实验 SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量
SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量解析
• 5.支持介质的筛孔:支持介质的筛孔大小 对生物大分子的电泳迁移速度有明显的影 响。在筛孔大的介质中泳动速度快,反之 则泳动速度慢。
电泳技术的分类
• 1. 根据电泳中是否使用支持介质分为自由电泳和区带电泳: ①自由电泳不使用支持介质,电泳在溶液中进行。②区带 电泳需使用支持介质,根据支持介质不同可分为醋酸纤维 薄膜电泳、薄层电泳和凝胶电泳等。根据支持介质的装置 形式不同又可分为水平板式电泳、垂直板式电泳、垂直盘 状电泳、毛细管电脉等。 • 2.根据电泳时电压的高低分为高压电泳和常压电泳:①高 压电泳使用的电压在500~1000V,这类电泳分离速度快, 但热效应较大,必须具备冷却装置,主要适用于小分子化 合物的快速分离。②常压电泳使用的电压在500 V以下, 电位梯度为2~10 V /cm。这类电泳的分离速度较慢,但 对电泳设备要求简单。
• 4.电渗:液体在电场中对于固体支持介质 的相对移动称为电渗。由于支持介质表面 存在一些带电基团,如滤纸表面含有羧基, 琼脂含有硫酸基等。这些基团电离后使支 持介质表面带电,吸附一些带相反电荷的 离子在电场作用下向电极方向移动,形成 介质表面溶液的流动。 • 当电渗方向与电泳方向相同时则加快电泳 速度;当电渗方向与电用的示踪剂有溴酚兰和二甲苯青FF。 示踪剂一般与蔗糖、甘油组成上样缓冲液, 蔗糖、甘油可增加溶液密度,使其比重增 加,以确保样品均匀沉入加样孔内。
醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质
【基本原理】 • 本实验用醋酸纤维薄膜作电泳支持物分离血清 蛋白质。血清蛋白质的等电点都小于7.5,在 pH=8.6的巴比妥缓冲溶液中都带有负电荷,在电 场中将向正极移动。由于血清中各蛋白质的等电 点不一,所带净电荷有差异,所以它们的泳动速 率也不同。将微量血清点于薄膜上,通电电泳后, 将薄膜置染色液中使蛋白质固定并染色,可将血 清蛋白质分成5条区带,从正极端起分别为白蛋白、 α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白。
SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量
SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量SDS-PAGE电泳是现代生物学和生物化学研究中最常用的方法之一,可用于测定蛋白质的相对分子质量、纯度和数量等指标。
下面将就SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量进行介绍。
SDS-PAGE电泳的原理:SDS-PAGE电泳是一种基于PAG(聚丙烯酰胺凝胶板)的矩阵上运行的直流凝胶电泳。
相对分子质量(MW)是以电泳迁移距离为单位来表示的。
蛋白质在PAG上被限制在孔道中运动,因此,蛋白质分子迁移距离与分子大小成正比。
通过使用外部标准,可以精确地将样品的迁移距离转换为分子量。
这种分离方法受到电荷和大小作用的影响,电势梯度使带电的蛋白质分子在凝胶中迁移。
SDS-PAGE电泳的过程:SDS-PAGE电泳的过程主要包括:样品加载、电泳和染色步骤。
(1)样品加载:样品的制备:蛋白质样品通常经过还原和变性,以便将所有蛋白质中的二硫键断裂并且在孔道中呈现线性的多聚蛋白质结构。
这需要在治疗过程中对样品添加SDS缓冲液,然后在热水浴或高压下暴露于还原剂,例如2-硫代乙酸(DTT)或β-巯基乙酸(MEA)。
(2)电泳:将处理过的样品通过凝胶基质中的丝状孔道。
随着电场的施加,蛋白质会在SDS凝胶板上自由迁移,从而分离出蛋白系列。
(3)染色:电泳结束后,将凝胶板进行染色。
目前较常用的方法是银染、共染和Coomassie Brilliant Blue染色法。
SDS-PAGE电泳的应用:SDS-PAGE电泳广泛应用于研究蛋白质相对分子质量、活性定量、纯度评估、亚基分离等方面。
其中,蛋白质相对分子质量的测定是SDS-PAGE电泳的最主要应用之一。
通过将未知蛋白与已知分子质量蛋白一起电泳,可以通过线性回归计算未知标本的分子大小。
SDSPAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告
SDS_PAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告实验报告:SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量一、实验目的通过SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)测定蛋白质相对分子质量,了解其基本原理和实验操作流程。
二、实验原理SDS-PAGE是一种常用的测定蛋白质相对分子质量的方法。
它利用十二烷基硫酸钠(SDS)与蛋白质的结合性质,将蛋白质变性并带负电荷,使得蛋白质在电场中的迁移率仅取决于相对分子质量,而与蛋白质的等电点、电荷性质无关。
通过比较标准蛋白质的迁移率和已知相对分子质量的蛋白质,可确定待测蛋白质的相对分子质量。
三、实验步骤1.准备试剂和器材:SDS-PAGE所需试剂包括丙烯酰胺、N-丙基甲基丙烯酰胺、过硫酸铵、甘氨酸、十二烷基硫酸钠、tris缓冲液、G250染料、乙醇等;器材包括电泳槽、制胶板、移液器、电泳仪、电源等。
2.制备标准蛋白样品:选择已知相对分子质量的标准蛋白样品,将其与G250染料混合,煮沸变性,冷却后作为标准蛋白样品。
3.制备样品:将待测蛋白质样品与G250染料混合,加入适量SDS-PAGE缓冲液,煮沸变性,冷却后作为待测样品。
4.制胶:将丙烯酰胺、N-丙基甲基丙烯酰胺、过硫酸铵、甘氨酸、tris缓冲液等混合,倒入制胶板中,插入样品梳子,静置凝固。
5.电泳:将凝胶放入电泳槽中,加入适量电泳液,将标准蛋白样品和待测样品分别加入对应的孔中。
打开电源,调整电流和电压,开始电泳。
6.染色和脱色:电泳结束后,将凝胶取出,用G250染料进行染色,然后进行脱色处理,以呈现清晰蛋白质条带。
7.相对分子质量测定:通过比较标准蛋白样品的迁移率和已知相对分子质量的蛋白样品,可确定待测蛋白质的相对分子质量。
四、结果分析通过本实验,我们成功地得到了SDS-PAGE凝胶电泳图谱,并测定了待测蛋白质的相对分子质量。
通过与标准蛋白样品的迁移率进行比较,发现待测蛋白质的相对分子质量约为50kDa。
此外,我们还发现不同浓度的待测蛋白质样品在凝胶电泳图谱上的条带位置也存在差异,表明它们具有不同的相对分子质量。
SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量
【实验原理】
SDS与蛋白质结合后,还引起蛋白质构象的改变。蛋白 质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明,它们在水溶液中 的形状,近似于雪茄烟形的长椭圆棒。不同蛋白质的SDS复 合物的短轴长度都一样,而长轴则随蛋白质相对分子质量的 大小成正比的变化。这样的蛋白质-SDS复合物在凝胶中的迁 移率,不再受蛋白质原有电荷和形状的影响,而只是椭圆棒 的长度,也就是蛋白质相对分子质量的函数。
【实验步骤】
一、安装垂直板型电泳装置
一、安装垂直板型电泳装置
将装好的电泳装置垂直放置,在长玻璃片下 端与硅胶框交界的缝隙内加入用电极缓冲溶液配 制的1%琼脂糖溶液,待其凝固后,即堵住凝胶 模板下面的窄缝(通电时又可作为盐桥)。
分离胶的配制
10%(ml)
H2O
10
30%丙烯酰胺
10
分离胶缓冲液(pH8.8)
【实验原理】
SDS是一种阴离子型去污剂,在蛋白质溶解液中加入 SDS和巯基乙醇后,巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还 原;SDS能使蛋白质的非共价键(氢键、疏水键)打开,并 结合到蛋白质分子上(在一定条件下,大多数蛋白质与SDS 结合比为1.4 g SDS/g蛋白质),形成蛋白质-SDS复合物。由 于SDS带有大量负电荷,当它与蛋白质结合时,所带的负电 荷的量大大超过了蛋白质原有的电荷量,因而掩盖了不同种 类蛋白质间原有的电荷差异。
剥胶示意图
七、染色和脱色
倾出固定液,加入染色液。染色过夜。 染色完毕,倾出染色液,加入脱色液。数小时 换一次脱色液,直至背景清晰,约需一昼夜。
八、Mr的计算
量出加样端距细铜丝间的距离(cm)以及各蛋白质样品区 带中心与加样端的距离(cm),按下式计算相对迁移率mr:
蛋白质样品迁移距离(cm) 相对迁移率mr = 溴酚蓝区带距加样端距离(cm)
SDS-PAGE电泳法测定蛋白质相对分子质量
实验 6 SDS-PAGE电泳法测定蛋白质相对分子质量实验目的学习并掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法;掌握垂直板电泳的操作方法;运用SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量及染色鉴定。
实验原理1、在聚丙烯酰胺凝胶系统中,加入一定量的十二烷基硫酸钠(SDS),使蛋白样品与SDS结合形成带负电荷的复合物,由于复合物分子量的不同,在电泳中反应出不同的迁移率。
根据标准样品在该系统电泳中所作出的标准曲线,推算出被测蛋白样品分子量的近似值。
2、在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的分子大小和形状以及所带电荷多少等因素所造成的电泳迁移率有差别。
在聚丙烯酰胺凝胶系统中,加入一定量的十二烷基硫酸钠(SDS),形成蛋白质-SDS复合物,这种复合物由于结合了大量的SDS,使蛋白质丧失了原有的电荷状态,形成了仅保持原有分子大小为特征的负离子团块,从而降低或消除了各种蛋白质分子之间的天然的电荷差异,此时,蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小,而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。
3、当蛋白质的分子量在15000~200000之间时,电泳迁移率与分子量的对数值呈直线关系,符合下列方程:㏒10Mr = -b·m R+ K(式中:Mr为蛋白质分子量,m R为相对迁移率,b为斜率,K为截距。
在条件一定时,b 和K均为常数。
)若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图,可获得一条标准曲线。
未知蛋白质在相同条件下进行电泳,根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
实验步骤1.装板:将垂直板型电泳装置内的板状凝胶模子取出,将玻璃片洗净、凉干、嵌入凹槽中,形成一个“夹心”凝胶腔,把装好的凝胶腔置于仰放的电极上槽。
将电泳槽、凝胶模子串成一体的垂直板型电泳装置,垂直放置在水平台面上。
(夹子离梳子底边约2mm)2. 制备分离胶:在烧杯中按下表配制所需浓度的分离胶。
项目分离胶的配制(10ml)30% 丙烯酰胺(ml) 3.4分离胶缓冲液,pH8.8(ml) 2.4H2O (ml) 4.110% 过硫酸铵(ml)0.1TEMED(μl)10凝胶液的灌注和聚合:将所配制的分离胶缓冲液沿着凝胶腔的长玻璃板的内面缓缓注入,然后加乙醇。
SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量
四、实验操作流程
1.安装夹心式垂直板电泳槽 (1)装上贮槽和固定螺丝销钉,仰放在桌面上。 (2) 将长、短玻璃板分别插到凵形硅橡框的凹形槽中,注意勿 用手接触灌胶面的玻璃。 (3) 将已插好玻璃板的凝胶模平放在上贮槽上,短玻璃板应面 对上贮槽。 (4) 将下贮槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上贮槽,双手以对 角线的方式旋紧螺丝帽。 (5) 竖直电泳槽,在长玻璃板下端与硅胶模框交界的缝隙内加 入已融化的 1% 琼脂 ( 糖 ) 。其目的是封住空隙,凝固后的琼 脂(糖)中应避免有气泡。
三、实验用品
仪器:垂直电泳槽;直流稳压电源;50或100μl微量注射器、玻璃板、水 浴锅,染色槽;烧杯;吸量管;常头滴管等。 材料:人血清;原料:低分子量标准蛋白质按照每种蛋白0.5~1mg· ml-1样 品溶解液配制。可配制成单一蛋白质标准液,也可配成混合蛋白质标准液。 试剂: (1)分离胶缓冲液(Tris-HCl缓冲液 PH8.9):取1mol/L盐酸48mL,Tris 36.3g,用无离子水溶解后定容至100mL。 (2)浓缩胶缓冲液(Tris-HCl缓冲液 PH6.7):取1mol/L盐酸48mL, Tris 5.98g,用无离子水溶解后定容至100mL。 (3)30%分离胶贮液:丙烯酰胺(Acr) 30g及N,N’-甲叉双丙烯酰胺 (Bis)0.8g,溶于重蒸水中,最后定容至100ml,过滤后置棕色试剂瓶中, 4℃保存。
4.样品处理及加样 各标准蛋白及待测蛋白都用样品溶解液溶解,使浓 度为0.5~1mg/mL,将其转移到带塞的小离心管中,轻轻 盖上盖子(不要塞紧,以免加热时迸出),在100℃沸水浴 中加热3min,取出冷却后加样。 一般加样体积为10-15μL(即2-10μg蛋白质)。 如样品较稀,可增加加样体积至25 L。用微量注射器小 心将样品通过缓冲液加到凝胶凹形样品槽底部,待所有 凹形样品槽内都加了样品,即可开始电泳。
sds-page测定蛋白质的相对分子量
03 SDS-PAGE测定蛋白质相 对分子量的原理
蛋白质的相对分子量与迁移率的关系
蛋白质在SDS-PAGE电泳中的迁移率 与其相对分子量成反比,即相对分子 量越大,迁移速度越慢。
在电场的作用下,SDS将蛋白质分子 包裹起来,消除了蛋白质分子间的电 荷差异,使相对分子量成为影响迁移 率的唯一因素。
电泳
加样
将准备好的样品用微量移液器加到加 样孔中。
开始电泳
接通电源,开始电泳,注意控制电流 和电压,确保电泳过程稳定。
染色和脱色
染色
电泳结束后,将凝胶取出,放入含有染色液的容器中,染色一定时间,以便观 察蛋白质条带。
脱色
染色完成后,将凝胶取出,放入含有脱色液的容器中,脱色一定时间,以便观 察清晰的蛋白质条带。
将SDS和β-巯基乙醇加入样品中,以促进蛋白 质变性并带上负电荷。
煮沸处理
通过煮沸处理使蛋白质变性,并使SDS充分结合到蛋白质上。
凝胶制备
01
制备分离胶
按照分离胶的配方,将各组分混 合均匀,并迅速注入到玻璃板中 的凹槽内。
聚合凝胶
02
03
制备浓缩胶
加入适量水,使分离胶聚合凝固。
按照浓缩胶的配方,将各组分混 合均匀,并迅速注入到分离胶上。
计算相对分子量时需考虑实验条件、电泳缓冲液、电压等因素的影响,以 确保结果的准确性。
04 SDS-PAGE实验注意事项
避免样品降解
确保样品储存于低温环境
01
在实验过程中,应将未使用的样品保存在低温环境中,以避免
蛋白质降解。
避免样品反复冻融
02
反复冻融会使蛋白质发生变性,影响实验结果,因此应尽量减
SDS-PAGE可用于测定各种相对分子 量范围的蛋白质,从低到高均可。
SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告
SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量一、前言聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳,简称PAGE,是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。
聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成,聚合过程由自由基催化完成。
催化聚合的常用方法有两种:化学聚合法和光聚合法。
化学聚合以过硫酸铵(APS)为催化剂,以四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。
在聚合过程中,TEMED 催化过硫酸铵产生自由基,后者引发丙烯酰胺单体聚合,同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联,从而形成三维网状结构。
PAGE根据其有无浓缩效应,分为连续系统和不连续系统两大类,连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同,带电颗粒在电场作用下,主要靠电荷和分子筛效应。
不连续系统中由于缓冲液离子成分,pH,凝胶浓度及电位梯度的不连续性,带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应,分子筛效应,还具有浓缩效应,因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。
不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。
浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶,凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCl。
分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶,凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCl。
电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。
2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性,这是样品浓缩的主要因素。
SDS是阴离子去污剂,作为变性剂和助溶试剂,它能断裂分子内和分子间的氢键,使分子去折叠,破坏蛋白分子的二、三级结构。
而强还原剂如巯基乙醇,二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。
在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后,分子被解聚成多肽链,解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束,所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量,这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。
SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统,与连续缓冲系统相比,能够有较高的分辨率。
SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量
• 聚丙烯酰胺凝胶的聚合体系有两种: • (1)化学聚合:通常采用过硫酸铵(AP)为催化剂, 四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。在TEMED 催化下,过硫酸铵可使丙烯酰胺单体的双键打开、 活化形成自由基丙烯酰胺,从而引发聚合作用。 • (2)光聚合:通常采用核黄素作催化剂,核黄素 在光照下光解成无色基,后者再被氧化成自由基 而引发聚合作用。光聚合的凝胶孔径较大,而且 随时间延长而逐渐变小,不太稳定。化学聚合的 凝胶孔径较小,且各次制备的重复性好。故一般 采用化学聚合。
四 电泳
• 将上槽接负极,下槽接正极,打开电源, 开始时将电流控制在15~20 mA,待样品进 入分离胶后,改为30~50 mA。待蓝色染 料迁移至下端约1~1.5 cm时,停止电泳, 约需1~2小时。
五 剥胶
取下凝胶模子,将凝胶片取出,滑入一白 瓷盘或大培养皿内,在染料区带的中心插 入细铜丝作为标志。
六 染色和脱色
染色 用一块胶,另一块胶用于转膜。 加入染色液,染色45分钟。 脱色 染色完毕,倾出染色液,加入脱色液。 20~30min换一次脱色液,2~3次后可初步 观察电泳条带,然后脱色过夜,直至背景 清晰。
七 Mr的计算
• 通常以相对迁移率(mr)来表示迁移率。相对迁 移率的计算方法如下:用直尺分别量出样品区带 中心及铜丝与凝胶顶端的距离,按下式计算: • 相对迁移率(mr) = 样品迁移距离(cm)/染料 迁移距离(cm)。 • 以标准蛋白质相对分子质量的对数对相对迁移率 作图,得到标准曲线。根据待测样品的相对迁移 率,从标准曲线上查出其相对分子质量
牛血清 样品2 样品1 蛋白 样品1 marker 样品2 牛血清
第一组加样
第二组加样
第二块胶加样顺序与第一块胶相同
SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量
CH2=CH C=O NH2
CH2=CH
丙烯酰胺
C=O NH CH2
CH2-CH (CH2¯ CH )n CH2-CH( CH2-CH )m CH2-CH C=O C=O C=O NH2 NH NH2 CH2 NH C=O CH2-CH
NH C=O CH2=CH N, N’-甲叉 N’双丙烯酰胺
( CH2-CH )nCH2-CH( CH2-CH )m CH2-CH
当蛋白质的分子量在17,000~165,000之间时, 当蛋白质的分子量在17,000~165,000之间时, 蛋 17,000 之间时 白质-SDS复合物 复合物的电泳迁移率与蛋白质分子量的对 白质-SDS复合物的电泳迁移率与蛋白质分子量的对 数呈线性关系: 数呈线性关系:
lgMW = K - bm
C=O NH2 C=O NH2
化学性质稳定, PAG机械强度好,有弹性,透明,化学性质稳定,改变 机械强度好 Acr浓度或Acr与Bis的比例可以得 不同孔径的凝胶。 Acr浓度或Acr与Bis的比例可以得到不同孔径的凝胶。 浓度或Acr 的比例可以得到 PAGE分为连续系统和不连续系统两大类。 连续系统电 PAGE 分为连续系统和不连续系统两大类。连续系统 电 分为连续系统和不连续系统两大类 泳体系中缓冲液pH值与凝胶中的相同. 泳体系中 缓冲液pH值与凝胶中的相同.带电颗粒在电场 缓冲液 pH 值与凝胶中的相同 作用下,主要靠电荷和分子筛效应 不连续系统中带电 靠电荷和分子筛效应。 作用下,主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中带电 颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应, 颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应,还具 有浓缩效应, 有浓缩效应,因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者 佳。
SDSPAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告
SDSPAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告实验报告:SDS测定蛋白质相对分子质量一、实验目的:通过SDS-技术测定蛋白质的相对分子质量。
二、实验原理:SDS-是一种常用的蛋白质电泳分离技术。
在该技术中,蛋白质样品与SDS(十二烷基硫酸钠)和还原剂混合后,加热可以使蛋白质完全还原并且与SDS结合,形成具有负电荷的复合物。
这些复合物在电场中按照其分子质量大小被分离。
蛋白质样品在SDS-中首先经过堆胶,即在样品中添加聚丙烯酰胺凝胶,蛋白质被沿着凝胶的宽度扩散,形成连续的蛋白质稜。
然后,电泳阶段开始,电场通过凝胶,带动带电的蛋白质稜向阳极迁移。
三、实验步骤:1.准备SDS-电泳胶液:根据使用说明配制3种浓度的聚丙烯酰胺凝胶胶液,即5%堆胶胶液、12%分离胶液和4%扩散胶液。
2. 准备样品:取相应的蛋白质样品,如细胞裂解液,将其与试剂R (含有30%甘油和2%β-巯基乙醇酰胺)和Laemmli试剂混合,以加热破坏蛋白质的二级结构。
3.堆胶:将堆胶胶液慢慢注入电泳槽中,留出足够的空间来注入分离胶液。
4.加载样品:在样品孔中加入相应数量的样品、分子量标记和模板。
5.电泳:将电泳槽连接到电源,调节电压,使电流保持稳定。
首先进行堆胶阶段,然后切换到电泳阶段,直至蛋白质移动到凝胶底部。
6. 凝胶染色:取下凝胶,用凝胶染色剂对凝胶进行染色。
一般常用染色剂有银染和Coomassie蓝染。
四、实验结果:根据实验步骤描述的方法进行实验后,我们观察到在凝胶上出现了多条蛋白质条带,每条条带代表一个蛋白质。
条带的颜色越深,表示其含量越多。
通过与分子量标记的对照,可以确定蛋白质的相对分子质量。
五、实验讨论与分析:根据实验结果,我们可以推断蛋白质的相对分子质量。
相对分子质量可以通过标准曲线法来计算,即通过已知相对分子质量的蛋白质标准品的移动距离与其相对分子质量之间的线性关系来推断未知蛋白质的相对分子质量。
通过SDS-技术测定蛋白质相对分子质量具有许多优点:能够同时分离多个蛋白质;能够对蛋白质进行集中分析;精确测量蛋白质的相对分子质量以及群体分子质量等。
sds-page测定蛋白质相对分子质量原理
sds-page测定蛋白质相对分子质量原理
SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis)是一种常用的蛋白质分析技术,用于测定蛋白质的相对分子质量。
SDS-PAGE原理基于以下几个关键步骤:
1. 蛋白样品的准备:将待测蛋白样品与SDS(十二烷基硫酸钠)混合,使蛋白质表面被负电荷包裹。
2. 样品加载和电泳过程:将蛋白样品加载到聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)中的孔洞中。
通常采用垂直电泳方式进行,将正电极和负电极连接至凝胶两端,通过电场使蛋白质向电泳方向迁移。
3. 分子分离:在电泳过程中,由于SDS的存在,样品中的蛋白质被完全解聚并带负电荷,使每个蛋白质分子的移动速率只与其相对分子质量成正比。
较小的蛋白质能够在凝胶中更快地迁移,较大的蛋白质则移动速率较慢。
4. 染色和可视化:电泳结束后,使用染色剂(如Coomassie蓝染色剂)将蛋白质染色,使其可见。
通过测量蛋白质在凝胶上的迁移距离,可以估计蛋白质的相对分子质量。
总结:SDS-PAGE利用SDS使蛋白质解聚并带负电荷,在电泳过程中按照相对分子质量的大小分离蛋白质,通过染色和测量蛋白质的迁移距离来估计其相对分子质量。
sds-page
一、实验目的:1.1理解SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量的基本原理。
1.2掌握分子电泳的基本步骤,掌握计算蛋白质相对分子质量的方法。
二、实验内容和原理:2.1电泳(electrophoresis):是指带电颗粒在电场中向着与它电性相反的电极移动的现象。
许多重要的生物分子都含有可电离基团(如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等),在非等电点条件下可解离成带有电荷分子,在电场力的作用下,它们向着与其所带电荷相反的电极移动。
电泳技术就是利用样品中各种分子带电性质、分子大小、形状等的差异,在电场中的迁移速度不同,从而对样品进行分离、纯化和鉴定的一种综合技术。
可用于样品的制备、纯度鉴定、分子量测定等。
2.2影响带电粒子在电场中泳动的因素:①生物分子的性质:待分离生物大分子所带电荷的多少、性质、分子大小和形状都会对电泳产生明显影响。
②缓冲液:缓冲液pH值直接影响生物分子的解离程度和带电性质。
溶液pH值距离等电点愈远,生物分子所带净电荷就越多,电泳时速度就越快。
当缓冲液pH大于等电点时,生物分子带负电荷,电泳时向正极移动;当缓冲液pH小于等电点时,生物分子带正电荷,电泳时向负极移动。
③电场强度:电场强度指每单位介质长度的电位梯度(又称电位差或电位降)。
一般而言,电场强度越大,电泳速度越快。
但随着电场强度的增大会引起通过介质的电流强度增大,从而造成电泳过程产生的热量增多,最终导致介质温度升高。
降低电流强度,可以减少产热,但会延长电泳时间,引起生物分子扩散增加,同样影响分离效果。
所以电泳实验中要选择适当的电场强度。
④电渗:液体在电场中对于固体支持介质的相对移动称为电渗。
由于支持介质表面存在一些带电基团,如滤纸表面含有羧基,琼脂含有硫酸基等。
这些基团电离后使支持介质表面带电,吸附一些带相反电荷的离子在电场作用下向电极方向移动,形成介质表面溶液的流动。
当电渗方向与电泳方向相同时则加快电泳速度;当电渗方向与电泳方向相反时,则降低电泳速度。
SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量
【实验原理】
SDS是一种阴离子型去污剂,在蛋白质溶解液中加入 SDS和巯基乙醇后,巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还 原;SDS能使蛋白质的非共价键(氢键、疏水键)打开,并 结合到蛋白质分子上(在一定条件下,大多数蛋白质与SDS 结合比为1.4 g SDS/g蛋白质),形成蛋白质-SDS复合物。由 于SDS带有大量负电荷,当它与蛋白质结合时,所带的负电 荷的量大大超过了蛋白质原有的电荷量,因而掩盖了不同种 类蛋白质间原有的电荷差异。
7.5
10% SDS
0.3
TEMED 10%过硫酸铵
总体积
0.03 0.1 30ml
二、凝胶的制备
1、分离胶的制备 将所配制的凝胶溶液沿着凝胶的长玻璃片的内 面用细长头的滴管加至长、短玻璃片的窄缝内, 加胶高度距样品槽模板下缘约2 cm。用滴管沿玻 璃片内壁加一层蒸馏水(用于隔绝空气,使胶面 平整),约30-60 min凝胶完全聚合,用滴管吸去 分离胶胶面的水封层,并用无毛边的滤纸片吸去 残留的水液。
五、电泳
将上槽接负极,下槽接正极,打开电源,开 始时将电流调为20 mA,待样品进入分离胶后,改 为50 mA。待蓝色染料迁移至下端约2 cm时,停止 电泳,约需3-4 h。
浓缩胶浓缩 示意图
六、剥胶和固定
取下凝胶模子,将凝胶片取出,滑入一大培 养皿内,从凝胶板上切下一角作为加样标记,在 两侧溴酚蓝染料区带中心,插入细铜丝作为前沿 标记。加入固定液(应没过凝胶片),固定2 h或 过夜。
以标准蛋白质相对分子质量的对数对相对迁移率作图, 得到标准曲线。根据待测样品的相对迁移率,从标准曲线 上查出其相对分子质量。标准蛋白质相对分子质量从大到 小依次为116, 66.2, 45, 35, 25, 18.4, 14.4 KDa。
SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量
6 、染色与脱色 电泳结束后,取下玻板,在自来水下用特制板撬开短 玻璃板,从凝胶板上切下一角作为加样标记,在两侧溴 酚蓝染料区带中心,插入细铜丝作为前沿标记。加入染 色液染色60 mins,再用脱色液脱色,直至蛋白质区带 清晰,即可计算相对迁移率。
7、 结果处理 量出加样端距细铜丝间的距离(cm)以及各蛋白质样品区 带中心与加样端的距离(cm),按下式计算相对迁移率mR:
有许多蛋白质是由亚基或两条以上肽链组成的,它们在 SDS和巯基乙醇作用下,解离成亚基或单条肽链,因此 这一类蛋白质,测定的只是亚基或单条肽链的MW。
蛋白质分子结合SDS阴离子后,所带负电荷的量远远超 过了它原有的净电荷,从而消除了不同种蛋白质之间所 带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基 的相对分子质量。而与其所带电荷的性质无关。
相对迁移率mR=
蛋白质样品迁移距离(cm) 溴酚蓝区带距加样端距离(cm)
【思考题】
1、在上样缓冲液中SDS、巯基乙醇、甘油及溴 酚兰的作用分别是什么?
2、在SDS-PAGE中,分离胶中的TEMED和AP的 作用是什么?
3、样品液为何在加样前需在沸水中加热几分钟?
【SDS-PAGE基本原理】
SDS-PAGE 是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙 醇的样品处理液,SDS是一种很强的阴离子表面活性剂, 它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的 二级和三级结构。
强还原剂巯基乙醇可以断开二硫键破坏蛋白质的四级 结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解 聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS 复合物。
轻轻插入梳齿至浓缩胶内,避免带入气泡。约 30min后凝胶聚合。
3、蛋白质样品的处理
1)标准蛋白质样品的处理 低分子量标准蛋白试剂盒:兔磷酸化酶B MW=97,400
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有许多蛋白质是由亚基或两条以上肽链组成的,它们在
SDS和巯基乙醇作用下,解离成亚基或单条肽链,因此
这一类蛋白质,测定的只是亚基或单条肽链的MW。 蛋白质分子结合SDS阴离子后,所带负电荷的量远远超
过了它原有的净电荷,从而消除了不同种蛋白质之间所 带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基 的相对分子质量。而与其所带电荷的性质无关。
CH2=CH
C=O NH2
CH2=CH
丙烯酰胺
C=O NH CH2
CH2-CH (CH2¯ CH )n CH2-CH( CH2-CH )m CH2-CH C=O NH2 C=O NH CH2 NH C=O C=O NH2
NH C=O CH2=CH N, N’-甲叉 双丙烯酰胺
CH2-CH ( CH2-CH )nCH2-CH( CH2-CH )m CH2-CH
当蛋白质的分子量在17,000~165,000之间时, 蛋 白质-SDS复合物的电泳迁移率与蛋白质分子量的对 数呈线性关系:
lgMW = K - bm
将已知分子量的标准蛋白质在SDS-PAGE 中的电泳迁
移率对分子量的对数作图,即可得到一条标准曲线。
只要测得未知分子量的蛋白质在相同条件下的电泳迁 移率,就能根据标准曲线求得其分子量。
【操作方法】
1、垂直板电泳槽
2、凝胶的制备
1)分离胶的制备
配制12%分离胶。在烧杯中依次加入重蒸水3.35ml,分离胶 缓冲液2.5ml,10%SDS 0.1ml,凝胶储备液4.0ml,10% 过硫酸铵
50ul和TEMED 10ul(两块胶的量)。由于AP和TEMED相遇后凝
胶即开始聚合,所以应立即混匀混合液,用移液枪抽取凝胶液 加至长、短玻璃板间的窄缝内,灌满后小心插入梳齿,避免混
SDS-PAGE测定蛋白质
相对分子质量
【目的要求】
学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。 掌握垂直板电泳的操作方法。 运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴 定。
【实验原理】
电泳
PAGE
带电颗粒在电场作用下,向着与其电荷相反的电
聚丙烯酰胺凝胶(PAG)是由单体丙烯酰胺(Acr)
极移动的现象。 和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂四甲基乙二胺 (TEMED)和引发剂过硫酸铵(AP) 的作用下聚合交联而成 的三维网状结构的凝胶。以此凝胶作为支持介质的电泳 称为PAGE。 PAGE具有电泳和分子筛的双重作用。
入气泡,37℃烘箱下聚合(约30 min)。
3、蛋白质样品的处理
1)标准蛋白质样品的处理 低分子量标准蛋白试剂盒:兔磷酸化酶B 牛血清白蛋白 牛碳酸酐酶 胰蛋白酶抑制剂 鸡蛋清溶菌酶 开封后,沸水浴中加热3-5min后上样。 MW=97,400 MW=66,200 MW=31,000 MW=20,100 MW=14,400
相对迁移率mR= 蛋白质样品迁移距离(cm) 溴酚蓝区带距加样端距离(cm)
【思考题】 1、在上样缓冲液中SDS、巯基乙醇、甘油及溴
酚兰的作用分别是什么?
2、在SDS-PAGE中,分离胶中的TEMED和AP的作用
是什么?
3、样品液为何在加样前需在沸水中加热几分钟?
Staking gelຫໍສະໝຸດ Separating gel
2)样液的准备
用移液枪小心吸取处理好的血清50ul至1.5ml
的离心管中,再加入50ul上样缓冲液,混匀后
沸水浴中加热3min,取出冷却后加样。
4、加样
用移液器分别取10 l样品液,小心将样品 加到凝胶凹形样品槽底部。 5、电泳 将电泳仪的正负极与电泳槽正负极相连接, 打开电泳仪开关,设置电压为110V,电泳 80mins,此时溴酚蓝染料达到凝胶底部,停止电 泳,关闭电源。
C=O NH2 C=O NH2
聚丙烯酰胺
PAG机械强度好,有弹性,透明,化学性质稳定,改变
Acr浓度或Acr与Bis的比例可以得到不同孔径的凝胶。
PAGE分为连续系统和不连续系统两大类。连续系统电 泳体系中缓冲液pH值与凝胶中的相同.带电颗粒在电场
作用下,主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中带电
颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应,还具 有浓缩效应,因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者
佳。
【SDS-PAGE基本原理】
SDS-PAGE 是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的 样品处理液,SDS是一种很强的阴离子表面活性剂,它 可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二 级和三级结构。
强还原剂巯基乙醇可以断开二硫键破坏蛋白质的四级 结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解 聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS 复合物。
6 、染色与脱色 电泳结束后,取下玻板,在自来水下用特制板撬开 短玻璃板,从凝胶板上切下一角作为加样标记,在两侧 溴酚蓝染料区带中心,插入细铜丝作为前沿标记。加入 染色液染色60 mins,再用脱色液脱色,直至蛋白质区 带清晰,即可计算相对迁移率。
7、 结果处理 量出加样端距细铜丝间的距离(cm)以及各蛋白质样品 区带中心与加样端的距离(cm),按下式计算相对迁移率mR :