(完整版)基于CHO细胞的单抗生产2
CHO细胞无血清培养基技术手册
(1)无血清培养基，为一般意义上无血清培养基，用各类可替代血清功能的生物材料配制细胞培养基，如牛血清白蛋白(BSA)、转铁蛋白、胰岛素等生物大分子物质，以及从血清中提取的去除蛋白质的混合脂类以及水解蛋白等。其特点是培养基中的蛋白含量较高,添加物质的化学成分不明确，其中含有大量的动物来源蛋白。
5 CHO细胞无血清无动物组分培养基（SAF-CHO-G-004）
其实个性化培养基并不新鲜，在国外生物制药企业普遍采用个性化培养基，世界著名的生物制药公司（如Amgen、Genetech）往往和培养基企业合作，通过细胞培养基的客户定制方式，研制最适合自身细胞特点的个性化细胞培养基应用于生产实践，用于提高细胞产率和生产效率。另有数据显示，国际上的细胞培养基生产企业，个性化、定制培养基占其培养基业务的90%以上，目录培养基不足10%。
ATCC提供的CHO/dhfr-细胞照片
2 CHO细胞表达系统的优势与特点
由于哺乳动物细胞结构、功能和基因表达调控的复杂性，外源基因在哺乳动物细胞中的表达与在原核生物中的表达存在较大差异，因而外源基因在哺乳动物细胞中高效表达所需的元件也不同于在原核生物细胞中的表达所需的元件。外源基因在哺乳动物细胞中的表达包括基因的转录、mRNA翻译及翻译后蛋白质的加工等过程，如蛋白质的糖基化、磷酸化、寡聚体的形成以及蛋白质分子内或分子间二硫键的形成等比较复杂，要表达具有生物学功能的蛋白质如膜蛋白、抗体和具有特异性催化功能的酶需要在哺乳动物细胞中进行。
其它
无水葡萄糖、HEPES、丙酮酸钠、亚油酸、硫辛酸、胰岛素、亚硒酸钠、植物蛋白等
浅析单抗原液的生产工艺
浅析单抗原液的生产工艺单抗即单克隆抗体，是通过将抗原注入到宿主动物体内启动机体免疫应答而产生的。
单抗药物在病毒性疾病、自身免疫性疾病、恶性肿瘤及烈性传染病的防治领域有着突出的作用。
单抗都是采用哺乳动物细胞进行表达，主要以中国仓鼠卵巢细胞系（CHO）为主。
在抗体纯化过程中除了要考虑回收率和纯度以外，还需有效的灭活和清除病毒。
单抗原液车间生产的原液不适用热力灭菌工艺，通常选择无菌操作的非最终灭菌生产工艺。
单抗生产中病毒污染风险：CHO细胞系是制造许多治疗性蛋白质的主力。
CHO细胞的生物安全等级为一级，CHO本身存在内源性逆转录病毒，这是已经被证实了的，但这种病毒对人类不具有致病性。
从药物质量安全角度出发，遵循SFDA 公布的《人用单克隆抗体质量控制技术指导原则》，加入病毒去除和灭活方法。
此外，基于哺乳动物细胞进行的培养发酵，产品被病毒污染是考虑的主要生产风险之一。
病毒污染的其他潜在来源可能还有：使用已经被污染了的主细胞种子库或工作细胞种子库；操作员可能带进病毒，污染工艺；细胞线残留上一级仍有活力的病毒。
因为哺乳动物细胞为带入的病毒污染物提供了合适的宿主细胞，因此病毒量可能会随着细胞培养而放大，进而可能增加生产过程的整体风险。
单克隆抗体药品生产通常包含四个模块：上游培养、下游纯化、分析质控和制剂。
单抗的生产工艺：单抗原液的生产工艺主要概括为两个阶段：上游细胞的培养、发酵和下游的纯化。
细胞种子经摇瓶、WAVE反应器、一、二、三级种子培养扩增后进入发酵罐进行发酵培养。
发酵结束后经离心机进入下游进行纯化。
离心后的料液经过层析、超滤后变成原液。
具体的工艺流程描述如下：（1）细胞复苏：细胞复苏和冻存讲究“慢冻快溶”，复苏时一定要将冻存在液氮或-80℃中凝固的细胞冻存液快速融化至37℃，使胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。
（2）细胞传代培养：①悬浮细胞培养：是指细胞在培养液中呈悬浮状态进行生长繁殖，能连续培养和连续收获的培养技术。
贝伐单抗注射液生产工艺 (2)
贝伐单抗注射液生产工艺
贝伐单抗（bevacizumab）是一种人源化抗体，主要用于
治疗多种肿瘤。
以下是贝伐单抗注射液的生产工艺：
1. 细胞培养：贝伐单抗是通过基因工程技术生产的。
首先，将贝伐单抗的基因导入到哺乳动物细胞（通常是CHO细胞）中，并在培养基中培养细胞。
2. 收获和纯化：培养一段时间后，细胞会产生贝伐单抗。
收获细胞培养物后，通过离心和过滤等步骤去除细胞残渣
和杂质。
3. 纯化：采用亲和层析、逆流层析、离子交换层析等技术
对细胞培养物进行纯化，去除其他蛋白质和杂质，获得纯
化后的贝伐单抗。
4. 调配和灭菌：将纯化后的贝伐单抗溶解在适当的缓冲液中，并进行必要的调整。
然后，通过过滤和灭菌步骤，确
保制剂的无菌性。
5. 填充和封闭：将灭菌的贝伐单抗注射液填充到注射器或
瓶中，并进行密封，确保制剂的品质稳定性和无菌性。
6. 包装和贮存：对填充和封闭的贝伐单抗注射液进行包装，一般是将多个注射器或瓶装在一个纸盒中，方便运输和贮存。
贝伐单抗注射液通常需在低温下贮存，以保持其活性
和稳定性。
值得注意的是，以上工艺仅为一种可能的贝伐单抗注射液
生产工艺，具体的工艺细节可能会因生产厂家和国家的要
求而有所差异。
同时，贝伐单抗注射液的生产还需要遵守
相关的法规和质量控制标准，以保障产品的质量和安全性。
基于CHO细胞的单抗生产PPT
单克隆拍照系统
FDA目前对于单克隆证明方法意见
克隆性
FISH不但可用于已知基因或序列的染色体定位，而且也可用于未克隆基因或遗传 标记及染色体畸变的研究。在基因定性、定量、整合、表达等方面的研究中颇 具优势。
筛选检定
细胞代次的规定
细胞库的相关法规要求
细胞库的相关法规要求
➢ ClonePix /Cell Xpress TM 克隆筛选及细胞表达系统
➢ Limiting dilution 有限稀释法
筛选方法
➢ Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)-Based Screening
The cold capture method used in FACS where fluorescently labeled antibodies bind to secreted
载体的一般性构成
1、IRES：即内部核糖体进入位点，是一段核酸序列，它的存在能够使蛋白质翻
译起始不依赖于5‘帽结构，从而使直接从信使RNA（mRNA）中间起始翻译成 为可能。通常来讲，真核生物翻译只能从mRNA的5‘端开始，因为翻译起始必 须依赖于5’端的帽子结构。
2、Promoters：即启动子，控制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度，启 动子本身并不控制基因活动，而是通过与称为转录因子（transcription factor）的这种蛋白质（proteins）结合而控制基因活动的 抗体序列需使用强启动子如SV40启动子等 而抗性基因需要使用削弱的启动子
基于CHO细胞的单抗生产（第一版）
汪洋 2018/02
目录
• CHO细胞的构建 • CHO细胞的表达 • CHO细胞表达后的产物纯化
依奇珠单抗注射液Ixekizumab-详细说明书与重点
依奇珠单抗注射液Ixekizumab 英文名：Ixekizumab Injection汉语拼音：yi qi zhu dan kang zhu she ye【成份】活性成份：依奇珠单抗(由CHO细胞生产的重组人源化单克隆抗体)辅料:枸橼酸钠、无水枸橄酸、氯化钠、聚山梨酯80、注射用水【性状】本品为澄清至乳光，无色至微黄色至微棕色溶液，基本无可见颗粒。
【适应症】本品用于治疗适合系统治疗或光疗的中度至重度斑块型银屑病成人患者。
【规格】80mg/mL(自动注射器)【用法用量】本品应在具有诊断和治疗本品适应症经验的医师指导和监督下使用。
剂量:推荐剂量为在第0周皮下注射160mg(80mg注射两次)，之后分别在第2、4、6、8、10和12周各注射80mg(注射一次)，然后维持剂量为80mg(注射一次)每4周一次。
老年患者(≥65岁)无需调整剂量(参见[药代动力学])。
年龄≥75岁受试者的信息有限。
肾脏或肝脏损害：本品尚未在这些患者群体中开展研究。
无法提出剂量建议。
儿童：对于6至18岁的儿童和青少年，本品用于治疗中度至重度斑块型银屑病的安全性和有效性尚未建立。
尚无数据。
在6岁以下儿童中没有使用本品治疗中度至重度斑块型银屑病的经验。
给药方法：皮下给药。
本品用于皮下注射。
应轮换使用注射部位。
如果可能，应避免将银屑病受累皮肤作为注射部位。
不得剧烈摇晃溶液/自动注射器。
经过适当的皮下注射技术培训后，如果医护人员确定适当的话，患者可以自行注射依奇珠单抗。
但是，医师应确保对患者进行适当的随访。
包装说明书中包含全面的使用说明。
【不良反应】安全性摘要报告频率最高的药物不良反应(ADR)是注射部位反应和上呼吸道感染(鼻咽炎最为常见)。
不良反应列表：按MedDRA系统器官分类列出来自临床研究和上市报告（表1）的ADR。
在每个系统器官类别中，按发生频率排序ADR，发生频率最高的排列在前。
在同一排列组中，按严重程度降序排列药物不良反应。
贝伐珠单抗生产工艺
贝伐珠单抗生产工艺贝伐珠单抗（Bevacizumab）是一种抗血管内皮生长因子（VEGF）的人源化单克隆抗体。
它被广泛应用于多种癌症的治疗，特别是结直肠癌、肺癌和乳腺癌等实体肿瘤的治疗中。
本文将介绍贝伐珠单抗的生产工艺。
贝伐珠单抗的生产工艺主要包括以下几个步骤：细胞株的建立、发酵过程、纯化过程和灭活处理。
第一步，细胞株的建立。
贝伐珠单抗的生产需要建立一个稳定的细胞株，用于大规模生产抗体。
一般选择哺乳动物细胞，如CHO（中国仓鼠卵巢）细胞或NS0（鼠骨髓瘤）细胞作为生产细胞株。
细胞株的选用需要考虑细胞的生长特性、表达能力和稳定性等因素。
第二步，发酵过程。
在发酵过程中，选用经过基因工程改造的细胞株，通过培养基中添加适当的营养物质和生长因子，使细胞进行大规模培养和繁殖。
随着细胞的生长，它们会分泌出贝伐珠单抗。
发酵过程中需要控制培养基的温度、pH值、溶氧量等参数，以促进细胞生长和抗体的产生。
第三步，纯化过程。
在纯化过程中，首先对培养液进行初步的固液分离，去除细胞碎片和大分子杂质。
然后使用亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤等技术，对贝伐珠单抗进行进一步的纯化。
最后，使用高效液相色谱技术对纯化后的贝伐珠单抗进行最终的纯度检验。
第四步，灭活处理。
贝伐珠单抗属于生物制剂，具有一定的活性。
为了确保其安全性和稳定性，需要进行灭活处理。
常用的方法是使用化学试剂或高温等方式对贝伐珠单抗进行灭活，以杀死残留的活性细胞和病毒等。
贝伐珠单抗的生产工艺需要严格控制各个环节的条件和参数，以确保产品的质量和效力。
在生产过程中，需要进行多次的质量控制和检验，包括细胞株的鉴定、培养液的分析、抗体的纯度和活性的检测等。
同时，需要遵守相关的药品生产规范和质量管理体系，确保产品的安全性和可靠性。
贝伐珠单抗的生产工艺在不断地优化和改进中，旨在提高产量和纯度，降低成本和污染物的生成。
随着生物技术的不断发展和成熟，相信贝伐珠单抗的生产工艺将会进一步完善，为更多患者提供有效的治疗选择。
单抗生产工艺流程
单抗生产工艺流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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单抗制备流程
单抗制备流程引言：单抗（monoclonal antibody）是一种由单一克隆的B细胞分泌的抗体，具有高度特异性和亲和力。
单抗制备是一项重要的生物制药技术，广泛应用于疾病的诊断、治疗和科研领域。
本文将介绍单抗制备的基本流程。
一、免疫原的选择与免疫动物的筛选在单抗制备的第一步，需要选择合适的免疫原。
免疫原可以是一种蛋白质、多肽或糖类分子，其选择应基于所需单抗的特异性和目标。
然后，在免疫动物的筛选过程中，需要选择适合的物种和品系，常用的免疫动物包括小鼠、大鼠和兔子等。
二、免疫原的免疫和混合细胞制备免疫原的免疫是单抗制备的核心步骤之一。
将免疫原与适当的佐剂混合，通过注射到免疫动物体内，诱导其产生特异性抗体。
为了提高抗原的免疫原性，可以采用多次免疫的方法。
在免疫期间，可以定期采集血液样本，检测抗体的产生情况。
三、细胞融合和杂交瘤的筛选细胞融合是单抗制备的关键步骤之一。
将免疫动物的脾细胞与肿瘤细胞进行融合，得到杂交瘤细胞。
融合细胞的筛选是为了选择产生特异性单抗的杂交瘤细胞。
常用的筛选方法包括HAT培养基筛选和ELISA检测。
四、单克隆细胞的培养与扩增经过筛选的杂交瘤细胞需要进行单克隆细胞的培养与扩增。
将杂交瘤细胞进行有限稀释，使其单个细胞分布在培养皿中。
通过培养和观察细胞的生长情况，筛选出单个克隆细胞。
五、单抗的纯化与鉴定单克隆细胞培养后，需要对其产生的单抗进行纯化和鉴定。
常用的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤等。
通过这些方法，可以将单抗从其他蛋白质和杂质中分离出来。
鉴定单抗的方法包括SDS-PAGE、Western blot和ELISA等。
六、单抗的应用和开发获得纯化的单抗后，可以进行进一步的应用和开发。
单抗可以用于疾病的诊断、治疗和预防。
在药物开发领域，单抗也被广泛应用于新药研发和临床试验。
结论：单抗制备流程是一个复杂而精细的过程，需要经过免疫原的选择与免疫动物的筛选、免疫原的免疫和混合细胞制备、细胞融合和杂交瘤的筛选、单克隆细胞的培养与扩增、单抗的纯化与鉴定等多个步骤。
单抗大规模生产工艺流程
单抗大规模生产工艺流程
单抗是一种重要的生物制剂，广泛应用于治疗癌症、自身免疫
性疾病等领域。
为了满足市场需求，大规模生产单抗需要高效的工
艺流程。
下面将介绍单抗大规模生产的工艺流程。
1. 细胞培养。
单抗的生产通常采用哺乳动物细胞作为生产细胞，如CHO细胞、NS0细胞等。
细胞培养是单抗生产的第一步，需要提供适当的培养
基和培养条件，以保证细胞的生长和表达单抗的稳定性。
2. 蛋白表达。
经过细胞培养后，细胞内的基因会被转录和翻译成蛋白质，其
中包括目标单抗。
在这一阶段，需要确保细胞表达单抗的效率和稳
定性，通常需要对培养条件、细胞株和转染方法进行优化。
3. 纯化。
经过蛋白表达后，需要对细胞培养上清液进行纯化，以去除杂
质和提纯单抗。
通常采用亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤等多种技术进行单抗的纯化。
4. 结构鉴定。
对纯化后的单抗进行结构鉴定，包括质谱分析、氨基酸序列分析等，以确保单抗的结构完整性和稳定性。
5. 储存和包装。
最后，对单抗进行储存和包装，通常采用低温冷冻保存，以确保单抗的稳定性和长期保存。
综上所述，单抗大规模生产的工艺流程包括细胞培养、蛋白表达、纯化、结构鉴定和储存包装等多个步骤。
通过优化工艺流程和技术手段，可以实现高效、稳定的单抗生产，满足市场需求。
曲妥珠单抗生产工艺
曲妥珠单抗生产工艺
曲妥珠单抗是一种用于治疗乳腺癌和胃癌等恶性肿瘤的药物，其生产工艺包括以下步骤：
1. 培养细胞：首先，选取一种特定的生物工程细胞株（如
CHO细胞），并将其培养在合适的培养基中，提供充足的养
分和适宜的环境条件，以促进细胞生长和增殖。
2. 培养基优化：通过对培养基成分和条件的调整，优化细胞生长和抗体产量，包括提供合适的营养物质、调节pH值和温度、维持充足的氧气和二氧化碳供应等。
3. 表达向量构建：将含有曲妥珠单抗基因的表达向量构建入细胞株中，使其能够稳定产生和分泌曲妥珠单抗。
4. 细胞培养和扩增：将含表达曲妥珠单抗基因的细胞株进行大规模培养和扩增，以获得足够数量的细胞数量以及相应的曲妥珠单抗产量。
5. 收获和纯化：当细胞达到最佳生长状态并产生足够的曲妥珠单抗时，通过离心分离细胞和培养基，获得细胞上清液中的曲妥珠单抗。
6. 纯化和浓缩：对细胞上清液进行一系列的过滤、纯化和浓缩步骤，去除杂质并提高曲妥珠单抗的纯度和浓度。
7. 检测和分析：对纯化后的曲妥珠单抗进行质量控制和分析，
包括抗体浓度、纯度、活性等的检测，以确保产品符合质量标准。
8. 灭菌和填充：将符合质量要求的曲妥珠单抗进行灭菌处理，然后进行产品容器的填充和封闭，确保产品的无菌和长久的保存。
9. 包装和标签：对灭菌和填充后的曲妥珠单抗产品进行包装和标签，以便于使用和追溯。
以上是曲妥珠单抗的生产工艺的一般步骤，实际生产中可能还涉及其他的工艺细节和检测要求，供应商会根据具体情况进行调整和优化。
CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)表达系统
CHO细胞（中国仓鼠卵巢细胞）表达系统CHO细胞表达系统原理分子生物学、分子免疫学等学科的发展使基因工程疫苗具有越来越重要的地位。
在基因工程疫苗研究的动物细胞表达系统中，最具代表性的就是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)。
它是用来表达外源蛋白最多也最成功的一类细胞。
本文就CHO细胞表达系统在疫苗研制中的应用做一综述。
CHO细胞表达体系及其特点诞生于70年代末的基因工程药物因其具有其他药物无法比拟的优点，已迅速成为制药工业中一个引人瞩目的领域。
1995年美国基因工程药物销售额约为48亿美元，1997年超过60亿美元，年增长率达20％以上。
各国政府将其视为新的经济增长热点而给予了大力支持。
基因工程药物研究与开发的主要环节包括：①基因的克隆和基因工程菌的构造；②重组细胞的培养；③目的产物的分离纯化等。
针对这些主要环节，研究人员正致力于高效表达、培养工艺及下游分离纯化等方面的研究。
随着基因工程技术的不断发展，目前已有多种表达系统可用于生产具有医疗价值的人或动物来源的蛋白质(表1)。
大肠杆菌(E.coli)是使用最早的表达系统，其显著优点是易于操作，产量高，成本低，但由于用E.coli生产的蛋白质药物因缺乏糖基化而在人体内易被降解，因此它的药放大大降低。
此外，它还存在易产生内毒素和包涵体的问题。
真核细胞中CHO细胞是目前重组糖基蛋白生产的首选体系；因为与其他表达系统相比，它具有许多优点：①具有准确的转录后修饰功能，表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子；②具有产物胞外分越功能，便于下游产物分离纯化；③具有重组基因的高效扩增和表达能力；④具有贴壁生长特性，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力，可以进行悬浮培养，表达水平较高；⑤CHO细胞属于成纤维细胞(fibroblast)，很少分泌自身的内源蛋白，利于外源蛋白的启分离。
但CHO细胞培养成本高，条件难掌握，易污染，在一定程度上影响了它的广泛应用。
阿达木单抗生产工艺
阿达木单抗生产工艺一、引言阿达木单抗是一种人源化的单克隆抗体，用于治疗不同类型的癌症。
本文将介绍阿达木单抗生产工艺，包括细胞培养、纯化和质量控制等方面。
二、细胞培养1. 细胞株选取阿达木单抗的生产需要使用CHO（Chinese Hamster Ovary）细胞株。
CHO细胞具有高度稳定性和良好的生长特性，适合大规模生产。
2. 培养基配制CHO细胞培养需要使用含有足够营养物质的培养基。
常用的培养基包括DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）和F-12（Ham's F-12 Nutrient Mixture）。
在培养基中添加适当浓度的血清和其他营养物质可以促进细胞生长。
3. 细胞培养条件CHO细胞需要在37℃、5% CO2下进行培养，通常采用滚动式或搅拌式培养罐进行大规模生产。
为了保证细胞的健康和稳定性，需要定期更换新鲜的培养基，并控制细胞密度和培养时间。
4. 转染为了生产阿达木单抗，需要将CHO细胞转染成含有阿达木单抗基因的质粒。
常用的转染方法包括电穿孔法、磷酸钙共沉淀法和聚乙烯醇法等。
三、纯化1. 细胞收获当CHO细胞达到一定密度后，可以进行细胞收获。
首先需要将细胞培养液离心分离，然后使用盐溶液或其他方法破坏细胞膜，释放出阿达木单抗。
2. 亲和层析亲和层析是一种常用的纯化方法，可以通过特定的亲和剂选择性地捕获目标分子。
对于阿达木单抗的纯化，可以使用含有Protein A或Protein G的树脂进行亲和层析。
3. 离子交换层析离子交换层析是一种基于分子带电性质进行分离的方法。
对于阿达木单抗的纯化，可以使用弱阳离子交换树脂进行分离和富集。
4. 尺寸排除层析尺寸排除层析是一种基于分子大小进行分离的方法。
对于阿达木单抗的纯化，可以使用分子量筛选树脂进行富集和纯化。
四、质量控制1. 阿达木单抗鉴定在生产过程中，需要对阿达木单抗进行鉴定，确保其纯度和活性。
基于贝伐单抗的注射液生产过程研究及优化方案
基于贝伐单抗的注射液生产过程研究及优化方案贝伐单抗是一种生物制剂，常用于治疗某些类型的癌症，如结直肠癌、乳腺癌和肺癌。
该药物的生产过程研究及优化方案对于提高药物质量和降低生产成本至关重要。
本文将介绍基于贝伐单抗的注射液生产过程研究的相关内容，并提出相应的优化方案。
1. 贝伐单抗的注射液生产过程研究贝伐单抗的注射液生产过程主要包括以下几个关键步骤：(1) 细胞培养：使用重组DNA技术将贝伐单抗基因导入CHO细胞（中国仓鼠卵巢细胞）中，并通过培养和提纯过程产生大量的贝伐单抗。
(2) 细胞收获和破碎：贝伐单抗经胞内抽提后，进行细胞收获和破碎，以释放出蛋白质。
(3) 纯化和精制：通过离心、过滤和层析等方法对贝伐单抗进行纯化和精制，去除杂质和微生物污染，获得高纯度的贝伐单抗。
(4) 注射液制备：将纯化后的贝伐单抗进行灭菌处理，并与适宜的缓冲液、辅料和溶剂混合，制备成贝伐单抗的注射液。
在贝伐单抗的注射液生产过程研究中，需要考虑以下几个方面的内容：(1) 细胞培养条件的优化：包括培养基配方、细胞密度、气体控制、温度和pH 值等参数的优化，以提高贝伐单抗的产量和质量。
(2) 细胞收获和破碎方法的改进：选择合适的细胞收获和破碎方法，以提高蛋白质的释放率和获得高质量的贝伐单抗。
(3) 纯化和精制工艺的改进：采用先进的离心、过滤和层析技术，以提高贝伐单抗的纯度和收率，并降低制造成本。
(4) 注射液制备工艺的优化：选择合适的灭菌方法和适宜的缓冲液、辅料和溶剂，以确保贝伐单抗的稳定性和安全性。
2. 贝伐单抗的注射液生产过程优化方案为了优化贝伐单抗的注射液生产过程，提高产量和质量，以下是一些可行的优化方案：(1) 优化细胞培养条件：通过调节培养基成分和配方，以及气体控制、温度和pH值等参数，提高CHO细胞的生长速度和贝伐单抗的表达水平。
(2) 优化细胞收获和破碎方法：改进细胞收获和破碎方法，提高蛋白质的释放率和贝伐单抗的质量。
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细胞库的相关法规要求
细胞库的检定
细胞库检定-CHO细胞
检测项目
细胞鉴别 细菌、真菌检查
MCP
+ +
WCP
+ +
分歧杆菌检查
+
+
支原体检查
(+)
(+)
细胞形态观察及血吸附试验
+
+
内 体外不同细胞接种培养法
+
+
、 动物和鸡胚体内接种法
+
-
源 病
逆转录病毒检查
+
-
毒 种属特异性病毒检查（鼠源）
(+)
荧光强度值能反映细胞
目标的相对表达水平
筛选方法
➢ ClonePix
Semi solid media
筛选方法
➢ Limiting dilution
有限稀释法(limiting dilution cloning, LDC)是一种通过梯度稀释以获得单 克隆的方法。 它的应用范围广, 对于大多数细胞类型, 如杂交瘤细胞、 CHO细胞及干细胞等都有较好的克隆分离效果。 LDC的操作过程大致 分为接种(铺板)、 筛选和扩增。 接种的细胞液经过逐级稀释后加到96 孔板中, 每个孔所含的细胞个数理论上不大于1
载体的一般性构成
1、IRES：即内部核糖体进入位点，是一段核酸序列，它的存在能够使蛋白质翻
译起始不依赖于5‘帽结构，从而使直接从信使RNA（mRNA）中间起始翻译成 为可能。通常来讲，真核生物翻译只能从mRNA的5‘端开始，因为翻译起始必 须依赖于5’端的帽子结构。
2、Promoters：即启动子，控制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度，启 动子本身并不控制基因活动，而是通过与称为转录因子（transcription factor）的这种蛋白质（proteins）结合而控制基因活动的 抗体序列需使用强启动子如SV40启动子等 而抗性基因需要使用削弱的启动子
✓ CSI/Cell Metric
单克隆拍照系统
FDA目前对于单克隆证明方法意见
克隆性
FISH不但可用于已知基因或序列的染色体定位，而且也可用于未克隆基因或遗传 标记及染色体畸变的研究。在基因定性、定量、整合、表达等方面的研究中颇 具优势。
筛选检定
细胞代次的规定
细胞库的相关法规要求
细胞库的相关法规要求
基于CHO细胞的单抗生产（第一版）
汪洋 2018/02
目录
• CHO细胞的构建 • CHO细胞的表达 • CHO细胞表达后的产物纯化
提高原料药出料工序收率
02:54 2/40
第一节 CHO细胞的构建
02:54 3/40
生物类似药的开发周期表
引言
工程细胞构建的流程概述
在获取一种蛋白之前，先要找
3、Enhancer：即增强子，是指能够使基因转录频 率明显增加的 DNA序列。增强子主要存在于真核 生物基因组中。 增强子能大大增强启动子的活性。 增强子具有特异性
载体的一般性构成
4、Signal peptide：即信号肽（引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短肽 链）
不同的产物可能需要不同的信号肽，抗体一般可使用人血白蛋白信号肽， 获得较高表达量，且能被完全切除
ELISA
TPP
单克隆
➢ 在细胞克隆中，对培养的细胞来说，从原有的克隆中，再筛选出具有 某种特性的细胞进行培养，就是亚克隆。
➢ 亚克隆的目的是获得单克隆
➢ CFDA-目前来说只要理论上证明是单克隆
➢ FDA- Clonality ✓ Limiting dilution ：classic <0.5cell/well 2 rounds
Stable pool
以1-3个/孔铺板96 孔板进行单克隆化， 一般不添加筛选压 力或者使用半压
96WP
ELISA
24WP
6WP
Monoclonal
接种F125进行Fed-Batch 评估，检测表达量和质 量，选择产量和质量最 优的3-5个克隆
SF125
ELISA 、 SDS-PAGE(还原 与非还原)
6、 Terminator ：终止子，是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列。在一个 操纵元中至少在构基因群最后一个基因的后面有一个终止子。
7、 Expression promoting element:即促表达元件 例：UCOE:全称为泛染色质开放元件（Ubiquitous Chromatin Opening Element），加在外源基因启动子5’端上游，是一个小的DNA片段，源于看家 基因的无甲基化CpG岛。研究表明，UCOE能有效防止基因沉默，不论整合到染 色质什么位置，目的基因都能持续稳定、高水平地表达。 Merck KGaA 专利，预计2019.07.20到期
由于转入细胞核的质粒有很小 的概率（亿分之一）整合进宿 主的基因组中，所以可以用加 压筛选的手段（主要有抗生素） 将这种细胞筛选出来并扩大培 养，这样就得到了可以稳定表
达目标蛋白的细胞株
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细胞株筛选一般流程
a. 宿主细胞 b. 载体
c. 筛选
CHO细胞系宿主的一般来源
1. FUT8（ α -1,6岩藻糖转移酶基因），负责将岩藻糖加入抗体的N-糖链上，形成岩藻糖 修饰 （专利日本BioWa制药，预计2028.07.09）。去除岩藻糖修饰可以增强百倍以上 的ADCC作用。
将待测的细胞经荧光染
料(FITC、 PE和PerCP等）
或荧光标记物特异性染
色, 用特定波长的激光束
照射, 激发荧光。 前向角
光散射(forward angle
light scatter, FSC)和侧向
角光散射(side angle light
scatter,
光
SSC)分别表征细胞的相对 源
大小和内部颗粒度, 相对
➢ ClonePix /Cell Xpress TM 克隆筛选及细胞表达系统
➢ Limiting dilution 有限稀释法
筛选方法
➢ Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)-Based Screening
The cold capture method used in FACS where fluorescently labeled antibodies bind to secreted
载体的构建的一般性原则
构建完的细胞筛选
可选其中一种或选其中任意两种，使用两种需要关注HC和LC比例（LC形成二聚体 可以分泌到胞外）
扩增基因：在一定程度上表达量随筛选压力而增加
非扩增基因
筛选方法
➢ Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)-Based Screening基于荧光激 活细胞分选(FACS)技术的 筛选方法
3.锌指核糖核酸酶（ZFN） 由一个 DNA 识别域和一个非特异性核酸内切酶构成。
宿主细胞选择的一般原则
宿主细胞选择的一般原则 Regulatory-Host cell line
IND提供
CHO已知具有 明显的致瘤 性，一般可
不再检测
载体的一般性构成
主要构件： ✓IRES起始位点 ✓Promoters启动子 ✓Enhancer增强子 ✓Signal peptide信号肽 ✓mAb Sequence 单克 隆抗体序列 ✓Terminator 终止子 ✓Resistance markers 抗性标记 ✓ Expression promoting element 促稳定表达件
③病毒感染：对于脂质体转染与电穿孔转染都无法成功转染的细胞系建议用病毒 感染，此法可以快速100%感染，检测成功率高。因操作难度高，使用较少。
克隆筛选
一、Minipool 转染24H后,使用含有压力的培养基，以一定细胞密度接种到96WP,培养14-20天， 挑选出只有单簇细胞生长且汇合度超过30%的孔，ELISA检测表达量，挑选表达 量较高的若干个克隆
有限稀释法
Host cell
Expression Vector
Subclone
Transfection
一
二
Small-scal Bioreactor
ห้องสมุดไป่ตู้
Minipool
Stable pool
Monoclonal
Small-scal Bioreactor
Subclone
转染
➢ 转染
①脂质体转染法：阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电作用， 将DNA分子包裹入内，形成DNA脂复合物，也能被表面带负电的细胞膜吸附，再通 过融合或细胞内吞进入细胞。由于脂质体对细胞有一定的毒性，所以转染后需要 更换培养基。如Lipofectamine™ 3000 Transfection Reagent，一般用于瞬时转染， 因转染后细胞活率较高，也有部分企业用于稳转。
2. crispr/cas9原理是 ：crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通过碱基配对与 tracrRNA （transactivating RNA ）结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在 与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。而通过人工设计这两种 RNA，可以改造 形成具有引导作用的sgRNA （singleguide RNA ），足以引导 Cas9 对 DNA 的定点切割。