哺乳动物胚胎干细胞多能性和全能性研究进展

包头师范学院
本科学年论文
论文题目：哺乳动物胚胎干细胞多能性和全能性研究进展院系：生物科学与技术学院
专业：生物科学
学号：0911370087
姓名：李巧英
指导教师：图雅
撰写学年：2009 至2010 学年
二零一零年十二月
摘要
本文主要介绍了哺乳类动物胚胎干细胞的一些生物学特性，并着重介绍了它的多能性和全能性，以及多能性或全能性的检测技术。

利用此技术制作嵌合体及嵌合体动物可以为人类器官移植提供实验材料。

胚胎干细胞有着极广的应用范围，本文综述了它在基因、遗传、克隆、体外细胞分化及哺乳动物的个体发育等方面的研究。

但是，由于哺乳动物错综复杂的基因调控和环境因素的影响，对于胚胎干细胞的研究还存在诸多问题，还需作更深入细致的研究。

关键词：胚胎干细胞；全能性；嵌合；分化
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This article mainly introduced the mammalia animal embryonic stem cell's some biology characteristic, and introduced its pluripotent and the totipotency emphatically, as well as pluripotent or totipotency examination technology. May provide the experiment material using this technical manufacture chimaera and the chimaera animal for the humanity organ transplanting. The embryonic stem cell has the extremely broad application scope, this article summarized it in the gene, the heredity, the clone, in vitro cell differentiation and mammal's aspect and so on ontoge- nesis research. But, as a result of the mammal intriguing gene regulation and environmental factor's influence, also has many problems regarding the embryo stem cell's research, but must do more thorough careful research.
Key words：Embryonic stem cell; Totipotency;The Qianmatches ;Divide
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中文摘要 (2)
英文摘要 (3)
引言 (4)
1 胚胎干细胞的生物学特性 (5)
1.1胚胎干细胞的定义 (5)
1.2 胚胎干细胞的形态鉴定 (5)
1.3 胚胎干细胞的全能性或多能性 (5)
1.4胚胎干细胞的体外分化 (6)
1.5胚胎干细胞的遗传稳定性 (6)
2．细胞全能性或多能性检测的方法 (6)
2.1 原核注射技术 (6)
2.2 胚胎嵌合技术 (7)
2.2.1嵌合体制作技术 (7)
2.2.2检测ES细胞在嵌合体表达的方法 (7)
2.3 ES细胞的诱导分化检测技术 (8)
2.4 胚胎干细胞核移植技术 (9)
2.5 免疫学方法鉴定 (9)
3．胚胎干细胞应用前景展望 (9)
3.1胚胎干细胞在哺乳动物个体发育中的研究 (9)
3.2 生产嵌合体动物 (9)
3.3 为发育遗传研究提供实验材料 (9)
3.4.胚胎干细胞是研究体外细胞分化的理想材料 (10)
3.5胚胎干细胞作为外源基因 (10)
3.6克隆动物 (10)
3.7胚胎干细胞用于治疗疾病 (11)
4、胚胎干细胞应用中的争议 (11)
结论 (12)
参考文献 (13)
致谢 (15)
胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ES)是从早期胚胎的内细胞团(Inner cell mass,ICM)或原始生殖细胞(Primordialgerm cells, PGCs)分离出来的具有发育全能性的一种未分化的细胞,它具有与胚胎细胞相似的形态特征及分化潜能。

它一方面保留了所有的发育潜力，在适合的条件下能够分化成多种类型的细胞、组织，将ES细胞移植到动物囊胚后，它可以参与宿主细胞多种组织的构成，形成嵌合体并产生遗传；另一方面，人们可以对ES细胞的基因组进行各种遗传操作。

因此，ES细胞己成为一种研究哺乳动物细胞分化、早期胚胎的发生、基因表达和调控、组织形成过程的基本体系，又是临床移植治疗的新的细胞来源。

将ES细胞分离与克隆技术和分子生物学技术相结合就可将新的遗传物质导入家畜的生殖腺细胞。

通过囊胚注入胚胎干细胞产生嵌合体小鼠，以及最近以培养的细胞群落为供体进行核移植所生产的绵羊所取得的进展都表明了对胚胎干细胞进行遗传操作是对动物生殖细胞进行遗传改造的有效方法之一，该项技术也可成为改良家畜的有效方法。

但是，由于哺乳动物错综复杂的基因调控和环境因素的影响，对于胚胎干细胞的研究还存在诸多问题，还需作更深入细致的研究。

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1.胚胎干细胞的生物学特性
1.1胚胎干细胞的定义
若在显微镜下观察，存活5-7天的胚胎由大约140个细胞所组成，看上去就像黏稠的浆果或花粉粒。

它们通体毛绒绒，相互依偎着呈空心的圆球状，这被称为胚泡。

其外层组织即滋养层，由一层扁平的细胞组成，会发展成胎盘。

胚泡中心的腔称“囊胚腔”，腔内一侧的细胞群即“内细胞团(Inner cell mass,ICM)”，胚胎干细胞便是由此分离培养建系的。

这时的内层细胞尚未决定今后生长发育的走向，但它们均具有“全能性”，亦即可演变为200多种构成从心脏、肝脏、肾到皮肤、神经元等人体中任何一种器官组织的组成细胞。

内层细胞团在形成人的内、中、外三个胚层时开始分化，每个胚层将分别分化形成人体的各种组织器官。

如外胚层将分化为皮肤、眼睛和神经系统等，中胚层将形成骨骼、血液和、肌肉等组织，内胚层将分化为肝、肺和肠等。

由于内细胞群可以发育成完整的个体，因而这些细胞被认为具有发育全能性。

当内细胞群在培养皿培养并传代用于研究时，我们称之为胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ES)[1]。

1.2 胚胎干细胞的形态鉴定
ES细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态,细胞体积小,核大,胞浆少,有1~2个核仁。

ES细胞集落紧密聚集在一起,细胞间隙小,界限不清,形似鸟巢状。

有时,ES 细胞集落周围可见单个ES细胞。

1.3 胚胎干细胞的全能性或多能性
ES细胞象其它细胞一样,可在体外培养、扩增、克隆、冷冻,并且人们可对其进行遗传操作和选择,其本质特性是全能性或多能性。

所谓全能性(Totipotency)是指ES细胞在解除分化抑制的条件下能参与包括生殖腺在内的各种组织的发育潜力,能发育成完整的动物个体[2]。

多能性(Pluripotency)则是指ES细胞具有发育为多种组织的能力,参与部分组织的形成[3]。

ES细胞全能性或多能性的基础是其具有的高度的分化潜能。

细胞分化终究归结为在胚胎发育过程中基因组中的特定基因按一定顺序相继活化和表达。

所以,细胞全能性的实质是细胞基因组中决定蛋白质编码的所有基因按一定顺序表达。

细胞全能性或多能性与细胞分化状态的相对稳定性密切相关。

细胞分化具有相对的稳定性,但在一定条件下,细胞分化又是可逆的。

低等生物细胞和高等动物的早期胚胎细胞具有全能性,但用成年绵羊的乳腺细胞和胎儿成纤维细胞为供体进行核移植生出了绵羊羔,这表明:不但未分化的胚胎细胞具有全能性,已分化的体细胞在特定条件下经过脱分化也具有全能性。

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分化的细胞具有的全能性的前提条件是这种细胞在体外诱导进入休眠状态。

细胞全能性是细胞核基因在不断变化的胞质环境的作用下有次序、有系统地表达的结果,在分化的细胞内存在有可逆性修饰的遗传物质［4］。

但并非所有的体细胞均具有全能性,例如红细胞,在成熟时失去细胞核,丧失了可逆性分化的遗传物质。

1.4胚胎干细胞的体外分化
在特定的体外培养条件下，ES细胞也能分化形成各种细胞系，如造血细胞、肌肉细胞和神经胶质细胞等。

ES细胞体外分化途径和机制与在体胚胎细胞不完全相同，但在分子水平上仍有许多相似之处，因而可将其作为研究各种类型体细胞决定与分化机理等发育生物学问题的新颖的实验模型。

与传统的整体胚胎的研究相比，体外ES细胞具有以下几个优点：(1)ES细胞在体外可分化形成各种终末细胞，这为研究某些前体细胞的起源和特性提供了理想的实验体系；〔2)体外培养系统能定性甚至定量地研究某些细胞因子，胞外基质等因素对细胞生长和分化的影响，避免和减少了整体胚胎研究中各种内源性因素干扰的复杂性；(3)在研究胚胎早期发育中某些必需基因的功能时，在体胚胎的这些基因常发生突变引起胚胎过早地在子宫中死亡，而在体外这些基因突变的ES细胞仍保持存活、增殖和分化的潜能，参与胚胎发育[5]。

因此为研究这些基因在胚胎发育中的功能提供了基本条件。

1.5胚胎干细胞的遗传稳定性
ES细胞在分化的过程中，可以将完整地体现原有的生理特点和结构组成，即基因能够得到完全的表达，具有稳定的遗传性能。

因此，在骨髓移植、肌肉和皮肤等的修复等医学方面具有广阔的前景。

也可在体外对ES细胞进行遗传操作选择，如诱导外源基因，标志基因等制作嵌合体，通常不会改变选择后的ES细胞本身的遗传性能，所以在理论上经遗传操作后的ES细胞仍能保持其扩增、发育的全能性的稳定遗传。

这就可以根据这种性能制备转基因动物个体或基因缺失、突变或过量表达的杂合或纯合个体，以便分析各种基因功能和因的表达调控机制等[6]。

2．细胞全能性或多能性检测的方法
2.1 原核注射技术
将目的基因用显微注射的方法导入受精卵原核中,获取具有标记性状的转基因胚胎。

在体外分化抑制培养转基因胚胎,形成内细胞团,从中分离克隆具有特定标记性状的ES细胞。

以其作供体进行核移植,检测目的基因表达产物,就可对ES 细胞的全能性或多能性进行鉴定。

将这种技术与核移植和胚胎嵌合等技术相结合,
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就可以在ES细胞的功能方面检测其全能性或多能性。

尽管这种转基因技术已成功地应用到小鼠、山羊、绵羊、兔子、猪和牛等动物,但仍存在许多问题,如导入的基因并非全部在细胞期整合形成转基因胚胎；目的基因的随机整合导致其产物发生变化；只有少数简单基因能够表达产物等。

这都限制了该项技术的应用。

2.2 胚胎嵌合技术
嵌合体是指由2个或2个以上受精卵发育成的复合个体。

将早期胚胎未分化的细胞(ES细胞和胞团细胞)导入另一个品种动物的早期胚胎中,可获得嵌合体动物［7］。

如果细胞具有全能性(或多能性),它就可参与受体胚胎的发育,形成组织。

若不参与受体胚胎的发育,注入的细胞就不具备全能性(或多能性)。

2.2.1嵌合体制作技术
（1）聚合法(Aggregation)
将ES细胞,内细胞团细胞或早期的卵裂球与一个或多个去透明带胚胎聚合培养,形成胚胎嵌合体,再通过胚胎移植,使受体妊娠,检测ES细胞参与胚胎发育的情况,就可证明ES细胞是否具有全能性或多能性[8]。

ES细胞与8-16细胞期胚胎嵌合,形成嵌合胚,将嵌合胚进行胚胎移植,生产嵌合鼠。

（2）共同培养法
将裸胚置于浓度为106个/ml的ES细胞悬液中,培养3-4 h,再将聚合胚移入新鲜培养液中过夜,即得嵌合胚[8]。

在体外培养到囊胚阶段,移入受体子宫,使妊娠,并对胚胎或活体后代进行检测,就可证明ES细胞的多能性。

（3）囊胚注射法
用显微注射法将ES细胞直接注射到正常囊胚的胚腔中,使ES细胞与ICM嵌合,形成嵌合胚,并对嵌合胚进行分析,也可证明ES细胞的全能性(或多能性)。

2.2.2用于检测ES细胞在嵌合体表达的方法
(1) 色素分析法
选择2种肤色、毛色差异明显的动物胚胎干细胞与胚胎进行嵌合,观察胎儿或个体的肤色或毛色,若呈现皮毛嵌合体,证明胚胎干细胞参与了胚胎发育,具有多能性。

色素分析法的优点是简单易操作不需任何仪器,仅凭肉眼即可观察到结果。

缺陷是难以检测到其它性状的嵌合［9］。

(2) 生物化学分析法
利用生物化学法、免疫组织化学法分析嵌合体,确定ES细胞在器官或组织中嵌合的表达程度及细胞的分化等。

常用的重要方法是同工酶分析。

首先应选用同
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工酶谱系不同的2种或多种动物,一种做为分离干细胞的供体材料,另一种做为嵌合胚的受体胚胎,将胚胎干细胞与受体胚胎嵌合形成嵌合胚。

如果用电泳方法分析嵌合动物(胚胎)的同工酶,出现2种特异的同工酶带谱,就证明ES细胞参与了胚胎的发育,具有多能性,若只出现一种带谱,则说明不是嵌合体［8］。

（3）利用标记基因检测
利用DNA重组技术将抗药性基因在体外与腺病毒载体相结合,通过腺病毒的感染,使外源基因与ES细胞基因整合形成转基因ES细胞。

将这种ES细胞通过核移植形成重构胚或通过显微注射形成嵌合胚,通过胚胎移植获得的嵌合动物或核移植动物少量组织在含有特定药物的培养基中培养,若能正常增殖,证明ES细胞参与了该组织的形成,具有发育全能性或多能性。

Mitan-k等用这种方法成功地获得了具有抗新霉素的小鼠ES细胞的克隆,丛笑倩等获得了抗秋水仙碱的ES细胞,并产生了嵌合鼠［10］。

（4）生殖细胞系中的嵌合
用携带特定基因的ES细胞制作嵌合体,如果ES细胞参与配子形成,特定基因即可在子代表达。

应用该项技术检测培养细胞全能性应该注意：①培养细胞必须是整倍体；②嵌合现象应广泛存在于各个器官；③所用细胞系以XY型为好；其理由是,在培养过程中XY比XX细胞稳定；XY雄性哺乳动物能在短期内产生大量的后代,便于检测［7］。

2.3 ES细胞的诱导分化检测技术
体外分化试验：①类胚体将ES细胞从饲养层转移到涂有明胶的培养板中(6×106个/10 cm板)培养3 d,待ES细胞集落形成时,用PBS(-)清洗细胞表面,并加入2 ml胰酶,消化2 min。

轻轻摇动培养皿,使细胞成片或成凝集团状离开底层,然后加入过量DMEM+10%NBS培养液中和酶。

将ES细胞团在无饲养层溶液中悬浮培养4-5 d,若形成简单类胚体,就证明培养细胞具有多能性。

②囊状胚体将类胚体在培养液中继续培养8-10 d(每2 d换一次溶液),可形成囊状胚体。

③类胚体贴壁分化将4月龄的类胚体以适当密度在明胶层上培养。

2 d后将贴壁进一步培养发分生分化,形成诸如神经细胞、肌肉细胞等,然后采用组织切片技术进行鉴定。

④定向诱导分化将待测ES细胞培养在无分化抑制因子但有某种定向分化的诱导因子的培养基中,若形成特定的组织,即证明这种细胞具有多能性,用于ES细胞定向诱导分化的试剂主要有维生素A酸(Retinotic acid, RA), DMSO(二甲基亚砜)、六亚甲基乙酰胺(Hexamethylenebis-acctamide)及神经生长因子等。

在实践中,将ES细胞培养在含有RA的培养基中,RA诱导ES细胞分化形成体壁内胚层;用神经生长因子诱导聚集培养的ES细胞,形成有节律性收缩的心肌细胞。

这说明,用定向诱
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导分化的方法,可对ES细胞进行初步鉴定［11］。

体内分化试验将浓度为106个/ml 的ES细胞悬液注射入同源动物皮下,形成混合组织瘤,取瘤块,按常规方法制作组织切片,染色,观察细胞分化情况。

若形成多种组织细胞,就可证明注入的细胞具有多能性。

该方法不需复杂的培养条件,利用动物体稳定的内环境,易于成功［11］。

2.4 胚胎干细胞核移植技术
细胞核移植技术是哺乳类动物胚胎工程的重要组成部分,也是实现同型动物克隆的有效方法。

采用该技术可对移植细胞的全能性进行有效的检测。

将瓜蟾的囊胚细胞移入去核的卵母细胞,获得具有繁殖力的后代,将ICM细胞转入去核卵母细胞形成重构胚,该重构胚可发育至正常仔鼠,此外,家兔、山羊及牛的早期胚胎细胞及ICM的核移植胚胎都能发育成个体［12］。

Campbell等用第三代类ES细胞作核移植,获得4只绵羊,从实践上也证明,用细胞核移植技术进行胚胎干细胞全能性鉴定是可行的。

2.5 免疫学方法鉴定
碱性磷酸酶(AKP)染色或免疫荧光标记是检测ES细胞多能性比较可靠的方法。

ES细胞保持着早期胚胎未分化的特性,其表面含有丰富的AKP及胚胎阶段特异性抗原,采用AKP染色或SSEA免疫荧光标记,ES均表现为阳性反应[13]。

3．胚胎干细胞应用前景展望
3.1胚胎干细胞在哺乳动物个体发育中的研究
由于ES细胞可分化为胚胎的内胚层、中胚层和外胚层中任何一类细胞,于是可将带有遗传标记的ES细胞注入早期胚胎的囊胚腔,通过组织化学染色,了解ES 细胞的分化特点,这就为研究胚胎发育过程中的细胞分化及组织和器官形成的规律,进而研究动物体器官形成的时间、发育过程以及影响的因素等提供了可能［14］。

3.2 生产嵌合体动物
将ES细胞注入受精卵内,或将ES细胞与早期胚胎共同培养形成嵌合胚,再通过胚胎移植产生嵌合体动物,以获得新的性状。

例如,异种动物的嵌合体,可以克服免疫排斥反应,为人类器官移植提供实验材料［15］。

3.3 为发育遗传研究提供实验材料
研究发育突变体需要纯合子型的实验材料。

从同源型胚胎建立的多个干细胞突变株可满足此条件。

将同源干细胞突变株在体外培养,研究它们对发育刺激信号
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的反应能力;也可将突变干细胞注入囊胚中产生嵌合体,研究其分化能力,从而揭示突变基因在发育过程中的作用。

将外源DNA导入ES细胞,研究外源基因在发育中的作用［16］。

例如,用这种方法可以探讨外源基因是在特异阶段表达还是特异组织表达等问题。

如果能建立人类遗传性疾病有关基因的嵌合体模型,研究外源基因在个体发育中的作用,这将为人类遗传病的治疗提供新的技术。

3.4胚胎干细胞是研究体外细胞分化的理想材料
ES细胞在添加抑制因子的培养液中,能够维持不分化的状态。

在培养液中加入分化诱导因子,如牛黄酸、丁酰环腺苷酸等化学物质时,就可以诱导ES细胞向不同类型的组织细胞分化,这为揭示细胞分化和细胞凋亡的机理提供了有效的手段［17］。

3.5胚胎干细胞作为外源基因
导入的重要受体细胞之一随着功能基因组学研究的全面展开，利用胚胎干细胞建立转基因动物的研究热点在基因打靶上，因为这种方法能够将外源基因导入靶细胞染色体上某一特定部位，或使某一基因发生定点突变，实现了外源基因的定点整合。

80年代转基因鼠的产生，使人们致力于建立有效的分析系统来从分子水平上研究不同的生物学问题.到了90年代，通过基因打靶在基因组水平上建立突变体己经成为近年来广泛应用的技术，而建立于ES细胞和基因打靶技术上的复杂的转基因体系无疑得到了普遍的应用.这项新技术对分子生物学、生理学、发育生物学等领域都产生了重大的影响.它不仅可以将一些在发育过程中对动物体通常非必需或可被替代的特定基因敲除(GeneKnockout)，在体进行功能缺失研究;还可以研究基因在不同发育时期中的作用［18］。

这其中最主要的发现是ES细胞系的分离及其未分化状态在体外的永久保持的特性。

并且，这些细胞也能重新植入胚胎内发育成包括生殖系统在内的各种组织。

另外，ES细胞作为一种体外细胞系，提供了一个研究处理整体细胞群的实验体系。

因此，就有可能人为地产生一些基因突变，如对胚胎致死性基因的研究等，也可利用这些突变的基因来克隆产生转基因小鼠，从而建立了基因突变的模型。

此外，在免疫学领域多种遗传背景的ES 细胞系逐渐被发展应用，也建立了许多转基因动
3.6克隆动物
胚胎干细胞在理论上讲可以无限传代和增殖而不失其正常的二倍体基因型和表现型,所以可以对其进行体外培养至早期胚胎进行胚胎移植,在短期内可获得大量基因型和表现型完全相同的个体,这在保护珍稀野生动物方面有着重要意义。

还可对胚胎干细胞进行遗传操作,通过细胞核移植生产遗传修饰性动物,有可能创造新的物种。

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3.7胚胎干细胞用于治疗疾病
目前,胚胎干细胞已经在多种疾病的治疗中发挥着重要的作用。

如帕金森氏综合症是以某些运动障碍(静止性震颤、肌强直、运动迟缓和姿势反射丧失)为临床特征的一组疾病。

发病是由于多巴胺神经系统病变或损伤引起原发性多巴胺缺损。

正常健康状态下,乙酰胆碱和多巴胺的效应之间存在一种平衡状态。

患病时多巴胺减少,打破平衡,导致病人活动障碍。

所以可以在体外培养胚胎干细胞,并定向诱导其分化成生成多巴胺的神经细胞,可望用于治疗帕金森氏综合症［19］。

4.胚胎干细胞应用中的争议
研究和利用胚胎干细胞是当前生物工程领域的核心问题之一。

然而,人类胚胎干细胞的研究工作引起了全世界范围内的很大争议,支持者认为这项研究有助于根治很多疑难杂症,可以利用这项研究诱导胚胎干细胞分化成组织器官进行自体器官移植,以解决在临床医学上存在的器官移植所带来的免疫排斥问题,是一种挽救生命的慈善行为,是科学进步的表现,应该对这项研究予以支持。

而反对者则认为,支持进行胚胎干细胞研究就等于是怂恿他人“扼杀生命”,这是不道德的,违反伦理的。

进行胚胎干细胞研究就必须在胚胎上“大动手脚”,破坏胚胎,而胚胎也是人尚未成形时在子宫的生命形式。

如果这样做就是间接牺牲了一个未来的小生命,所以会惹来很多伦理上的反对和斥责。

更有科学家认为,在培养准备阶段,哪怕是微小的变化都可能导致对移植后的细胞质量造成极大的影响。

出于社会伦理学方面的原因,有些国家甚至明令禁止进行人类胚胎干细胞的研究［20］。

然而无论从基础研究角度来讲,还是从临床应用方面来看,人类胚胎干细胞带给人类的益处远远大于在伦理方面可能造成的负面影响,所以要求展开人类胚胎干细胞研究的呼声也是越来越高。

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结论
经研究得知，虽然胚胎干细胞最伟大的用途首先是作为科学研究，但不管是从研究基础上还是临床应用方面，干细胞研究都有其深远的意义。

由于ES细胞具有全能性和多能性，利用这一特性，将ES细胞移植到动物囊胚后，它可以参与宿主细胞多种组织的构成，形成嵌合体并产生遗传；通过囊胚注入胚胎干细胞产生的嵌合体小鼠表明对胚胎干细胞进行遗传操作是对动物生殖细胞进行遗传改造的有效方法之一。

同时用于遗传操作的胚胎干细胞的多能性或全能性的检测技术，是改良家畜的有效方法。

尽管胚胎干细胞的应用前景较广，但是由于哺乳动物错综复杂的基因调控和环境因素的影响，对于胚胎千细胞的研究还存在诸多问题，还需作更深入细致的研究。

虽说胚胎干细胞最伟大的用途首先是作为科学研究，但不管是从基础研究还是从临床应用方面，干细胞研究都有其深远的意义。

目前科学家已经能在体外以干细胞为种子培育成功一些组织器官，来替代病变或衰老的组织器官。

所以我们应以一种探索性的眼光来对待它。

充分认识存在的问题和严峻的挑战，不断开拓思路，求同存异。

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