发生了积累；③能源已耗尽；④细胞已衰老且衰老细胞停止分裂；⑤在重新开始生长前需要合成新的蛋白质( (2) )。
计算菌落数的方法
计算菌落数的方法
1.直接计数法：是最简单和常用的计数方法，常用于对肠道菌落进行定量计数。
2.平板计数法：分为表面计数法和浸没计数法。
表面计数法是将待检物展布于平板上，待培养后直接数出部分细菌落，以此推出全部细菌落的数量。
浸没计数法是将待检物悬浮于液体培养基中，静置后将液体转移到尺寸已知的容器中，然后计数。
3.膜过滤计数法：膜过滤计数法是将液体待测物过滤通过孔径已知的微孔膜，然后将膜移到含营养物质的培养基中，酝酿一段时间后计数。
4.间接计数法：间接计数法常用于活性菌落数或真菌的计数。
这种方法基于目标细胞的活性或生物特性生成信号。
应用于测定活细胞的方法通常包括：匀浆技术、活菌计数仪、流式细胞技术等。
5.显微镜统计法：适用于对微小微生物，如细菌、霉菌等小孢子菌的数目和形
态结构的鉴定。
在显微镜镜下，结合数学计算方法，统计细胞和孢子的数量。
实验10-细菌计数
实验10 细菌计数返回目录一、显微镜直接计数法【原理】显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上(又称计菌板)，于显微镜下直接计数细菌的一种简便、快速、直观的方法。
该法适用于各种单细胞菌体的纯培养悬浮液，目前国内外常用的计菌板有：血细胞计数板、Peteroff-Hauser计菌板以及Hawksley计菌板等，血球计数板适用于菌体较大的酵母菌或霉菌孢子的计数，后两种计菌板适用于一般细菌的计数。
这几种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，盖玻片和载玻片之间的距离只有0.02mm，可以使用油镜观察。
而血球计数板较厚，不能使用油镜。
这里介绍血球计数板方法计数酵母菌数量。
血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽所构成的3个平台。
中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区，计数区的刻度有两种：一种是一个大方格分为16个中方格(四角的四个大方格)，每个中方格又分25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格(中央的一个大方格)，而每个中方格又分成16个小方格，即计数区都由400个小方格组成(图1-3-12)。
图1-3-12 血细胞计数板构造计数区（一个大方格）边长为1mm，则计数区的面积为l mm2，每个小方格的面积为1/400mm2。
盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以计数区的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为l/4000mm3。
使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每mL菌液(或每g样品)中微生物细胞的数量。
已知：1ml体积＝10mm×10mm×10mm＝1000mm3所以：1ml体积应含有小方格数为1000mm3／(1／4000mm3)＝4×106个小方格。
因此：每ml菌悬液中含有细胞数＝4×106×每个小格中细胞平均数×菌液稀释倍数。
菌悬液浓度确定
微生物数量的测定细菌群体生长表现为细胞数目的增加或细胞物质的增加。
测定细胞数目的方法有显微镜直接计数法(direct microscopic count)、平板菌落计数法(plate count)、光电比油法(turbidity estimation by spectrophotometer)、最大或然数法(most probable number MPN)以及膜过滤法(membrane filtration)等。
测定细胞物质的方法有细胞干重的测定，细胞某种成分如氮的含量、RNA和DNA的含量测定，代谢产物的测定等。
总之，测定微生物生长量的方法很多，各有优缺点，工作中应根据具体情况要求加以选择。
本实验主要介绍生产、科研工作中比较常用的显微镜直接计数法、平板菌落计数法和光电比浊计数法。
一显微镜直接计数法（一）目的要求1．明确血细胞计数板计数的原理。
2．掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。
（二）基本原理显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上(又称计菌器)，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。
目前国内外常用的计菌器有：血细胞计数板、Peteroff-Hauser计菌器以及Hawksley 计菌器等，它们都可用于酵母、细菌、霉菌孢子等悬液的计数，基本原理相同。
后两种计菌器由于盖上盖玻片后，总容积为0.02mm3，而且盖玻片和载波片之间的距离只有0.02mm，因此可用油浸物镜对细菌等较小的细胞进行观察和计数。
除了用这些计菌器外，还有在显微镜下直接观察涂片面积与视野面积之比的估算法，此法一般用于牛乳的细菌学检查。
显微镜直接计数法的优点是直观、快速、操作简单。
但此法的缺点是所测得的结果通常是死菌体和活菌体的总和。
目前已有一些方法可以克服这一缺点，如结合活菌染色微室培养（短时间）以及加细胞分裂抑制剂等方法来达到只计数活菌体的目的。
本实验以血球计数板为例进行显微镜直接计数。
平板菌落计数法和显微镜直接计数法
步骤
1. 制备酵母菌的菌悬液：酿酒酵母菌PDA斜面菌种一支，用无菌生理盐水，将菌苔洗
下，倒入装有玻璃珠的无菌三角瓶中，制成50 mL菌悬液。震荡，混匀。
2. 清洁血球计数板：镜检计数板，计数室内干净后才可以使用。如果有污物，先用自来
水冲洗血球计数板（切勿用硬毛刷刷洗），再用95%的酒精棉球轻轻擦拭，晾干后再次镜检。 盖玻片同样清洗和检查。
10-2
10-3
稀释度 菌落数之比
结果（菌落总 数，CFU/mL）
备注
1
1 365
164
2
2 760
295
3
2 890
271
4
150
30
5 多不可计 1 650
6
27ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
11
7 多不可计 305
20
—
1.6 ˣ 104（或
）
46 1.6(460/295)＜2 3.8 ˣ 104（或16 400） 两位以
思考题
1．测定时，融化后的固体培养基如果在40 ℃、45 ℃、55 ℃和60 ℃保温，测定结果和 50 ℃保温有何区别？ 2．本实验测定方法是十倍稀释，各梯度分别取样1 mL进行测定。如果只稀释至10-1，取 样1 mL、0.1 mL和0.01 mL进行测定，对结果有哪些影响？
原理
显微镜直接计数法：借助显微镜
谢谢
步骤
3. 加菌悬液：将盖玻片盖在计数室的上面，用细口滴管吹打菌悬液，充分混匀。然后吸
菌悬液，滴在计数室和盖玻片的边缘上，菌悬液自然渗入盖玻片和计数板间缝隙中。再用镊 子或接种环柄等轻压盖玻片，去除过多的菌悬液，以免实际的计数室体积变大。静置片刻， 待菌体自然沉降后，计数。
微生物数量测定
微生物数量测定在生物学和医学领域，微生物的数量测定是一个重要的实验技术。
通过对微生物数量的测定，我们可以了解生物体在不同环境中的适应性和生存能力，评估环境的健康状态，以及监测和治疗疾病等。
微生物数量测定的基本原理是利用单位体积或单位面积上的微生物细胞数，通过统计和计算得到微生物的数量。
常用的方法包括显微镜计数法、比浊法、平板计数法等。
显微镜计数法是一种直接计数法，通过显微镜观察并计数样品中的微生物数量。
该方法需要将样品均匀涂布在载玻片上，干燥后进行染色和固定，然后使用显微镜观察并计数。
该方法的优点是简单易行，适用于微生物数量较少的样品，但不适用于大量样品。
比浊法是一种通过测量样品的浊度来测定微生物数量的方法。
该方法是通过将样品与标准曲线进行比较，得出微生物的数量。
该方法的优点是快速、简便、准确度高，适用于大量样品的测定。
但是，该方法需要使用标准曲线，对于某些微生物可能不太准确。
平板计数法是一种通过培养微生物并计数菌落数量来测定微生物数量的方法。
该方法是将样品稀释后涂布在培养基上，培养一定时间后统计菌落数量，然后计算出微生物的数量。
该方法的优点是准确度高，适用于各种微生物的测定，但需要一定的培养时间和人力。
微生物数量测定的应用领域非常广泛，包括环境科学、医学、食品科学、农业科学等。
例如，在环境科学中，微生物数量测定可以用来评估污染物的毒性对生态环境的影响；在医学中，微生物数量测定可以用来监测和治疗疾病；在食品科学中，微生物数量测定可以用来控制食品的质量和安全；在农业科学中，微生物数量测定可以用来了解土壤的健康状况和作物的生长情况等。
微生物数量测定是一种重要的实验技术，广泛应用于生物学和医学等领域。
通过对微生物数量的测定，我们可以更好地了解生物体的适应性和生存能力，评估环境的健康状态，监测和治疗疾病等。
未来随着科技的不断进步和应用领域的不断拓展，微生物数量测定的方法和应用将更加多样化和精准化。
在生物学和医学领域，微生物的大小和数量的测定对于研究生命过程、疾病诊断和治疗等方面都具有重要的意义。
实验四-微生物的菌落形态观察、平板菌落计数及菌种保藏(张理珉)
十分多样
相同
一般不同
可见球状，卵圆状或假 丝状细胞
有时可见细丝状细胞
较快
慢
多带酒香味
常有泥腥味或抗生素气 味
不透明 较牢因结合
十分多样 一般不同 可见粗丝状细胞 一般较快 往往有霉味
二、细菌菌落形态的多样性（示意图）
延展性较强的一些霉菌菌丝（松散）
平板中菌落形态
Hale Waihona Puke 三、菌落特征描写方法说明：检测方法建立的基础——可 测、稳定、重现、可行、简便
浊度与微生物生物量测定
原理：
①细胞的存在会 造成光的散射， 降低光线的透过；
②在一定范围内 细胞浓度与吸光 度成正比
二、平板菌落计数的优缺点
▪ 优点：反映的是微生物活菌数量，可获 得活菌的信息，所以被广泛用于生物制 品检验（如活菌制剂），以及食品、饮 料和水（包括水源水）等的含菌指数或 污染程度的检测。
适用具有特殊生理功能的类群——存在但 不能人工培养形成单菌落，可以利用生化手段 检测出；利用统计学原理计算，结果粗放，只 能得到数量级（近似数）。
（3）菌体浊度的测定（只针对单细胞微 生物）；
利用分光光度计在600nm测定吸光度 值。
（4）细胞干重和湿重的测定（有时湿重 以体积计量）；
（5）各种细胞物质含量的测定（蛋白质、 核酸、 ATP、磷、叶绿素等定量测 定）——建立了多种快速检测方法；
4、若所有稀释度的平均菌落数均大于 300，则应按稀释度(倍数)最高的平均菌落数 乘以稀释倍数（见下表，例4）。
5、若所有稀释度的平均菌落数均小于30， 则应按稀释度(倍数)最低的平均菌落数乘以 稀释倍数（见下表，例5）。
6、若所有稀释度的平均菌落数均不在 30～300之间，则以最近300或30的平均菌落 数乘以稀释倍数（见下表，例6）。
菌的计数方法总结
菌的计数方法总结引言菌的计数方法是微生物学中一项重要的技术，用于确定菌落的数量和浓度。
菌的计数可以帮助科学家了解菌群的变化、评估食品安全和制定防控措施。
本文将总结几种常用的菌的计数方法，包括直接计数法、间接计数法和分子生物学方法。
直接计数法直接计数法是一种直接测定细胞数的方法，可以通过显微镜观察细胞数，在细胞计数盘中简单且直观地对菌群进行计数。
直接计数法的常用技术包括：1. 线性计数法线性计数法是一种适用于稀释菌液的计数方法。
将菌液适当稀释后，用显微镜在细胞计数盘中计数，并根据稀释倍数计算原始菌液中的菌落数量。
线性计数法简单易行，适用于大量菌落和均匀分布的菌群计数。
2. 平板计数法平板计数法是一种用于较浓稠菌液的计数方法。
将菌液分别加入琼脂平板，使其均匀分布，培养一段时间后，在每个菌落上使用计数棒或显微镜进行计数。
根据菌落的分布情况和稀释倍数，可以计算出原始菌液中的菌落数量。
平板计数法适用于菌群相对浓集的情况。
间接计数法间接计数法是通过测定菌群其他特征间接推算出菌数的方法。
这些特征可以是生物化学特征、光学特性或流体力学特性。
常用的间接计数法包括：1. pH指示法pH指示法是一种利用菌群产生的酸碱度对菌数进行估计的方法。
菌群在培养基中生长代谢会产生酸或碱，进而改变培养基的酸碱度。
通过测定菌液的pH值，可以间接估计出菌数的多少。
pH指示法简单易行，但需要选取合适的指示剂和培养条件。
2. ATP测定法ATP测定法是一种利用生物体内三磷酸腺苷（ATP）含量来间接估计菌数的方法。
ATP是细胞内的能量储存物质，细菌数量与ATP含量成正比。
通过测定菌液中ATP的含量，可以推算出菌数的多少。
ATP测定法精确度高，但需要使用特殊的试剂和仪器。
分子生物学方法分子生物学方法是一种基于菌群DNA或RNA的技术，用于准确测定菌数和分类鉴定。
常用的分子生物学方法包括：1. PCR法PCR法（聚合酶链式反应）是一种通过扩增菌群DNA来检测和计数菌数的方法。
菌液计数方法学
菌液计数方法学为了准确计数菌液中的微生物数量，科学家们发展出了多种菌液计数方法。
本文将介绍几种常用的计数方法，以助于实验者们在实验中获得准确的结果。
1. 平板计数法平板计数法是最常用的菌液计数方法之一。
首先，将待测菌液取出一定体积，均匀地涂布在固体培养基表面。
接着，将培养皿在适宜的环境条件下培养一段时间，待菌落形成后，使用显微镜进行观察和计数。
最后，根据每个培养皿中的菌落数量和所取体积，计算出菌液的浓度。
2. 涂片计数法涂片计数法适用于检测菌液中微生物的活跃度和生长状态。
首先，将待测菌液均匀地涂布在玻璃涂片上。
接着，将涂片放置在适宜的培养条件下，使其进行培养。
在培养一段时间后，使用显微镜观察并计数菌落数量。
最后，根据所涂布菌液的体积和菌落数量，计算出菌液的浓度。
3. 浊度计数法浊度计数法是一种简便、快速的菌液计数方法。
浊度指的是菌液中微生物细胞的浓度，可以通过光的散射来测量。
使用专门的浊度计，将待测菌液放入测量装置中，根据测量结果可以直接得出菌液中微生物的浓度。
总结一下，菌液计数方法学涵盖了平板计数法、涂片计数法和浊度计数法。
这些方法各有优劣，根据实验的需要和具体情况选择合适的方法进行菌液计数。
通过这些方法，科学家们可以准确地了解菌液中微生物的数量和浓度，为进一步的研究提供可靠的基础数据。
最后，我们要强调的是，在进行菌液计数时，实验者们需要严格控制实验条件，确保实验的准确性和可重复性。
同时，还应注意文档的撰写规范，避免出现与主题无关的内容，以保持文档的高质量和专业性。
希望本文所介绍的菌液计数方法能对实验者们在科研工作中提供帮助和指导，使其能够准确、高效地进行菌液计数和相关实验。
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测定结果误差较大、操作比较烦琐、需要的时间较长。
三、主要器材
1. 活材料：啤酒酵母（S6） 、 解脂假丝酵 母（S5）
2. 染色液：复红染色液（或结晶紫，美兰） 3. 器材：显微镜、血球计数板、载玻片、 盖玻片 、擦镜纸、吸水纸、计数器、滴管、 无菌吸管、无菌培养皿、马铃薯葡萄糖培养 基。
实验八 微生物显微镜直接计数
和平板菌落计数
一. 实验目的
1. 学习、掌握显微镜直接计数法和平板菌 落计数法； 2. 了解血球计数板的构造、计数原理和计 数方法，掌握显微镜下直接计数的技能。
二、实验原理
测定微生物细胞数量的方法很多，通 常采用的有显微镜直接计数法和平板菌落 计数法。
（一）显微镜直接计数法
后要尽快倒入冷至45℃左右的培养基15 ml ，并迅速旋转混匀。否则，菌体会 吸附在皿底，不易分散形成单菌落。
（二）平板菌落计数法 1. 编号 将平皿和试管分别标记浓度。 2. 稀释样品 将酵母菌样品进行适当稀释。 3. 取样 用无菌吸管准确吸取10-4、 10-5、 10-6稀释菌液各1 ml，放0.2 ml 于无菌平皿。 4. 倒平板 于上述平皿中尽快倒入融化并 冷却到45℃左右的培养基15 ml ，旋转混匀。 5. 计数 培养48 h后取出培养皿，算出同一 稀释度的三个平皿中平均菌落数，再按公 式计算每毫升样品中活菌数。
平板菌落计数法示意图
五、实验报告
（一）实验结果 1. 将直接计数结果记录于表中。 2. 将平板菌落计数结果记录于表中。
（二）思考题 某单位要求知道一种干酵母粉中的活菌
存活率，请设计1-2种可行的检测方法。
六．注意事项
1．计数器必须洗干净，勿刷 ； 2. 千万注意勿损坏计数器 。 3. 平板菌落计数时，测定样品移入培养皿
※显微镜直接计数法
﹡优点：简单、快速、重复性高。
❖ 不足： ➢不能区分死细胞和活细胞，应用范围较窄； ➢一些小的细胞在显微镜下很难看到； ➢样品中菌液浓度不能低于106个/mL； ➢不能用于菌丝体或呈链状而不分散的微生物测定。
※平板菌落计数法
﹡优点：灵敏度高、可以区分死活细胞、应用广。
用于食品、饮料等微生物检查及消毒灭菌效果检查。
四、操作步骤
（一）显微镜直接计数法 1. 稀释样品 将酵母菌样品进行适当稀释。 2. 镜检计数室 加样前先镜检计数室。若有
污物则需清洗后才能加样使用。 3. 加样 在计数室上加盖玻片，用无菌吸管
由盖片边缘加一小滴稀释菌液，让其渗入计 数室，静置5分钟。
4. 将计数板置于载物台上，先用低倍镜找 到计数室，再用高倍镜对稀释菌液计数。
计数区的刻度有两种：一种是计数区
分为16个中方格（中方格用三线隔开）， 而每个中方格又分成25个小方格；另一种 是一个计数区分成25个中方格（中方格之 间用双线分开），而每个中方格又分成16 个小方格。
（一）平板菌落计数法
平板菌落计数法根据微生物在固体培 养基上所形成的菌落一般由一个细胞繁殖 而成的原理进行。即一长成的菌落代表一 个活的细胞。计数时先将待测样品作一系 列稀释，使其中的微生物充分分散成单个 细胞，再吸取一定量的稀释菌液接种到培 养皿中，使其均匀分布于平皿中的培养基 内，经培养单个细胞繁殖形成菌落，统计 菌落数目即可计数出样品的含菌数。