第3章细胞融合与单克隆抗体剖析
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动物细胞融合与单克隆抗体上课课件
对单克隆抗体的研究、生产和应用进行伦 理审查，确保符合伦理原则和法律法规。
05
动物细胞融合与单克隆抗体的研 究进展
动物细胞融合技术的最新研究进展
诱导剂研究
科研人员不断探索新的诱导剂，以提高动物细胞融合的效率，降低融合过程中的副作用。
基因编辑技术在动物细胞融合中的应用
基因编辑技术如CRISPR-Cas9为动物细胞融合提供了更精确的遗传修饰手段，有助于产生具有特定功能的融合细 胞。
单克隆抗体技术的最新研究进展
人源化抗体技术
通过基因工程技术，将动物来源的单 克隆抗体进行人源化改造，以提高其 与人体免疫系统的相容性。
单克隆抗体药物优化
针对单克隆抗体药物的稳定性、半衰 期、亲和力等关键指标进行优化，以 提高其治疗效果和降低副作用。
动物细胞融合与单克隆抗体技术的未来发展方向
新型动物细胞融合方法的探索
02
融合后的细胞通常保留了亲代细 胞的某些生物学特性，并有可能 表现出新的生物学特性。
动物细胞融合的方法
化学法
利用化学物质（如聚乙二醇）诱导细胞融合。
电融合法
通过电场作用诱导细胞融合。
生物法
利用病毒（如仙台病毒）诱导细胞融合。
动物细胞融合的意义
生产单克隆抗体
动物细胞融合技术是制备单克隆 抗体的关键步骤，通过将免疫细 胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交 瘤细胞，进而产生单克隆抗体。
参考标准品
02
03
标准化流程
建立并使用参考标准品，为单克 隆抗体的质量控制和标准化提供 依据。
制定标准化的生产流程，确保从 细胞融合、筛选到抗体纯化、检 测的每一步都符合标准。
单克隆抗体生产中的伦理问题
动物福利
在单克隆抗体生产过程中，应关注动物 福利，采取适当的措施减少动物的痛苦 和不适。
05
动物细胞融合与单克隆抗体的研 究进展
动物细胞融合技术的最新研究进展
诱导剂研究
科研人员不断探索新的诱导剂，以提高动物细胞融合的效率，降低融合过程中的副作用。
基因编辑技术在动物细胞融合中的应用
基因编辑技术如CRISPR-Cas9为动物细胞融合提供了更精确的遗传修饰手段，有助于产生具有特定功能的融合细 胞。
单克隆抗体技术的最新研究进展
人源化抗体技术
通过基因工程技术，将动物来源的单 克隆抗体进行人源化改造，以提高其 与人体免疫系统的相容性。
单克隆抗体药物优化
针对单克隆抗体药物的稳定性、半衰 期、亲和力等关键指标进行优化，以 提高其治疗效果和降低副作用。
动物细胞融合与单克隆抗体技术的未来发展方向
新型动物细胞融合方法的探索
02
融合后的细胞通常保留了亲代细 胞的某些生物学特性，并有可能 表现出新的生物学特性。
动物细胞融合的方法
化学法
利用化学物质（如聚乙二醇）诱导细胞融合。
电融合法
通过电场作用诱导细胞融合。
生物法
利用病毒（如仙台病毒）诱导细胞融合。
动物细胞融合的意义
生产单克隆抗体
动物细胞融合技术是制备单克隆 抗体的关键步骤，通过将免疫细 胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交 瘤细胞，进而产生单克隆抗体。
参考标准品
02
03
标准化流程
建立并使用参考标准品，为单克 隆抗体的质量控制和标准化提供 依据。
制定标准化的生产流程，确保从 细胞融合、筛选到抗体纯化、检 测的每一步都符合标准。
单克隆抗体生产中的伦理问题
动物福利
在单克隆抗体生产过程中，应关注动物 福利，采取适当的措施减少动物的痛苦 和不适。
细胞融合-与-单克隆抗体课件
第二十五页，共六十二页。
4.22 杂种 细胞 (zázhǒng)
在植物育种中的应用
杂种细胞是一条新的育种途径，
可以产生新经济性状的良种。 科学家已经在禾本科、茄科、豆
科、十字花科等植物中得到了杂 种再生植株。 一些近亲(jìnqīn)植物、有性不亲和 的组合，如马铃薯×番茄等都得 到了再生植株。
细胞融合-与-单克隆抗体
第十九页，共六十二页。
2）营养互补筛选系统：细胞在缺乏一种 或几种营养成分时，不能生长(shēngzhǎng)繁殖， 即营养缺陷型细胞。利用两种亲本细胞营 养互补作用原理可以筛选杂种细胞。
亲本A：色氨酸缺陷型
亲本B：苏氨酸缺陷型 杂种细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸的培
细胞融合-与-单克隆抗体
第十页，共六十二页。
甜菜(tiáncài)原生质体电融合过程
1）在高频电流电场 下的相互接触(jiēchù)。 2）脉冲刺激后30s 3)50秒后 4）1.5分钟后 5）6分钟后 6）15分钟后，原生质
体融合完成。
细胞融合-与-单克隆抗体
第十一页，共六十二页。
注意事项
1）对介质要求高，一般用高纯度的蒸馏水 并选用(xuǎnyòng)适当的非电介质溶液，如甘露 醇等配制等渗性介质。
稳定区（C区）
细胞融合-与-单克隆抗体
第三十页，共六十二页。
人体内的五种 抗体 (wǔ zhǒnɡ)
细胞融合-与-单克隆抗体
第三十一页，共六十二页。
4.32单克隆抗体(kàngtǐ)的制备
单克隆抗体(monoclonal antibody，简称
McAb)：将能够产生抗体的B淋巴细胞和具 有无限增殖力的骨髓瘤细胞融合在一起， 形成杂交瘤细胞。杂交瘤细胞既能在体 外快速生长，又能持续分泌成分单一的 特异性抗体。这种单一类型的只针对(zhēnduì) 某一特定抗原决定簇的抗体分子，就是单 克隆抗体。
4.22 杂种 细胞 (zázhǒng)
在植物育种中的应用
杂种细胞是一条新的育种途径，
可以产生新经济性状的良种。 科学家已经在禾本科、茄科、豆
科、十字花科等植物中得到了杂 种再生植株。 一些近亲(jìnqīn)植物、有性不亲和 的组合，如马铃薯×番茄等都得 到了再生植株。
细胞融合-与-单克隆抗体
第十九页，共六十二页。
2）营养互补筛选系统：细胞在缺乏一种 或几种营养成分时，不能生长(shēngzhǎng)繁殖， 即营养缺陷型细胞。利用两种亲本细胞营 养互补作用原理可以筛选杂种细胞。
亲本A：色氨酸缺陷型
亲本B：苏氨酸缺陷型 杂种细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸的培
细胞融合-与-单克隆抗体
第十页，共六十二页。
甜菜(tiáncài)原生质体电融合过程
1）在高频电流电场 下的相互接触(jiēchù)。 2）脉冲刺激后30s 3)50秒后 4）1.5分钟后 5）6分钟后 6）15分钟后，原生质
体融合完成。
细胞融合-与-单克隆抗体
第十一页，共六十二页。
注意事项
1）对介质要求高，一般用高纯度的蒸馏水 并选用(xuǎnyòng)适当的非电介质溶液，如甘露 醇等配制等渗性介质。
稳定区（C区）
细胞融合-与-单克隆抗体
第三十页，共六十二页。
人体内的五种 抗体 (wǔ zhǒnɡ)
细胞融合-与-单克隆抗体
第三十一页，共六十二页。
4.32单克隆抗体(kàngtǐ)的制备
单克隆抗体(monoclonal antibody，简称
McAb)：将能够产生抗体的B淋巴细胞和具 有无限增殖力的骨髓瘤细胞融合在一起， 形成杂交瘤细胞。杂交瘤细胞既能在体 外快速生长，又能持续分泌成分单一的 特异性抗体。这种单一类型的只针对(zhēnduì) 某一特定抗原决定簇的抗体分子，就是单 克隆抗体。
细胞融合与单克隆抗体优秀课件
Norwood提出，含15%（V/V）DMSO的50% PEG4000，DMSO可增加膜的通透性，使细胞膜的 渗透压更易于与环境趋于平衡，从而提高融合频率。
细胞融合前的准备（2）
制备饲养细胞（feeder cell）：小鼠腹腔巨噬细胞，能分 泌生长因子促使单个细胞容易生长，还能清除死亡破碎细 胞及微生物。
另一辅助途径是在H、T存在的情况下，经次 黄嘌呤磷酸核糖转化酶（HGPRT）和胸腺嘧 啶核苷激酶（TK）的作用合成DNA。
HAT培养基：
次黄嘌呤（hypoxanthine，H）
氨基蝶呤（aminopterin，A）:叶酸的拮抗剂， 可阻断瘤细胞利用正常途径合成DNA。
胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）
动物免疫：获得产生高效价特异性抗 体的B细胞
抗原：可溶性抗原（蛋白质、核酸、多肽、多 糖）、颗粒性抗原（细胞、细菌、真菌）。
可溶性抗原+佐剂
动物： 6周龄的雌性Balb/c小鼠
免疫途径：腹腔注射、静脉注射、皮内或肌肉内注射。 腹腔内注射尤其适合于颗粒性抗原；对于可溶性抗原 来讲，初次免疫一般选用弗氏佐剂和抗原的混合乳化 物进行背部皮下多点注射，加强免疫在首次免疫后 10～14天，一般是静脉或腹腔内注射，融合前还要进 行抗原冲击。脾内免疫法可获得更满意的免疫效果， 此法免疫周期短、抗原用量少 。
融合后五种细胞的命运：
B，瘤细胞（HGPRT缺陷），B-B，瘤-瘤（HGPRT 缺陷）， 瘤-B
B，B-B细胞能分泌抗体，含有HGPRT，能在HAT培 养基短期存活，但不能长期体外存活。
瘤细胞，瘤-瘤细胞能在体外长期存活，但不含有 HGPRT，不能在HAT培养基存活，不能分泌抗体。
只有瘤-B融合细胞具有亲代双方的遗传性能，在HAT 培养基存活，且能在体外长期存活，能分泌抗体。
细胞融合与单克隆抗体
子、同一抗原、同一细胞上不同抗原决定簇 的单克隆抗体。 ▶ 对某一抗原而言，可能存在多种单克隆抗体。
41
二、单克隆抗体技术：
1. 免疫动物
2. 脾细胞分离
3. 骨髓瘤细胞的准备 4. 细胞融合 5. 融合细胞的筛选与 克隆
6. 单克隆抗体的大量 制备
42
1. 免疫动物：
▶ 免疫动物的目的是希望B细胞在抗原刺 激下分化增殖，使之有利于融合成杂交 瘤细胞，尤其是能分泌特异性抗体的杂 交瘤融合细胞频率增加。 ▶ 动物选择应与骨髓瘤细胞来源相同的同 一品系动物，多为BALB/c小鼠。
• 融合率高，可达50%~80%；
• 可用于细胞数量很少的融合；
• 可定向诱导细胞融合;
• 有利于融合细胞的挑选。
26
电融合的不利之处：
• 融合仪价格昂贵； • 两细胞大小差异较大时，电压较难选择； • 融合膜成分不同时细胞较难融合
27
二、融合细胞的筛选
▶ 在细胞融合过程中，不仅两类不同细胞间发
异核细胞、尤其双核异核细胞会存活。并 通过有丝分裂使两个不同亲本细胞的染色 体合并在一个细胞核中，形成杂交细胞。
▶ 利用酶缺陷型、营养缺陷型、温度敏感性、
形态和行为等标志，建立了多种选择选择 系统，最常用的是酶缺陷型HAT选择培养 法。
29
1. HAT选择系统（酶缺陷型）
• HAT系统为次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A) 和胸腺嘧啶核苷(T)的缩写。它是根据嘌 呤和嘧啶生物合成途径设计的分离杂种 细胞特殊的培养基。
第三章
细胞融合与
单克隆抗体
1
第一节 细胞融合
2
细胞融合(cell fusion)：又称体细胞
杂交(somatic hybridization)或细胞杂交
41
二、单克隆抗体技术：
1. 免疫动物
2. 脾细胞分离
3. 骨髓瘤细胞的准备 4. 细胞融合 5. 融合细胞的筛选与 克隆
6. 单克隆抗体的大量 制备
42
1. 免疫动物：
▶ 免疫动物的目的是希望B细胞在抗原刺 激下分化增殖，使之有利于融合成杂交 瘤细胞，尤其是能分泌特异性抗体的杂 交瘤融合细胞频率增加。 ▶ 动物选择应与骨髓瘤细胞来源相同的同 一品系动物，多为BALB/c小鼠。
• 融合率高，可达50%~80%；
• 可用于细胞数量很少的融合；
• 可定向诱导细胞融合;
• 有利于融合细胞的挑选。
26
电融合的不利之处：
• 融合仪价格昂贵； • 两细胞大小差异较大时，电压较难选择； • 融合膜成分不同时细胞较难融合
27
二、融合细胞的筛选
▶ 在细胞融合过程中，不仅两类不同细胞间发
异核细胞、尤其双核异核细胞会存活。并 通过有丝分裂使两个不同亲本细胞的染色 体合并在一个细胞核中，形成杂交细胞。
▶ 利用酶缺陷型、营养缺陷型、温度敏感性、
形态和行为等标志，建立了多种选择选择 系统，最常用的是酶缺陷型HAT选择培养 法。
29
1. HAT选择系统（酶缺陷型）
• HAT系统为次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A) 和胸腺嘧啶核苷(T)的缩写。它是根据嘌 呤和嘧啶生物合成途径设计的分离杂种 细胞特殊的培养基。
第三章
细胞融合与
单克隆抗体
1
第一节 细胞融合
2
细胞融合(cell fusion)：又称体细胞
杂交(somatic hybridization)或细胞杂交
细胞融合与单克隆抗体
优点： 外源DNA大小基本不受限制（1-50kb）；导入过
程直观； 整合率高
缺点： 设备昂贵、环节较多 对操作人员有较高的技术要求 低效率（尤其是大家畜） 对卵子伤害大，胚胎存活率低 基因整合随机性
2、胚胎干细胞（ES细胞）法
ES细胞是早期胚胎的内细胞团经过体外培养建立起来的多潜 能细胞系。
1．核受体细胞的准备 去核卵母细胞常常作为核移植的受体细胞。 卵母细胞的来源有两种方式：一是用激素对雌体进行超排处理， 从输卵管冲出体内成熟的卵母细胞。二是从屠宰场收集卵巢，吸出 滤泡中的卵丘—卵母细胞复合体(COCs)，在体外培养成熟后作为受 体。
2．核供体细胞的准备 在核移植操作中，细胞核供体细胞首先必须是完整的二倍体，
该细胞必须保持有供体动物完整的基因组； 其次，供体细胞核必须能够在受体细胞质的作用下，产生细
胞分化过程的倒转，变得如同刚刚受精的合子一样，能重新完成 从受精到发育成一个正常动物个体的全过程。
供体细胞主要有两大类：胚胎卵裂球和体细胞。另外，核供 体细胞的来源还有胚胎干细胞和胎儿成纤维细胞。
3．细胞核移植 常用的核移植方法有两种，即胞质内注射和透明带下注射。胞质
细胞融合和单克隆抗体 胡丽芳
一、细胞融合
细胞融合，又称体细胞杂交或细胞杂交，是指在离体条件 下用人工方法将不同种生物或同种生物不同类型的单细胞 通过无性方式融合成一个杂合细胞的技术。 杂交细胞：融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信 息的细胞。 细胞融合技术的出现标志着细胞工程的诞生。
广泛应用于单克隆抗体制备、生物的远缘杂交、新品种培 育等。
体外培养 注射到小鼠腹腔
单克隆抗体
单抗的制备过程要点：
1. 动物特异性免疫 2. 分离B淋巴细胞（B）；培养骨髓瘤细胞（G）。注意B淋巴细胞
高二生物选修3课件：222动物细胞融合与单克隆抗体
基因编辑：基因编辑 技术的伦理问题，如 基因编辑的伦理边界、 基因编辑的伦理风险 等
知识产权：单克隆 抗体技术的知识产 权问题，如专利权 、知识产权保护等
社会影响：单克隆抗 体技术的社会影响， 如对医疗、科研、经 济等方面的影响等
动物细胞融合与单克隆抗体技术的社会影响
医学进步：为治疗疾病提供了新的手段和方法 伦理问题：涉及动物权益和生物伦理问题 社会接受度：公众对单克隆抗体技术的接受程度不一 经济影响：单克隆抗体技术的发展带动了相关产业的发展
动物细胞融合技术的应用
单克隆抗体的制备：通过细胞融合技术，可以获得大量具有特定功能的单克隆抗体
基因工程：通过细胞融合技术，可以将外源基因导入到动物细胞中，实现基因工程的 目的
药物研发：通过细胞融合技术，可以制备具有特定功能的药物，如抗肿瘤药物、抗病 毒药物等
生物反应器：通过细胞融合技术，可以将动物细胞转化为生物反应器，用于生产特定 的生物制品，如疫苗、酶等
单克隆抗体：一 种特异性识别抗 原的抗体
动物细胞融合在 单克隆抗体制备 中的作用：产生 具有特定抗原特 异性的单克隆抗 体
动物细胞融合在单 克隆抗体制备中的 步骤：选择合适的 细胞、融合细胞、 筛选融合细胞、培 养融合细胞、纯化 单克隆抗体
动物细胞融合对单克隆抗体性能的影响
细胞融合：将两种或多种细胞融合在一起，形成新的细胞
市场需求：随着人们对 健康和疾病的关注度不 断提高，市场需求将不 断增加
政策支持：政府对生物 医药产业的支持力度不 断加大，将为动物细胞 融合与单克隆抗体技术 的发展提供有力保障
单克隆抗体的应用案例
单克隆抗体在医学诊断中的应用
肿瘤诊断：检测肿瘤标志物，辅 助诊断肿瘤
传染病诊断：检测病原体抗原， 辅助诊断传染病
2021-2022年高中生物 222动物细胞融合与单克隆抗体难点剖析 新人教版选修3
2021-2022年高中生物 222动物细胞融合与单克隆抗体难点剖析新人教版选修3知识·巧学一、动物细胞融合1.动物细胞融合的概念：是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。
融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞。
2.动物细胞融合的原理：与植物原生质体融合的基本原理相同，诱导动物细胞融合的方法与植物原生质体融合的方法类似，常用的诱导因素有聚乙二醇、灭活的病毒、电刺激等。
3.用灭活病毒诱导动物细胞融合过程：4.动物细胞融合的意义：克服了远缘杂交的不亲和性，成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育的重要手段。
辨析比较动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较比较项目细胞融合的原理细胞融合的方法诱导手段用法植物体细胞杂细胞膜的流动去除细胞壁后离心、电刺激、克服了远缘杂交 性 诱导原生质体融合 振动、显微操作、聚乙二醇等试剂诱导 交的不亲和性，获得杂种植株动物细胞融合 细胞膜的流动性 使细胞分散后诱导细胞融合 除应用植物细胞杂交手段外，再加灭活的病毒诱导制备单克隆抗体的技术之一1.单克隆抗体的制备（1）抗体：B 淋巴细胞产生。
主要成分：球蛋白，具有特异性，从血清中分离出的抗体产量低、纯度低、特异性差。
（2）单克隆抗体的制备过程：−−→−→融合淋巴细胞免股小鼠培养骨髓瘤细胞B 多种杂交细胞→在具有筛选作用的培养基上培养→克隆筛选出的杂交细胞→将不同种杂交细胞分开，并克隆专一抗体，检验阳性细胞→注射到小鼠体内或体外培养→获得单克隆抗体。
（3）杂交瘤细胞的特点：既能大量迅速繁殖，又能产生专一抗体。
（4）单克隆抗体的优点：特异性强，灵敏度高，产量大。
2.单克隆抗体的应用（1）作为诊断试剂：准确识别各种抗原物质，并跟抗原特异性的结合，具有准确、高效、简易、快速的优点。
（2）用于治疗疾病和运载药物：主要用于治疗癌症，可制成“生物导弹”，也有少量用于治疗其他疾病。
知识拓展如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养？融合后的细胞经选择性培养基培养后，能存活的细胞就是杂交瘤细胞。
细胞融合和单克隆抗体PPT教学课件
各种细胞器分布、结构、功能的比较归纳
分 布 有无膜
功能
线粒体
动 植 物 两层膜
细胞呼吸和能量代谢的中心
叶绿体 内质网
植物叶肉细 胞
动植物
两层膜 单层膜
光合作用的场所 蛋白质的运输通道
溶酶体
动植物
单层膜
消化细胞内颗粒和碎渣
高尔基体 动植物
单层膜 对蛋白质进行加工、分类和包装。
液泡
中心体 核糖体
溶酶体
单层膜。动物、真菌和某些植物细胞中由单位膜包被 的小泡。含有多种水解酶，起消化功能，能分解衰老、 损伤的细胞器、吞噬并杀死侵入细胞的病毒或病菌。 由高尔基体断裂形成。
问题
飞翔鸟类胸肌细胞中线粒体的数量比不飞 翔鸟类的多。运动员肌细胞线粒体的数 量比缺乏锻炼的人多。在体外培养细胞 时，新生细胞比衰老细胞或病变细胞的 线粒体多。为什么？
2、单克隆抗体的制备过程
思考与探究： 如何获得能产生特异抗体的杂交瘤细胞呢？
经免疫的小鼠
提取
B淋巴细胞
小鼠骨髓瘤细胞
灭活的病毒等手段
杂交 细胞
用特定的选 第一次筛选
择性培养基
杂交瘤细胞 第二次筛选
能产生特定抗体、培养条件 下能无限增殖的杂交瘤细胞
注射到小鼠腹腔
体外培养
提取单克隆抗体
（3）整个制备过程为何要经过两次筛选?
第一次筛选得到杂交瘤细胞（多种），
第二次需先在多孔培养板上，在每孔只有一个杂交瘤 细胞的情况下开始培养，然后再筛选出能产生特异性 抗体的细胞群。
由于该细胞群是单个杂交瘤细胞克隆得来的，所 以产生的抗体必然是化学性质单一的，特异性强的单 克隆抗体。这里的单克隆确有单个细胞克隆的含义， 只不过克隆的不是B淋巴细胞，而是杂交瘤细胞。
动物细胞融合与单克隆抗体 课件人教版高中生物选修三ppt
一 动物细胞融合技术
杂交细胞：具有原来两个 或多个细胞的遗传信息
使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。
细胞膜的流动性
动物细胞融合特有
PEG融合法、电融合法和灭活病毒诱导法等。 （化学法 物理法 生物法 ）
灭活的病毒诱导动物细胞融合的原理
1.什么是病毒的灭活？
灭活是指用物理或化学手段使病毒失去感染能力，但是并不破坏病毒的抗原结构。
三 单克隆抗体的应用
1.单克隆抗体的优点：特异性强，灵敏度高，可以大量制备。 单克隆抗体能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性 结合，并且可以大量制备。
2.单克隆抗体的应用 （1）广泛用作诊断试剂
（2）运载药物：如ADC（抗体 - 接头 - 药物）
（3）用于治疗疾病。
2(2020全国卷)为研制抗病毒A的单克隆抗体，某同学以小鼠甲为实验材料设计了 以下实验流程。
2.2.2 动物细胞融合技术与单克隆抗体
本节聚焦： 1.什么是动物细胞融合技术？ 2.单克隆抗体是如何制备的？
在临床上有哪些应用？
知识回顾：植物体细胞杂交的过程
植物细胞融合
植物组织培养
运用植物体细胞杂交技术，可以跨越不同植物之间的生殖隔离的屏障
那么，有没有技术能让不同种动物的体细胞进行杂交，培育出集不同细胞 的优势于一身的动物细胞呢？
单克隆抗体制备的过程：
能产生所需抗体的杂交瘤细胞
注射到小鼠腹腔内 从小鼠腹水中提取
体外培养 从细胞培养液中提取
单克隆抗体
两次筛选的比较
第一次筛选
第二次筛选
原因
诱导融合后得到的细胞中，除 杂交瘤细胞之外，还有未融合 的亲本细胞，也有融合的具有 同种核的细胞
高中生物选修三2.3细胞融合和单克隆抗体课件 共17张
突破有性杂交方法的局限，使远 缘杂交成为可能
最主要用途：制造单克隆抗体
植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较
比较项目
植物体细胞杂交
动物细胞融合
细胞融合原理 细胞膜的流动性 细胞膜的流动性
细胞融合的方 去除细胞壁后诱导原 使细胞分散后诱导
Байду номын сангаас
法
生质体融合
细胞融合
诱导方法
电刺激
电融合、PEG、灭
化学（聚乙二醇） 活的仙台病毒
较中，正确的是（ B ）
A．结果是相同的 B．杂种细胞的形成过程基本相同 C．操作过程中酶的作用相同 D．诱导融合的手段相同
2、单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B淋巴细
胞诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞，
在这种培养基上不能存活增殖的细胞是（ C ）
①淋巴细胞 ②小鼠骨髓瘤细胞 ③B淋巴细胞自身
4、生产单克隆抗体时，在培养液中加入某种试
剂能筛选出杂交瘤细胞，因为该试剂（ C ）
A.能抑制淋巴细胞和杂交瘤细胞的DNA复制 B.能阻止淋巴细胞的原癌基因被激活 C.选择性抑制骨髓瘤细胞的DNA复制 D.能阻止杂交瘤细胞核糖体上所有蛋白质合成
5、科学家们用小鼠骨髓瘤细胞与某种细胞融 合，得到杂交瘤细胞，经培养可产生大量克隆
融合细胞 ④小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞 ⑤杂
交瘤细胞
A．②④
B．①③⑤
C．①②③④
D．②③
3、单克隆抗体制备过程中培育的杂交细胞是（ D ）
A．由小鼠能产生抗体的B淋巴细胞与肝细胞融合 B．由小鼠一个B淋巴细胞诱导融合而成 C．由小鼠一个B淋巴细胞与肌瘤细胞诱导融合而成 D．由小鼠一个B淋巴细胞与骨髓瘤细胞诱导融合而成
最主要用途：制造单克隆抗体
植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较
比较项目
植物体细胞杂交
动物细胞融合
细胞融合原理 细胞膜的流动性 细胞膜的流动性
细胞融合的方 去除细胞壁后诱导原 使细胞分散后诱导
Байду номын сангаас
法
生质体融合
细胞融合
诱导方法
电刺激
电融合、PEG、灭
化学（聚乙二醇） 活的仙台病毒
较中，正确的是（ B ）
A．结果是相同的 B．杂种细胞的形成过程基本相同 C．操作过程中酶的作用相同 D．诱导融合的手段相同
2、单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B淋巴细
胞诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞，
在这种培养基上不能存活增殖的细胞是（ C ）
①淋巴细胞 ②小鼠骨髓瘤细胞 ③B淋巴细胞自身
4、生产单克隆抗体时，在培养液中加入某种试
剂能筛选出杂交瘤细胞，因为该试剂（ C ）
A.能抑制淋巴细胞和杂交瘤细胞的DNA复制 B.能阻止淋巴细胞的原癌基因被激活 C.选择性抑制骨髓瘤细胞的DNA复制 D.能阻止杂交瘤细胞核糖体上所有蛋白质合成
5、科学家们用小鼠骨髓瘤细胞与某种细胞融 合，得到杂交瘤细胞，经培养可产生大量克隆
融合细胞 ④小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞 ⑤杂
交瘤细胞
A．②④
B．①③⑤
C．①②③④
D．②③
3、单克隆抗体制备过程中培育的杂交细胞是（ D ）
A．由小鼠能产生抗体的B淋巴细胞与肝细胞融合 B．由小鼠一个B淋巴细胞诱导融合而成 C．由小鼠一个B淋巴细胞与肌瘤细胞诱导融合而成 D．由小鼠一个B淋巴细胞与骨髓瘤细胞诱导融合而成
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隆
抗
既能产生特异性抗体，
体
又能大量繁殖的细胞
单克隆抗体的概念
读下面一段文字资料，找出单克隆抗体的概念
人们发现，在动物发生免疫反应的过程中，体内的B细胞 可以产生多达百万种以上的特异性抗体，但是每个B细胞只 分泌一种化学性质单一、特异性强的抗体。要想获得大量的 单一抗体，必须用单个B细胞进行无性繁殖，即克隆。
高中生物选修三动 物细胞融合和单克
隆抗体
回忆已学知识，你是否已经见到过动物细 胞融合的实例？
人-鼠(想像图)
动物细胞融合与单克隆抗体
一、动物细胞融合
已成功的动物细胞融合实例有很多，如人—小鼠、人—兔、人—鸡、鼠—兔、鸡—鼠等上百种融合细胞。
病毒颗粒黏 附细胞表面
细胞融合、形成杂种细胞
鼠细胞 你想到筛选杂交瘤细胞的方案了么？
单克隆抗体，可 诊断肿瘤、心血 管畸形等）
单克隆抗体的应用
（2）治疗疾病和运载药物
生物导弹 = 单克隆抗体 + 药物（治疗肿瘤）
疗效高、副作用小 (“生物导弹” —单抗导向，药物为弹头)
1、科学家用小鼠骨髓瘤细胞与某种细胞融合，得到杂交细胞， 经培养可产生大量的单克隆抗体，与骨髓瘤细胞融合的是 （ A）
还需怎么办？
多孔细胞培养板
稀释
有限稀释法
稀释多次
对能产生特异性抗体的单个杂交瘤细胞
进行克隆，即单细胞克隆。
由它产生的抗体，即单克隆抗体。
将培养皿孔内的上清液取出，检测抗体。
单克隆抗体
经免疫的小鼠 B淋巴细胞
小鼠骨髓瘤细胞
4.单抗制备过程中应 提取 用了那些技术？
灭活的病毒等手段
杂交 细胞
动物细胞融合、动物细胞培养 用特定的
3.细胞融合及单克隆抗体的制备
恶性增殖的转化细胞，只要营养条件
适合可永远分裂和存活——长命细胞。
经筛选与驯化，现已建立多种骨髓瘤 细胞株——没有抗体分泌物。
2. 细胞融合技术：
分泌抗体 短命 脾细胞 (B淋巴细胞) 长命 不分泌抗体 骨髓瘤细 胞 分泌抗体 长命 杂交瘤细 胞
Köhler和Milstein, 1975
1984年Nobel医学奖
外源性途径(旁路途径)
谷氨酰胺 or 单磷酸尿苷酸
二氢叶酸还原酶
A
DNA
T
内源性途径(主要途径) 外源性途径(旁路途径) 胸腺嘧啶激酶 ( TK ) (Thymidine kinase)
B淋巴细胞： HGPRT+， TK+ 骨髓瘤细胞： HGPRT-， TK-
存活
死亡
单克隆抗体技术操作流程
目的：
触1分钟；
（4）加9ml 培养液，离心沉淀，吸去上清液； （5）加5ml 培养液，分别接种5个直径60mm平皿，每个 平皿加培养液至 5ml，37℃的CO2培养箱中培养。 （6）6—24小时后，换成选择培养液筛选杂交细胞。
电融合法
电融合法是80年代出现的细胞融合技术，在直流电 脉冲的诱导下，细胞膜表面的氧化还原电位发生改变， 使异种细胞粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连 接，直到闭和成完整的膜，形成融合体。
150ul/孔 A、B
+3.6ml M
2个cell/孔 1个cell/孔
150ul/孔 C、D
+3.6ml M
150ul/孔 E、F、 G、H
0.5个cell/孔
6.杂交瘤细胞的鉴定
染 色 体 核 型 分 析
大规模培养——批量生产单克隆抗体
第三章 细胞融合与单克隆抗体
细胞来源
叶——叶 ——叶 叶——根 ——根 愈伤组织——叶 愈伤组织——叶 叶——花瓣 ——花瓣 种子——种子 种子——种子 叶——悬浮细胞 ——悬浮细胞 叶——花瓣 ——花瓣 叶——悬浮细胞 ——悬浮细胞 叶——悬浮细胞 ——悬浮细胞 悬浮细胞——悬浮细胞 悬浮细胞——悬浮细胞 叶——根 ——根 悬浮细胞——叶 悬浮细胞——叶 原生质体——血红细胞 原生质体——血红细胞 悬浮细胞——叶 悬浮细胞——叶 悬浮细胞——叶 悬浮细胞——叶 腹水癌细胞——原生质体 腹水癌细胞——原生质体 叶——根尖 ——根尖 纤维肉瘤细胞——畸胎瘤细胞 纤维肉瘤细胞——畸胎瘤细胞
电融合法的优点： 电融合法的优点： 融合率高、重复性强、对细胞伤害小； 装置精巧、方法简单、可在显微镜下观察或录像观察融合过程 免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控性强。
电融合的基本过程： 电融合的基本过程： 细胞膜的接触： 细胞膜的接触：当原生质体置 于电导率很低的溶液中时， 于电导率很低的溶液中时，电 场通电后， 场通电后，电流即通过原生质 体而不是通过溶液， 体而不是通过溶液，其结果是 原生质体在电场作用下极化而 产生偶极子，使原生质体紧密 产生偶极子， 接触排列成串； 接触排列成串； 膜的击穿： 膜的击穿：原生质体成串排列 后，立即给予高频直流脉冲就 可以使原生质膜击穿， 可以使原生质膜击穿，从而导 致两个紧密接触的细胞融合在 一起。 一起。
单克隆抗体：只针对某一抗原决定簇的抗体分子。 单克隆抗体：只针对某一抗原决定簇的抗体分子。 多克隆抗体： 由同一抗原诱导而产生的针对多个抗原决定族 多克隆抗体： 的抗体。 的抗体。
单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞 单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞 (myeloma cell)与经过特定抗原免疫刺激的 与经过特定抗原免疫刺激的 B淋巴细胞 淋巴细胞(antigen stimulated B 淋巴细胞 lymphoblast)融合得到杂交瘤细胞 融合得到杂交瘤细胞 融合得到 (hybridoma cell)，杂交瘤细胞既能象骨髓 ， 瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有 淋巴 瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴 细胞产生特异性抗体的能力。因此， 细胞产生特异性抗体的能力。因此，单克隆 抗体技术又称为杂交瘤技术(hybridoma 抗体技术又称为杂交瘤技术 technology ）。
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第3章细胞融合与单克隆抗体剖析
3.2 单克隆抗体技术
抗体：在对抗原刺激的免疫应答中，B淋巴细胞产生的一 类糖蛋白,能与相应抗原特异的结合，产生各种 免疫效应（生理效应）的球蛋白。
第3章细胞融合与单克Байду номын сангаас抗体剖析
3.2 单克隆抗体技术
• 抗体 (Ig) : （Immunoglobulin)
• 抗体分类： IgG、 IgA、 IgM、 IgD、 IgE
• T细胞活化的第二信号 又称协同刺激信 号，由众多协同 刺激分子与相应 受/配体结合介导， 主要是B7/CD28分 子对之间的作用。
第3章细胞融合与单克隆抗体剖析
3.2 单克隆抗体技术
• T细胞在双信号的激发下，表达细胞因子及相应受体，进 一步促进T细胞活化、增殖。
• 若TCR特异性识别并结合抗原肽的过程中缺乏协同刺激信 号，则T细胞被诱导呈不应答。
第3章细胞融合与单克隆抗体剖析
3.2 单克隆抗体技术
第3章细胞融合与单克隆抗体剖析
3.2 单克隆抗体技术 二、反应阶段
• T细胞活化的第一信号 由TCR 识别并结合抗 原性多肽传递抗原信 号；CD4、CD8分子分 别识别MHC-II类和 MHC-I类分子。
第3章细胞融合与单克隆抗体剖析
3.2 单克隆抗体技术
第3章细胞融合与单克隆抗体剖析
外周淋巴器官
扁桃体，淋巴结 淋巴结
脾 肠系膜淋巴结
淋巴管
中枢淋巴器官
胸腺
骨髓
3.2 单克隆抗体技术 T细胞和B细胞的分化
第3章细胞融合与单克隆抗体剖析
3.2 单克隆抗体技术 T细胞介导的免疫应答 一、抗原的识别与递呈（感应阶段） 二、反应阶段 三、效应阶段 四、细胞免疫的生物学效应
第3章细胞融合与单克隆抗体剖析
3.2 单克隆抗体技术 （三）T细胞的增殖和分化
CD4+ TH 分化为： TH1
CD8+ CTL（TC )分化为： 有杀伤效应的CTL （TC )
第3章细胞融合与单克隆抗体剖析
3.2 单克隆抗体技术 Tc杀伤细胞
第3章细胞融合与单克隆抗体剖析
3.2 单克隆抗体技术
第3章细胞融合与单克隆抗体剖析
3.2 单克隆抗体技术
3.2.1单克隆抗体技术的基本理论
正常淋巴细胞（如小鼠脾细胞）具有分泌抗体的能力，但不 能在体外长期培养，瘤细胞（如骨髓瘤）可以在体外长期 培养，但不分泌抗体。于是Kohler和Milstein 于1975年将 两种细胞杂交而创立了单克隆抗体技术，获1984年诺贝尔 奖。
抗体结构
第3章细胞融合与单克隆抗体剖析
3.2 单克隆抗体技术 抗体作用的机理
中和反应 聚集反应 沉淀反应 补体活化
3.2 单克隆抗体技术
每个B淋巴细胞只能产生 一种针对它能够识别的 特异性抗原决定簇的抗 体，而由这一个细胞通 过有丝分裂繁殖形成的 细胞群称为“克隆”， 由这一个克隆系产生的 抗体称为单克隆抗体
3.2 单克隆抗体技术
3.2.1.2 单克隆抗体的特性 高度均一性：
纯度很高的均一性抗体 高度专一性：
只对抗原分子上某一抗原决定簇起反应 大量产生及稳定性：
杂交瘤细胞能在体内外无限繁殖之传代
第3章细胞融合与单克隆抗体剖析
3.2 单克隆抗体技术 3.2.1.3 亲本细胞的选择
第3章细胞融合与单克隆抗体剖析
3.2 单克隆抗体技术 一、抗原的识别与递呈（感应阶段）
（一）APC对抗原的递呈 （二）T细胞的双识别
第3章细胞融合与单克隆抗体剖析
3.2 单克隆抗体技术 抗原呈递细胞 (antigen-presenting cell ) 一种特殊类型的细胞，携带细胞表面MHC（主要组织相容性复 合体）II类分子，涉及抗原的加工和呈递给辅助T细胞。
第3章细胞融合与单克隆抗体剖析
3.2 单克隆抗体技术
3.2.1.1杂交瘤技术的基本原理 • 利用细胞融合技术，将已免疫过的B细胞与骨髓瘤细胞融
合，在由此形成的单个杂种细胞中，B细胞提供产生单一 型抗体的遗传信息，瘤细胞提供连续增殖的遗传信息。 • 因此这种杂种细胞既能产生抗体又能无限繁殖。
第3章细胞融合与单克隆抗体剖析
3.2 单克隆抗体技术
3.2.1 杂交瘤单克隆抗体技术的理论 3.2.2 杂交瘤技术过程 3.2.3 单克隆抗体的规模化生产 3.2.4 单克隆抗体的改造和应用
第3章细胞融合与单克隆抗体剖析
3.2 单克隆抗体技术
免疫系统
由淋巴器官、组织、细胞共同构成。 • 免疫器官：
– 中枢免疫器官：骨髓、胸腺、（鸟、禽）法氏囊 – 外周免疫器官：淋巴结、脾、扁桃体等 • 免疫细胞： – 造血干细胞、淋巴细胞（T、B、NK）、白细胞等。 • 免疫分子： – 抗体、补体、细胞因子、干扰素等。
第3章细胞融合与单克隆抗体剖析
3.2 单克隆抗体技术
第3章细胞融合与单克隆抗体剖析
3.2 单克隆抗体技术 单克隆抗体生产技术 (杂交瘤技术) 用细胞融合技术获得单克隆抗体综合了两方面优势： • 淋巴细胞肿瘤: 能不断增殖，没有产生专一抗体能力。 • 从脾脏得到淋巴细胞: 能产生专一抗体，不能不断增殖。
第3章细胞融合与单克隆抗体剖析
3.2 单克隆抗体技术
Georges J. F. Kohler
César Milstein
第3章细胞融合与单克隆抗体剖析
3.2 单克隆抗体技术
单克隆抗体 (monoclonal antibody) • 随着在研究上应用日益广泛，对抗体的数量和质量
（专一性）要求越来越高 • 数量多: 传统的实验动物马,兔等免疫不方便 • 质量高: 大动物免疫难以做到单克隆
3.2 单克隆抗体技术
能起抗原作用的各类物质必须具备如下特性：
(1)外源性 (2)结构性
(3)特异性
机体以往从未接触过的外源异物或异体； 分子量在10，000以上的大小，分子表面有稳定 的环状结构基团(而非线状基团)作为识别位点； 由于抗原有不同的决定簇，产生相应的抗体与 抗原间的反应是特异性的。
细 胞 免 疫 应 答
第3章细胞融合与单克隆抗体剖析
3.2 单克隆抗体技术
体 液 免 疫 应 答
第3章细胞融合与单克隆抗体剖析
3.2 单克隆抗体技术
抗原：一类能够刺激动物机体的免疫系统，诱导发生免疫 应答，产生体液免疫的抗体和（或）细胞免疫的效 应淋巴细胞，并在体内外与之反应的物质。
第3章细胞融合与单克隆抗体剖析