酶联免疫实验(定量法)

注意事项

Байду номын сангаас

1 试剂盒使用前要充分恢复到室温。 2 洗涤要彻底，防止假阳性，但不可洗 涤过猛过急造成假阴性。 3标准品OD值要满足以下要求：20 ng／ ml＞0.150;400 ng／ml ＞1.000,否则应 视为实验失败，全部试验重做。
结果判定

计算：用双对数线性回归或其他适宜的 曲线拟合方式绘制标准曲线，利用该标 准曲线计算待测样品的AFP的含量。
正常参考值：



1.建议实验室建立自己的正常AFP范围。 2.参考值：健康成人≤20ng／ml. 3.对AFP含量在20~400 ng／ml之间者， 建议动态观察。 4.对AFP大于400 ng／ml的样品，请系列 稀释后重做。
标准曲线的特点：
定量免疫测定的标准曲线的建立有以下三 个特点： 1、标准品或校准品浓度与测定反应之间 关系是非线性的。 2、可能存在与系列标准品或校准品的测 定数据拟合的多条曲线。 3、具有相对大的且方差不齐的测定误差。

为了尽可能避免或减少误差，可以通过 增加校准系列中校准品的数量，使校准 物的浓度密切接近，以及对每一个校准 物多次重复测定来进行。在免疫测定中， 曲线拟合的方法有两大类，分别是完全 根据经验的方法和数学模式的方法。
使固相抗原抗体复合物与酶标抗体结 合，形成固相抗体-待测抗原-酶标记 抗体复合物（双抗体夹心），洗涤 除去未结合酶标记抗体；加底物显 色，固相上的酶催化底物成为有色 产物，根据颜色反应的程度进行该 抗原的定性或定量检测。
定量免疫测定的标准曲线的建立

定量测定顾名思义就是测定待测物的含 量。定量免疫测定在测定未知临床标本 得同时，亦需要测定系列不同浓度的标 准品或校准品，然后根据标准品或校准 品浓度与测定信号之间的比例关系来推 算未知标本得浓度，建立标准品或校准 品浓度与测定信号之间的比例关系的数 学公式及相应作图，称为曲线拟合。
实验步骤




1、加样；取出包被板，做好标记。留一孔做空白对照， 其余孔用微量加样器依次加入50μ l标准品及待测样品， 随即加酶结合物50 μ l 。轻轻振荡混匀后，置37度温 箱中温育30min。 2、洗涤：将各孔液体甩掉，用稀释的洗涤液注满各孔， 静置20秒，甩掉，重复5次后在吸水纸上拍干。 3、显色：每空加入底物50 μ l ，再加入显色剂50 μ l ，充分混匀，室温避光反应5min。 4、加终止液50 μ l 终止反应。 5、以空白调零，450nm波长处用酶标仪测各孔OD值。
酶联免疫实验（定量法）
检测甲胎蛋白AFP
实验原理

试剂盒 采用针对不同抗原决簇的双克隆抗体分 别制备成包被板和酶结合物，利用ELISA 双抗体夹心法原理检测人血清中的AFP含 量。
ELISA双抗体夹心法
属于非竞争结合测定，是检测抗原最常用 的方法，适用于检测含有至少两个抗原 决定簇的多价抗原。 其基本原理：先将特异性抗体连接在固相 载体上，形成固相抗体；加入待测标本 并温育，使标本中的抗原与固相抗体充 分反应，形成固相抗体抗原复合物，洗 涤除去其他未结和物；然后加入酶标抗 体并温育。