纸层析法分离氨基酸 ppt课件
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纸层析法分离氨基酸16页PPT
主要试剂：
（1）展开剂 正丁醇:甲酸:水＝60:12:8。 （2）氨基酸标准溶液 2 g·L-1水溶液。 （3）茚三酮 1 g·L-1乙醇溶液。 （4）氨基酸混合试液 将（2）配制的三种氨基酸等量混合。
实验操作：
1.在层析缸中装入展开剂，其高度约1.5~2.0cm；
2.准备滤纸：戴上手套，取层析滤纸一张，在纸的另一端距 边缘3.0cm处用铅笔画一直线，在此直线上每隔2cm作一记 号，为点样位置（即原点）；
3.点样：用毛细血管依次将异亮氨酸，谷氨酸，赖氨酸和混 合样品分别滴在四个位置，点样干后再点一次； 注意事项：每个点在纸上扩散的直径，最大不超过3mm；
实验步骤 ——点 样
3.0cm
1234
异 亮赖 谷混 氨氨 氨合 酸酸 酸液 3.0cm
各点 φ≈2mm
实验目的 实验原理 仪器试剂 实验步骤 注意事项 思考题
赖氨酸
原点到层析斑点中 心的距离 原点到溶剂前沿的 距离
标准aaRf 混合aaRf
Байду номын сангаас
纸层析结果
异亮氨酸
谷氨酸
思考题： 1.纸层析法属于吸附层析还是分配层析，为什么？ 2.此三种氨基酸还能用什么层析方法进行分离，为什么？
6、最大的骄傲于最大的自卑都表示心灵的最软弱无力。——斯宾诺莎 7、自知之明是最难得的知识。——西班牙 8、勇气通往天堂，怯懦通往地狱。——塞内加 9、有时候读书是一种巧妙地避开思考的方法。——赫尔普斯 10、阅读一切好书如同和过去最杰出的人谈话。——笛卡儿
纸层析法分离氨基酸
Rf：0~1， Rf值相差越大，分离效果越好。 本实验分离和鉴定的氨基酸混合液：异亮氨酸、 赖氨酸和谷氨酸。
无色物质的纸色谱可用光谱法（紫外光照射）或 显色法鉴定，氨基酸纸色谱图谱常用茚三酮或吲哚 醌作为显色剂，本实验采用茚三酮作为显色剂。
蛋白质—氨基酸纸上层析(食品生物化学课件)
（5）显色：热风吹干滤 纸至显出氨基酸斑点， 用铅笔描出轮廓。参 见左图。
（6）计算各种氨基酸的Rf值，并判断混合样
品中都有哪些氨基酸，各人将自己的实验结 果贴在实验报告上。
（7）倒掉用过的展层液，将培养皿洗净，整 理好桌面上的仪器和试剂，并注意清洁自己 的操作台，请老师验收，实验报告当场交给 老师。
模块三 蛋白质与食品加工 任务一 氨基酸纸上层析
任务一 氨基酸纸上层析
一、实验目的 1.掌握纸上层析的一般原理和方法 2.了解氨基酸的特征性颜色反应
二、实验原理
• 纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析。滤纸纤 维上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相， 有机溶剂为流动相。当有机相流经固定相时，物质 在两相间不断分配而得到分离。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
（3）点样：在每个圈下用铅笔记上每种氨基酸的代号(混合样 可写M)，然后用毛细管吸取样品，轻轻地点到相应的氨基 酸圈内，待晾干或用冷风吹干后再点第二次。前三种氨基酸 各点3次，混合液点6次。将点过样的滤纸用针线卷成筒状 （点样面向内），注意纸的两边不能接触，留一定缝隙。 。
（4）层析：将培养皿中放入2/3量的展层剂，迅速放置于层 析缸中。把滤纸筒转移到此培养皿内，样品端向下垂直放置， 切勿使展层剂浸到样品点。当溶剂前沿到达滤纸2/3处，取 出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿。
（8）计算 Rf＝X/Y
纸层析结果
测定结果
AA种类 苯丙氨酸
原点到层析斑点中心的 距离
原点到溶剂前沿的距离
赖氨酸
酪氨酸
脯氨酸
待测氨基酸
Rf 判断待测氨基酸
思考题
1、氨基酸纸上层析用哪种物质作为显色剂?这 种显色剂与哪些氨基酸反应不产生蓝紫色? 写出这种显色剂与氨基酸反应的反应式。
氨基酸含量的测定及分离鉴定ppt课件
5
实验结果:
丙氨酸 苯丙氨酸 天冬氨酸
L/㎝ d/㎝ Rf
原点到溶剂前沿距离为L，原点到层析点中心距离为d
6
氨基酸的定量分析 —甲醛滴定法
一、目的：
初步掌握甲醛滴定法测定氨基酸含量的原理和操作要点
7
二、实验原理
水溶液中的氨基酸为兼性离子，因而不能直接用碱滴定氨基酸的羧基 。甲醛可与氨 基酸上的 —N+H3结合，形成 —NH—CH2OH、—N(CH2— OH)2 等羟甲基衍生物，使N+H3上的H+游离出来，这样就可以用碱滴定 N+H3放出H+，测出氨基氮，从而计算氨基酸的含量。
12
五、计算
标准甘氨酸氨基氮的回收率=
VNaoH*0.0200mol/L 理论计算值
*14.008
理论计算值:取用氨基酸的体积乘以浓度,再乘以14.008 VNaoH 两次测定所用氨基酸的体积的平均值
13
每毫升氨基酸溶液中含氨基氮的毫克数为
式中：V1为滴定样品消耗氢氧化钠的体积（ml）； V2为滴空白消耗氢氧化钠的体积（ml）； MNaOH 标准NaOH溶液的摩尔浓度
14
思考题
1、甲醛法测定氨基酸含量的原理是什么？ 2、根据滴定结果，总结分析此法在实际应用中的
优缺点。 3、为什么氢氧化钠溶液滴定氨基酸的—N+H3基上
的H+，不能用一般的酸碱指示剂？
15
8
若样品中只含有单一的已知氨基酸，则可由此法滴定的结果算出氨基 酸的含量。若样品中含有多种氨基酸（如蛋白质水解液），测不能由 此法算出氨基酸的含量。 脯氨酸与甲醛作用后，生成的化合物不稳定，导致滴定后结果偏低； 酪氨酸含酚基结构，导致滴定结果偏高。
实验结果:
丙氨酸 苯丙氨酸 天冬氨酸
L/㎝ d/㎝ Rf
原点到溶剂前沿距离为L，原点到层析点中心距离为d
6
氨基酸的定量分析 —甲醛滴定法
一、目的：
初步掌握甲醛滴定法测定氨基酸含量的原理和操作要点
7
二、实验原理
水溶液中的氨基酸为兼性离子，因而不能直接用碱滴定氨基酸的羧基 。甲醛可与氨 基酸上的 —N+H3结合，形成 —NH—CH2OH、—N(CH2— OH)2 等羟甲基衍生物，使N+H3上的H+游离出来，这样就可以用碱滴定 N+H3放出H+，测出氨基氮，从而计算氨基酸的含量。
12
五、计算
标准甘氨酸氨基氮的回收率=
VNaoH*0.0200mol/L 理论计算值
*14.008
理论计算值:取用氨基酸的体积乘以浓度,再乘以14.008 VNaoH 两次测定所用氨基酸的体积的平均值
13
每毫升氨基酸溶液中含氨基氮的毫克数为
式中：V1为滴定样品消耗氢氧化钠的体积（ml）； V2为滴空白消耗氢氧化钠的体积（ml）； MNaOH 标准NaOH溶液的摩尔浓度
14
思考题
1、甲醛法测定氨基酸含量的原理是什么？ 2、根据滴定结果，总结分析此法在实际应用中的
优缺点。 3、为什么氢氧化钠溶液滴定氨基酸的—N+H3基上
的H+，不能用一般的酸碱指示剂？
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8
若样品中只含有单一的已知氨基酸，则可由此法滴定的结果算出氨基 酸的含量。若样品中含有多种氨基酸（如蛋白质水解液），测不能由 此法算出氨基酸的含量。 脯氨酸与甲醛作用后，生成的化合物不稳定，导致滴定后结果偏低； 酪氨酸含酚基结构，导致滴定结果偏高。
纸层析法分离鉴定氨基酸
❖ 看看接下来会发生什么事情…
.
14
❖ 可以看出1号氨基酸上升的最
1
高，在滤纸上跑得最快。
2
3
4
❖ 而4号氨基酸与滤纸的结合最
紧，因此跑的速度比其他的氨
基酸慢。
.
15
甘氨酸
组氨酸
缬氨酸
半胱氨酸
1
2
❖ 这就是纸色谱法。
3
4
❖ 对照上图，可知道1-4号的各
代表什么氨基酸。
❖ 纸色谱法是分离鉴定蛋白质的 氨基酸组成的重要工具。
.
16
纸色谱小.实验动画演示
17
.
18
溶质在固定相的溶解度 分配系数 =
溶质在流动相的溶解度
.
5
纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层 析：纸纤维上的 –OH 基具有亲水性，所以 能吸附一层水作为固定相，而通常把有机溶 剂作为流动相。流动相流经支持物时与固定 相间连续抽提，使物质在两相间不断地分配 而得到分离。
.
6
❖ 溶质在滤纸上的移动速率用Ｒf（比移）值来 表示：
.
11
3、扩展 ：用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。将滤
纸直立于培养皿中（点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点 样线1 cm）。待溶剂上升约15 cm时即取出滤纸，铅笔描出 溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。
4、显色： 用喷雾器均匀喷上0。1％茚三酮正丁醇溶液，然
后置烘箱中烘烤5分钟(100℃)或用热风吹干即可显出各层析斑 点。
展层层斑点中心与原点间的距离 Rf = --------------------------------------------
溶剂前沿与原点之间的距离
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❖ 可以看出1号氨基酸上升的最
1
高，在滤纸上跑得最快。
2
3
4
❖ 而4号氨基酸与滤纸的结合最
紧，因此跑的速度比其他的氨
基酸慢。
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甘氨酸
组氨酸
缬氨酸
半胱氨酸
1
2
❖ 这就是纸色谱法。
3
4
❖ 对照上图，可知道1-4号的各
代表什么氨基酸。
❖ 纸色谱法是分离鉴定蛋白质的 氨基酸组成的重要工具。
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纸色谱小.实验动画演示
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18
溶质在固定相的溶解度 分配系数 =
溶质在流动相的溶解度
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纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层 析：纸纤维上的 –OH 基具有亲水性，所以 能吸附一层水作为固定相，而通常把有机溶 剂作为流动相。流动相流经支持物时与固定 相间连续抽提，使物质在两相间不断地分配 而得到分离。
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6
❖ 溶质在滤纸上的移动速率用Ｒf（比移）值来 表示：
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11
3、扩展 ：用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。将滤
纸直立于培养皿中（点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点 样线1 cm）。待溶剂上升约15 cm时即取出滤纸，铅笔描出 溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。
4、显色： 用喷雾器均匀喷上0。1％茚三酮正丁醇溶液，然
后置烘箱中烘烤5分钟(100℃)或用热风吹干即可显出各层析斑 点。
展层层斑点中心与原点间的距离 Rf = --------------------------------------------
溶剂前沿与原点之间的距离
氨基酸的分离鉴定纸层析法ppt课件
（4）层析：用针、线将滤纸缝成筒状，纸的两侧
边缘不能接触且要保持平行，参见图3-3。向培养 皿中加入扩展剂，使其液面高度达到1cm左右， 将点好样的滤纸筒直立于培养皿中（点样的一端 在下，扩展剂的液面在A线下约1cm），罩上大 烧杯，仍用塑料薄膜密封。当扩展剂上升到A线 时开始计时，每隔一定时间测定一下扩展剂上升 的高度，填入表3-1中。当上升到15～18cm， 取出滤纸，剪断连线，立即用铅笔描出溶剂前沿 线，迅速用电吹风热风吹干。
（2）规划：带上手套，取宽约 14cm、高约22cm的层析滤 纸一张。在纸的下端距边缘 2cm处轻轻用铅笔划一条平 行于底边的直线A，在直线 上做4个记号，记号之间间隔 2cm，这就是原点的位置。 另在距左边缘1cm处画一条 平行于左边缘的直线B，在B 线上以A、B两线的交点为原 点标明刻度（以厘米为单 位），参见左图。
（3）点样：用微量注射器分别取10mL左右的氨基酸样 品（每取一个样之前都要用蒸馏水洗涤微量注射器，以 免交叉污染），点在这四个位置上。挤一滴点一次，同 一位置上需点2～3次，2～3mL/次，每点完一点，立 刻用电吹风热风吹干后再点，以保证每点在纸上扩散的 直径最大不超过3mm。每人须点4个样，其中3个是已 知样，1个是待测样品。
（8）将微量注射器内外用蒸馏水清洗干净，倒掉用 过的展层液和平衡液，将培养皿洗净，整理好桌面上 的仪器和试剂，并注意清洁自己的操作台，请老师验 收，实验报告当场交给老师。
计算
Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距
离
记录与计算汇总
扩展剂前沿上升速度
X（min） 0 5 10 15 20 30 40 60 90 … 18
一、实验目的
掌握氨基酸纸层析的方法和原理，学会分析待 测样品的氨基酸成分。
《氨基酸纸层析》课件
02
在使用展开剂时，要确 保其纯度，以免影响实 验结果。
03
点样时要避免产生气泡 ，以免影响展开效果。
04
在展开过程中，要保持 滤纸条的湿润状态，以 免影响实验结果。
安全须知
实验过程中要佩戴实验服和护目 镜，以避免试剂溅到身上或眼睛
中。
对于有毒有害的试剂，要严格按 照操作规程进行使用和处理，以
免造成危害。
点样
用毛细管取适量氨基酸混合物， 轻轻地点在滤纸条的尖端，确保 点样量适中。
展开
将滤纸条放入展开剂中，确保展 开剂能够充分渗透到滤纸纤维中 。在展开过程中，注意保持滤纸 条的湿润状态。
观察和记录
观察展开后的滤纸条上氨基酸的 分布情况，并记录各氨基酸的Rf 值。
实验注意事项
01
确保实验环境干净整洁 ，以避免污染。
未来研究展望
深入研究纸层析的原理和影响因素，提高方法的稳定性 和可靠性。
将纸层析与其他分析方法结合，实现多组分同时分离和 鉴定，提高分析效率。
探索新的展开剂和固定相，提高纸层析的分离效果和分 辨率。
拓展纸层析在生命科学、医学、环境科学等领域的应用 ，为相关研究提供有力支持。
THANKS
感谢观看
《氨基酸纸层析》 ppt课件
xx年xx月xx日
• 氨基酸纸层析简介 • 氨基酸纸层析实验准备 • 氨基酸纸层析实验步骤 • 氨基酸纸层析实验结果分析 • 氨基酸纸层析实验结论与展望
目录
01
氨基酸纸层析简介
定义与原理
定义
氨基酸纸层析是一种利用滤纸作 为固定相，通过溶剂的迁移作用 对氨基酸混合物进行分离和鉴定 的方法。
层析缸
滴管 移液管
恒温水浴锅 离心机
最新实验2氨基酸薄层层析PPT课件
3. 关闭空调、电脑、投影、水、电、门和 窗。
4. 填写值日登记本。
直径不超过2mm。
2cm Ala Arg Gly Mix
轻触疾起
1cm
操作步骤— 展层、显色
将薄层板点样端浸入展层 -显色剂，展层-显色剂液面 应低于点样线。盖好层析缸 盖，上行展层。当展层剂前 沿离薄板顶端2cm时，停止 展层，取出薄板，用铅笔描 出溶剂前沿界线，用热风吹 干或在85℃下烘干，即可显 出各层斑点。
② 硅醇基显较弱的酸性，因而，硅胶只能用 于中性、或酸性成分的分离，碱性成分不能用它 分离。
③ 硅胶的活化温度通常为105℃－110℃，不 能过高。
实验原理
2. 氨基酸与茚三酮的显色反应 茚三酮水化后生成水化茚三酮，它与氨基
酸的羧基反应生成还原茚三酮、氨及醛，与 此同时，还原茚三酮又与氨及茚三酮缩合生 成紫红化合物而使氨基酸斑点显色。
实验原理
硅胶吸附薄层层析
• 吸附薄层中常用的吸附剂为氧化铝和硅胶 • 硅胶：表达式为SiO2·XH2O。层析用硅胶是一种
多孔性物质，它的硅氧环交链结构表面上密布极性 硅醇基（－Si－OH），这种极性的硅醇基能和许 多化合物形成氢键而产生吸附.
实验原理
硅胶吸附薄层层析的特点：
① 硅胶的吸附能力比氧化铝稍弱，其吸附活 性也与含水量呈负性相关。
• 吸附剂：硅胶 • 粘合剂： 0.5%的羧甲基纤维素钠 • 氨基酸的异丙醇溶液
丙氨酸、精氨酸、甘氨酸 • 展开-显色剂（正丁醇、乙酸、茚三酮溶液） • 分析样品：氨基酸混合液
器材
• 层析板、尺子、铅笔 • 烧杯、玻棒、量筒 • 吹风机 • 毛细管、层析缸 • 药匙 • 烘箱
操作步骤—薄层板的制备
1、调浆 称取硅胶3克，加0.5%的羧甲基纤 维素钠8毫升，调成均匀的糊状。 2、涂布 取洁净的干燥玻璃板均匀涂层。 3、干燥 将玻璃板水平放置，室温下自然凉 干。 4、活化 70℃烘干30分钟。切断电源，待玻 璃板面温度下降至不烫手时取出。
4. 填写值日登记本。
直径不超过2mm。
2cm Ala Arg Gly Mix
轻触疾起
1cm
操作步骤— 展层、显色
将薄层板点样端浸入展层 -显色剂，展层-显色剂液面 应低于点样线。盖好层析缸 盖，上行展层。当展层剂前 沿离薄板顶端2cm时，停止 展层，取出薄板，用铅笔描 出溶剂前沿界线，用热风吹 干或在85℃下烘干，即可显 出各层斑点。
② 硅醇基显较弱的酸性，因而，硅胶只能用 于中性、或酸性成分的分离，碱性成分不能用它 分离。
③ 硅胶的活化温度通常为105℃－110℃，不 能过高。
实验原理
2. 氨基酸与茚三酮的显色反应 茚三酮水化后生成水化茚三酮，它与氨基
酸的羧基反应生成还原茚三酮、氨及醛，与 此同时，还原茚三酮又与氨及茚三酮缩合生 成紫红化合物而使氨基酸斑点显色。
实验原理
硅胶吸附薄层层析
• 吸附薄层中常用的吸附剂为氧化铝和硅胶 • 硅胶：表达式为SiO2·XH2O。层析用硅胶是一种
多孔性物质，它的硅氧环交链结构表面上密布极性 硅醇基（－Si－OH），这种极性的硅醇基能和许 多化合物形成氢键而产生吸附.
实验原理
硅胶吸附薄层层析的特点：
① 硅胶的吸附能力比氧化铝稍弱，其吸附活 性也与含水量呈负性相关。
• 吸附剂：硅胶 • 粘合剂： 0.5%的羧甲基纤维素钠 • 氨基酸的异丙醇溶液
丙氨酸、精氨酸、甘氨酸 • 展开-显色剂（正丁醇、乙酸、茚三酮溶液） • 分析样品：氨基酸混合液
器材
• 层析板、尺子、铅笔 • 烧杯、玻棒、量筒 • 吹风机 • 毛细管、层析缸 • 药匙 • 烘箱
操作步骤—薄层板的制备
1、调浆 称取硅胶3克，加0.5%的羧甲基纤 维素钠8毫升，调成均匀的糊状。 2、涂布 取洁净的干燥玻璃板均匀涂层。 3、干燥 将玻璃板水平放置，室温下自然凉 干。 4、活化 70℃烘干30分钟。切断电源，待玻 璃板面温度下降至不烫手时取出。
纸层析分离丝氨酸和甘氨酸PPT课件
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4
所谓Rf，是指在纸层析中，从原点至氨基酸 停留点（又称为层析点）中心的距离（X） 与原点至溶剂前沿的距离（Y）的比值：
在一定条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值 的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、 温度、湿度、层析滤纸的型号和质量等因 素有关。
.
5
三、实验器材与试剂
（一）器材
1. 层析缸 2. 点样毛细管 3. 小烧杯 4. 培养皿 5. 量筒 6. 喷雾器 7. 吹风机（或烘箱）8. 层析滤纸9. 直尺及铅笔
2cm处用铅笔划一直线，在直线上每间隔2cm做 一记号，标出5个原点。 3．点样：用毛细管将各氨基酸样品点在5个原点上， 用量10～20μl，每点在纸上扩散的直径，最大不 超过3 mm，边点样边用电吹风吹干，越小越好。 干后再点一次。
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7
4．扩展 用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。 将盛有约20 mL扩展剂的培养皿迅速置于密闭的 层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中(点样的一端 在下，扩展剂的液面需低于点样线1 cm)。待溶剂 上升15―20 cm时即取出滤纸，铅笔描出溶剂前 沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。
5．显色 用喷雾器均匀喷上0。1％茚三酮正丁醇溶 液，然后置烘箱中烘烤5分钟(100℃)或用热风吹 干即可显出各层析斑点。
6．计算各种氨基酸的Rf值。
.
8
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9
(二) 试剂
1. 扩展剂(正丁醇: 80%甲酸:水＝15:3:2)
2. 甘氨酸溶液及丝氨酸溶液
3. 显色剂：0.5%的茚三酮—正丁醇溶液
（0．5g茚三酮溶于100ml正丁醇即得0.5%的茚三酮—正丁 醇溶液，
使用茚三酮溶液显色时要戴手套）.6四 Nhomakorabea实验步骤
氨基酸纸层析ppt课件
2023/12/31
15
三、实验材料、仪器和试剂：
1、实验材料：
谷氨酸、组氨酸、脯氨酸、亮氨酸标准品
2、仪器：
(1)毛细管 (2)电热吹风机 (3)层析缸 (4)层析滤纸
(5)小型玻璃喷雾器(6)铅笔、直尺等。
3、试剂：
(1)氨基酸标准溶液：亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸、
组氨酸标准品。
(2)溶剂系统：
正丁醇：甲酸：水=15：3：2（体积比）摇来自；2023/12/31
14
（6）展开方式：
上行法Rf小；下行法（层析缸上部有一盛展开剂的 液槽，滤纸点样端向上进入槽中，重现性差，斑点易 扩散） Rf大；环行法（最好用无方向性的特制滤纸） 用圆形滤纸层析时，由于内圈较外圈小，限制了溶剂 的流动，Rf较小。
（7）样品溶液中杂质：
如氯化钠的存在会影响氨基酸的Rf值。
实验一
氨基酸纸层析
2023/12/31
1
一、实验目的：
1、通过氨基酸的分离，学习并掌握纸层 析的原理和操作技术；
2、掌握分配层析法； 3、掌握影响分配系数的因素。
2023/12/31
2
层析技术(chromatography 色谱技术)
一、发展史：
层析分离技术在20世纪初就已得到应用： ➢ 1903年用于植物色素的分离,各种色素以不同的速率流动后形成不
2023/12/31
6
溶剂系统： 正丁醇：甲酸：水=15：3：2 固定相：水和滤纸纤维素有较强的亲和力， 因而其扩散作用降低形成固定相;
流动相：有机溶剂和滤纸亲和力弱，所以在 滤纸毛细管中自由流动，形成流动相。
由于混合液中各种氨基酸的α值不同，所以移
动速率（即迁移率Rf值）就不同，从而达到 分离的目的。
【正式版】纸层析法分离鉴定氨基酸PPT
由于氨基酸无色，可利用茚三酮反应使氨基酸层析斑点显色，从而作定性分析。 点样：用毛细管依次将Lys(赖) 、 Gly(甘) 、 Pro(脯)、Val (缬)、 Leu (亮)和混合样品分别点在这6个位置上，点样点干后再点一次。 待溶剂上升15～20 cm时，取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，电吹风吹干。 纸层析法分离鉴定氨基酸 所谓Rf，是指在纸层析中，从原点至氨基酸停留点（又称为层析点）中心的距离（X）与原点至溶剂前沿的距离（Y）的比值。 由于氨基酸无色，可利用茚三酮反应使氨基酸层析斑点显色，从而作定性分析。 注意事项：手不能直接接触滤纸； (3) 显色剂：％ (m/V)水合茚三酮正丁醇溶液 。 在一定条件下（如温度、展层剂的组成、层析纸质量等不变），某种物质的Rf 值是常数，因此可作为定性依据。 在层析缸中装入展层剂，其高度约～2cm。 所谓Rf，是指在纸层析中，从原点至氨基酸停留点（又称为层析点）中心的距离（X）与原点至溶剂前沿的距离（Y）的比值。 纸层析法分离鉴定氨基酸
纸层析法分离鉴定氨基酸
将样品点在距滤纸一端约2～3cm的某一处， 该点称为原点；然后在密闭容器中层析溶剂 沿滤纸的一个方向进行展层，这样混合氨基 酸在两相中不断分配。由于分配系数（Kd） 不同，结果它们分布在滤纸的不同位置上。 物质被分离后在纸层析图谱上的位置，可用 比移值（Rf）来表示。 所谓Rf，是指在纸层析中，从原点至氨基酸 停留点（又称为层析点）中心的距离（X）与 原点至溶剂前沿的距离（Y）的比值。如图
笔描出溶剂前沿界线，电吹风吹干。 在所一谓定 Rf条，件是下指（在如纸温层度析、中展，层从剂原的点组至成氨、基层酸析停纸留质点量（等又不称变为）层，析某点种）物中质心的距Rf离值（是X常）数与，原因点此至可溶作剂为前定沿性的依距据离。（Y）的比值。
实验六 纸层析法分离氨基酸.20页PPT
21、要知道对好事的称颂过于夸大，也会招来人们的反感轻蔑和嫉妒。——培根 22、业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。——韩愈
23、一切节省，归根到底都归结为时间的节省。——马克思 24、意志命运往往背道而驰，决心到最后会全部推倒。——莎士比亚
25、学习是劳动，是充满思想的劳动。——乌申斯基
1、不要轻言放弃，否则对不起自己。
2、要冒一次险!整个生命就是一场冒险。走得最远的人，常是愿意 去做，并愿意去冒险的人。“稳妥”之船，从未能从岸边走远。-戴尔．卡耐基。
梦 境
3、人生就像一杯没有加糖的咖啡，喝起来是苦涩的，回味起来却有 久久不会退去的余香。
实验六 纸层析法分离氨基酸. 4、守业的最好办法就是不断的发展。 5、当爱不能完美，我宁愿选择无悔，不管来生多么美丽，我不愿失 去今生对你的记忆，我不求天长地久的美景，我只要生生世世的轮 回
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纸层析法分离氨基酸
则会出现斑点畸形现象。
纸层析法分离氨基酸
3.平衡
点样以后展开以前先将滤纸与层析缸用配好的溶液 系统的蒸汽来饱和，这个过程称之为“平衡”。若不经 平衡，滤纸和层析缸未被溶剂蒸汽饱和，在层析过程中， 滤纸会从溶剂中吸收水分，溶剂也会从滤纸表面挥发， 从而改变溶剂系统的组成,严重影响层析效果。平衡一 般在密闭的层析缸内进行。
溶剂系统中的试剂若纯度不够，需经过预处理后才能使 用。处理的方法因溶剂的性质而异。常用的处理方法有：酸、 碱抽提，水洗涤，重蒸馏，脱水干燥等
纸层析法分离氨基酸
4.pH值
溶剂和样品的pH值会影响物质的解离，从而影响物质的 极性和溶解度，使Rf值改变。溶剂的酸碱度增大则流动相的 含水量增高，使极性物质的Rf值增加；反之则降低。
(2) 下行法：在层析缸上部有一盛展开剂的液槽，将滤纸 点样的一端朝上浸入槽中，溶剂主要靠重力作用自上而下流动。 下行法展开速度快，但Rf值纸层的析重法分现离氨性基较酸 差，斑点易扩散。
(3) 环行法：又称水平法，样品点于圆形滤纸 距圆心1cm左右的环形线(原线)上。滤纸水平放置， 溶剂由滤纸条引向圆心，然后不断向四周水平方向 流动。由于溶剂向圆周方向扩散，所以展开的图谱 呈弧形。用环行法展开时，最好使用无方向性的特 制滤纸。
纸层析法分离氨基酸
4.展开
平衡结束后，将滤纸靠样品点的一端浸入溶剂中，溶剂液 面距原线距离约1cm，此时即开始展开。当溶剂前沿到达滤纸另 一端0.5-1cm处时，展开结束，取出滤纸，在溶剂前沿处做一标 记，晾干或用冷风吹干。
按溶剂在滤纸上流动的方向不同，展开有上行、下行和环 行三种方式。
(1) 上行法：将滤纸点样的一端向下浸入溶剂中，溶剂因 毛细管引力的作用从下向上流动。 上行法操作简单，重现性好， 是最常用的展开方法，但展开时间较长。
纸层析法分离氨基酸
纸层析法分离氨基酸
实验目的
1、掌握分配层析的原理，学习氨基酸纸层析 法的操作技术 (包括点样、平衡、展层、显色、 鉴定及定量)。
2、学习未知样品的氨基酸成分(水解、层析及 鉴定)分析的方法。
纸层析法分离氨基酸
实验原理
层析法又叫色层分离法、色谱分析法或色谱法。 1944 年应用滤纸作为固定支持物的“纸层析”诞生以来，层析技 术的发展越来越快，五十年代开始，相继出现了气相色谱和 高压液相层析，其它如薄层层析、亲合层析、凝胶层析等也 迅猛发展。层析分离技术操作简便，样品用量可大可小，既 可用于实验室分离分析，又适用于工业生产中产品的分析制 备。现已成为生物化学、分子生物学、生物工程等学科广泛 应用而又必不可少的分析工具之一。
为了避免或减少pH值对Rf值的影响，可将滤纸和溶剂用 缓冲溶液处理，使之保持一定的pH值。
5.温度
温度能影响物质在两相中的溶解度，即影响分配系数； 也影响滤纸纤维的水合作用，即影响固定相的体积.所以温度 的改变使Rf值变化很大，为此，层析必须在恒温条件下进行。
纸层析法分离氨基酸
6.展开方式
同一物质在其他层析条件完全相同的情况下，用不同 的展开方式进行层析时，所得到的Rf 值不相同。用下行法展 开时，Rf值较大；用上行法展开时，Rf值较小；用圆形滤纸 层析时，由于内圈较外圈小，限制了溶剂的流动，Rf值也较 小。
（4）双向展开法：如果样品组分较多，用一种 溶剂系统（常为酸性）不能将各组分全部分开时， 可将样品点在方形滤纸的一角，用一种溶剂系统展 开后吹干溶剂，将滤纸转动90o后再用另一种溶剂系 统（常为碱性）展开，这称为“双向展开法”。
(一) 原理
纸上层析实际上是以滤纸纤维的结合水为固定相， 而以有机溶剂(与水不相混溶或部分混溶)作为流动相。 展开时，有机溶剂在滤纸上流动，样品中各物质在两相 之间不断地进行分配。由于各物质有不同的分配系数， 移动速度因此不同，从而达到分离的目的。
纸层析法分离氨基酸
纸层析法分离氨基酸
溶质在滤纸上移动的速率可用Rf值 表示：
纸层析法分离氨基酸
分配层析
分配层析法是利用不同的物质在两个互不相溶的溶剂中 的分配情况不同而使之得到分离的方法。
分配层析法中不同溶质的分离取决于其在两相 (固定相 和流动相)间分配系数的不同。
分配系数(K)的定义是： K=溶质在固定相的浓度(CS)/溶质在流动相的浓度(CL)
纸层析法分离氨基酸
二、纸层析
2.滤纸
不同滤纸的厚薄程度和纤维松紧度各不相同，因此结合的 水量不一样，两相的体积比也就不同。所以同一种物质在不同 型号的滤纸上进行层析时，所得到的Rf值也不相同。
此外，滤纸上所含的杂质也会影响Rf值。
纸层析法分离氨基酸
3.层析所用的溶剂
同一物质在不同的溶剂系统中进行层析时，Rf值不同。所 以溶剂的配制和使用必须严格，才能使Rf值的重现性好。在好 的溶剂系统中被分离物质的Rf值应在0.05-0.85之间，样品中 被分离组分的Rf之差最好大于0.05。
Rf= X/ Y 式中X：溶质斑点中心的移动距离
Y：溶剂前沿移动的距离 Rf值决定于分配系数。
不同物质的分配系数不同，Rf值也不相同，由 此可以根据Rf值的大小对物质进行定性分析。
纸层析法分离氨基酸
(二) 影响Rf值的主分子极性是影响Rf值的主要因素。极性较大 的物质，在水中的溶解度较大，其Rf值就较小，反之亦然。
7.样品溶液中杂质
样品溶液中存在杂质时，有时对Rf值有所影响。例如： 氯化钠的存在会影响氨基酸的Rf 值。
纸层析法分离氨基酸
(三) 操作方法
1.样品处理
用作纸层析的样品，应尽可能除杂纯化。调节到一定 的pH值，浓度太低的可用真空浓缩提高浓度，浓度太高则需 稀释。
2.点样
将滤纸裁成适当大小，用铅笔在距边线2cm左右划一直 线(称为原线)，线上每隔2-3cm划一圆点(称为原点)。然后 用点样器(定性分析可用普通毛细管，定量分析需用微量注 射器)轻轻点在原点上。样品点的直径约0.3-0.5cm。点样的 量应根据纸的长短以及样品的性质来决定，一般每一样品的 量为5-30μg。点样一般采用少量多次，每点一次必须用冷 风吹干，然后再点第二次。每次点样的位置应完全重合，否
则会出现斑点畸形现象。
纸层析法分离氨基酸
3.平衡
点样以后展开以前先将滤纸与层析缸用配好的溶液 系统的蒸汽来饱和，这个过程称之为“平衡”。若不经 平衡，滤纸和层析缸未被溶剂蒸汽饱和，在层析过程中， 滤纸会从溶剂中吸收水分，溶剂也会从滤纸表面挥发， 从而改变溶剂系统的组成,严重影响层析效果。平衡一 般在密闭的层析缸内进行。
溶剂系统中的试剂若纯度不够，需经过预处理后才能使 用。处理的方法因溶剂的性质而异。常用的处理方法有：酸、 碱抽提，水洗涤，重蒸馏，脱水干燥等
纸层析法分离氨基酸
4.pH值
溶剂和样品的pH值会影响物质的解离，从而影响物质的 极性和溶解度，使Rf值改变。溶剂的酸碱度增大则流动相的 含水量增高，使极性物质的Rf值增加；反之则降低。
(2) 下行法：在层析缸上部有一盛展开剂的液槽，将滤纸 点样的一端朝上浸入槽中，溶剂主要靠重力作用自上而下流动。 下行法展开速度快，但Rf值纸层的析重法分现离氨性基较酸 差，斑点易扩散。
(3) 环行法：又称水平法，样品点于圆形滤纸 距圆心1cm左右的环形线(原线)上。滤纸水平放置， 溶剂由滤纸条引向圆心，然后不断向四周水平方向 流动。由于溶剂向圆周方向扩散，所以展开的图谱 呈弧形。用环行法展开时，最好使用无方向性的特 制滤纸。
纸层析法分离氨基酸
4.展开
平衡结束后，将滤纸靠样品点的一端浸入溶剂中，溶剂液 面距原线距离约1cm，此时即开始展开。当溶剂前沿到达滤纸另 一端0.5-1cm处时，展开结束，取出滤纸，在溶剂前沿处做一标 记，晾干或用冷风吹干。
按溶剂在滤纸上流动的方向不同，展开有上行、下行和环 行三种方式。
(1) 上行法：将滤纸点样的一端向下浸入溶剂中，溶剂因 毛细管引力的作用从下向上流动。 上行法操作简单，重现性好， 是最常用的展开方法，但展开时间较长。
纸层析法分离氨基酸
纸层析法分离氨基酸
实验目的
1、掌握分配层析的原理，学习氨基酸纸层析 法的操作技术 (包括点样、平衡、展层、显色、 鉴定及定量)。
2、学习未知样品的氨基酸成分(水解、层析及 鉴定)分析的方法。
纸层析法分离氨基酸
实验原理
层析法又叫色层分离法、色谱分析法或色谱法。 1944 年应用滤纸作为固定支持物的“纸层析”诞生以来，层析技 术的发展越来越快，五十年代开始，相继出现了气相色谱和 高压液相层析，其它如薄层层析、亲合层析、凝胶层析等也 迅猛发展。层析分离技术操作简便，样品用量可大可小，既 可用于实验室分离分析，又适用于工业生产中产品的分析制 备。现已成为生物化学、分子生物学、生物工程等学科广泛 应用而又必不可少的分析工具之一。
为了避免或减少pH值对Rf值的影响，可将滤纸和溶剂用 缓冲溶液处理，使之保持一定的pH值。
5.温度
温度能影响物质在两相中的溶解度，即影响分配系数； 也影响滤纸纤维的水合作用，即影响固定相的体积.所以温度 的改变使Rf值变化很大，为此，层析必须在恒温条件下进行。
纸层析法分离氨基酸
6.展开方式
同一物质在其他层析条件完全相同的情况下，用不同 的展开方式进行层析时，所得到的Rf 值不相同。用下行法展 开时，Rf值较大；用上行法展开时，Rf值较小；用圆形滤纸 层析时，由于内圈较外圈小，限制了溶剂的流动，Rf值也较 小。
（4）双向展开法：如果样品组分较多，用一种 溶剂系统（常为酸性）不能将各组分全部分开时， 可将样品点在方形滤纸的一角，用一种溶剂系统展 开后吹干溶剂，将滤纸转动90o后再用另一种溶剂系 统（常为碱性）展开，这称为“双向展开法”。
(一) 原理
纸上层析实际上是以滤纸纤维的结合水为固定相， 而以有机溶剂(与水不相混溶或部分混溶)作为流动相。 展开时，有机溶剂在滤纸上流动，样品中各物质在两相 之间不断地进行分配。由于各物质有不同的分配系数， 移动速度因此不同，从而达到分离的目的。
纸层析法分离氨基酸
纸层析法分离氨基酸
溶质在滤纸上移动的速率可用Rf值 表示：
纸层析法分离氨基酸
分配层析
分配层析法是利用不同的物质在两个互不相溶的溶剂中 的分配情况不同而使之得到分离的方法。
分配层析法中不同溶质的分离取决于其在两相 (固定相 和流动相)间分配系数的不同。
分配系数(K)的定义是： K=溶质在固定相的浓度(CS)/溶质在流动相的浓度(CL)
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二、纸层析
2.滤纸
不同滤纸的厚薄程度和纤维松紧度各不相同，因此结合的 水量不一样，两相的体积比也就不同。所以同一种物质在不同 型号的滤纸上进行层析时，所得到的Rf值也不相同。
此外，滤纸上所含的杂质也会影响Rf值。
纸层析法分离氨基酸
3.层析所用的溶剂
同一物质在不同的溶剂系统中进行层析时，Rf值不同。所 以溶剂的配制和使用必须严格，才能使Rf值的重现性好。在好 的溶剂系统中被分离物质的Rf值应在0.05-0.85之间，样品中 被分离组分的Rf之差最好大于0.05。
Rf= X/ Y 式中X：溶质斑点中心的移动距离
Y：溶剂前沿移动的距离 Rf值决定于分配系数。
不同物质的分配系数不同，Rf值也不相同，由 此可以根据Rf值的大小对物质进行定性分析。
纸层析法分离氨基酸
(二) 影响Rf值的主分子极性是影响Rf值的主要因素。极性较大 的物质，在水中的溶解度较大，其Rf值就较小，反之亦然。
7.样品溶液中杂质
样品溶液中存在杂质时，有时对Rf值有所影响。例如： 氯化钠的存在会影响氨基酸的Rf 值。
纸层析法分离氨基酸
(三) 操作方法
1.样品处理
用作纸层析的样品，应尽可能除杂纯化。调节到一定 的pH值，浓度太低的可用真空浓缩提高浓度，浓度太高则需 稀释。
2.点样
将滤纸裁成适当大小，用铅笔在距边线2cm左右划一直 线(称为原线)，线上每隔2-3cm划一圆点(称为原点)。然后 用点样器(定性分析可用普通毛细管，定量分析需用微量注 射器)轻轻点在原点上。样品点的直径约0.3-0.5cm。点样的 量应根据纸的长短以及样品的性质来决定，一般每一样品的 量为5-30μg。点样一般采用少量多次，每点一次必须用冷 风吹干，然后再点第二次。每次点样的位置应完全重合，否