微生物蛋白酶的分共33页

蛋白酶类

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用胰酶水解酪蛋白得到的一种10肽（Arg.Glu.Ser.p.Leu.(Ser)4.4P.Glu.Arg），叫酪蛋白磷酸肽（CCP），具有促进钙铁吸收的作用，是众所周知的补钙功能性食品配料。由大豆蛋白、鱼肉蛋白、酪蛋白酶水解得到的一种可有2-12个氨基酸组成的抑制血管紧张素的小肽（ACEIP），可控制血压，因不像化学合成的血管紧张素抑制剂（ACEI）那样会对肾脏有损害。
动物来源蛋白抽提物及肉味香精基料
Protamex® 复合蛋白酶/ Flavourzyme® 500MG 对原料肉、肉渣、骨、血等动物加工副产品进行水解，生产功能性骨、肉提取物（骨素）、水产提取物、蛋白胨、肽等，保证原料较彻底的水解及最终产品度较高蛋白质利用率，产品风味醇厚自然，毫无苦味之干扰。
2
3、按蛋白酶来源分为动物、植物和微生物蛋白酶
（1）动物蛋白酶: 如胰蛋白酶（Pancreatic Proteinases）、胃蛋白酶（Pepsin）、凝乳酶（Rennin）（2）植物蛋白酶：木瓜蛋白酶(Papain)：最适pH5-7，作用pH范围3-9; 最适温度65℃，作用温度范围30-70℃，生成产物：氨基酸。菠萝蛋白酶(Bromelain)、无花果蛋白酶(Ficin)：（3）微生物蛋白酶酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶
8
菠萝蛋白酶使用条件

最适反应温度45℃ ，最佳温度因底物的种类及浓度不同而有所改变。最适pH值6-7，最适宜pH因底物的种类、浓度不同而有所改变。添加量一般为 0.2—1.0% ，根据不同底物作适当增减，反应时间在 3-8hr 作相应缩短或延长。
9
微生物蛋白酶
到本世纪初，已经报导的微生物蛋白酶超过900种。目前我国生产的微生物蛋白酶主要有： 1、酸性蛋白酶，由黑曲霉As3.350，宇佐美曲酶537 生产，最适pH2.5-3.0，稳定pH2-6,最适反应温度47-55℃， 55℃失活。 2、中性蛋白酶, 由枯草芽孢杆菌1.398生产，最适pH7.0,稳定pH5.5-8.5；最适反应温度45℃，60℃易失活。栖土曲霉3.492中性蛋白酶，最适pH7.5及10，稳定pH5-10；最适反应温度45℃，50℃以上迅速失活。放线菌166中性蛋白酶，最适pH 7.0-8.0；最适反应温度 40℃，40℃以上易失活。

6.蛋白酶

4、羧基蛋白酶（酸性蛋白酶）
活性中心：有2个羧基。
抑制剂：对-溴苯甲酰甲基溴或重氮试剂。
胃蛋白酶、凝乳酶和许多霉菌蛋白酶在酸性范围
内具有活性。最适pH在2~4。
三、常用蛋白酶及其特性
1、酸性蛋白酶
羧基蛋白酶，活性中心含有2个天冬氨酸残基最适pH：2.5~5.0 最适作用温度：45~75 ℃。分子量：30000-40000 等电点低：3-5
中的蛋白质，对稳定绿茶饮料十分有利。
谢谢！
4、丝氨酸蛋白酶
共性与特性： • 主要有胰蛋白酶、α-凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶等。 • 共同特征：内切酶，活性中心含有丝氨酸残基，此外活性中心还有咪唑基和羧基，并且在一些蛋白酶活性中心部分的氨基酸连接顺序相似。
（1）α-胰凝乳蛋白酶
由3条多肽链组成，以2个链间二硫键连接在一起。还含有3个链内二硫键，分子量25000左右。
•
如果采取有控制的酶水解，使蛋白质的水解反应停止在某一个阶段，使肽链具有足够的长度将疏
水性氨基酸埋藏在它的结构的内部，就能减少水解
蛋白质的苦味。
五、蛋白酶作为食品添加剂的应用
• 1、作为肉类嫩化剂 • 用于肉类嫩化剂的蛋白酶必须具有较高的耐热性。因为嫩
化剂的作用主要发生在当肉类被烧煮，温度逐渐升高，而酶
第六章蛋白酶
地位
• 蛋白酶是食品工业中最重要的一类酶。 • 应用广泛，如干酪生产、肉类嫩化、植物蛋白质改性等大量使用。
存在
• 广泛
• 植物：菠萝、木瓜、无花果
• 动物：消化道---胃蛋白酶、胰凝乳酶、羧肽酶、氨肽酶等。 • 微生物：细菌、霉菌、酵母、放线菌。
蛋白酶
水解蛋白质中肽键。
COSR）和异羟污酸（-CONHOH）等。

蛋白酶ppt课件

*
*
（1）木瓜蛋白酶（EC 3.4.22.2）
• 在pH5的弱酸性条件下最稳定。底物不同，它的最适pH也会改变，酪蛋白最适pH为7，明胶则为5。 • 最适作用温度一般在65℃,在较高温度下仍然保持活性，例如在中性条件下70℃加热处理 30min，对牛乳的凝结活性仅下降20%； • 商品化的木瓜蛋白酶中，真正的木瓜蛋白酶一般只占可溶性蛋白质总量的10%，另外的蛋白酶还有木瓜凝乳酶、溶菌酶以及木瓜肽酶等。在肉品嫩化、啤酒加工中有应用。
* Ser-Ser-Cys-Met-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Leu-Val-Cys-Lys-Lys-As *
Ser-Gly-Cys-Gln-Gly-Asp-Ser-Gly-GlyPro-Leu-His-Cys-Leu-Val-As
Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-Met-Lys-Ser-Pr
• 由三个肽链组成，由双硫键将各部分结合在一起。胰凝乳蛋白酶原A由245个氨基酸残基（分子量约为25,000），分子中有五个双硫键，它没有酶的活性；在胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的作用下，裂解生成了-胰凝乳蛋白酶。
图
1 Cys
胰凝乳蛋白酶原的激活过程示意图
245 胰凝乳蛋白酶原A 胰蛋白酶 15 Arg 16 胰凝乳蛋白酶 146 Tyr B链 15 147 148 149 Ala C链 Thr Asn 245 胰凝乳蛋白酶 Asp Asp 胰凝乳蛋白酶
蛋白酶
第11问题
蛋白酶的分类、常见的种类
3.1.1、蛋白酶的作用
水解蛋白质或多肽中的酰胺键（肽键）。
COOH R1—CH—N—H + HO—C—CH—R2 H O COOH R1—CH—N—C—CH—R2 + H2O H O NH2 NH2

微生物蛋白酶的分

外肽酶
外肽酶分Aminopeptidase和carboxypeptidase。 n 氨肽酶多为胞内酶，广泛存在于细菌和真菌中。它从多肽链N端水解下一个氨基酸残基，二肽或是三肽。 n 羧肽酶作用于多肽链的C端，水解下一个氨基酸或是二肽。据酶活性位点氨基酸残基的特点，可将羧肽酶分为:丝氨酸羧肽酶，金属羧肽酶，半胱氨酸羧肽酶。
微生物蛋白酶的分子和生物技术方面的概述
Molecular and Biotechnological Aspects of Microbial Proteases
汇报人：马纳纳
2012年9月20日
PROTEASES
1.来源 1.动力学机制
2.分类
2.生理学功能 3.应用
1. 基因改造 2.蛋白质工程 3.序列同源性及进化关系
Plant Proteases
Animal Proteases
胰蛋白酶 Trypsin （丝氨酸蛋白酶，水解lys， arg羧基形成的肽键）糜蛋白酶 Chymotrypsin （水解 phe，try，
tyr 羧基形成的肽键）
木瓜蛋白酶 Papain (最适pH5~9)
菠萝蛋白酶 Bromelain ( 最适pH5~9）
例如：用于洗涤剂的碱性蛋白酶应有1）广泛的底物特异性，以加速多种污迹的去除。2）在洗涤剂各种助剂如螯合剂、氧化剂等共存下稳定。纳豆激酶：溶栓作用。

研究蛋白酶动力学，必先纯化，纯化方法有亲和层析，离子交换层析，凝胶过滤层析等。
四. 蛋白酶动力学机制

1.丝氨酸蛋白酶：据其底物偏好可分为：类胰蛋白酶，类糜蛋白酶和类弹性蛋白酶。丝氨酸蛋白酶含有Ser-His-Asp催化三联体。 It involves a two-step reaction for hydrolysis. This acylation step is followed by a deacylation process which occurs by a nucleophilic attack on the interme-diate by water, resulting in hydrolysis of the peptide.

酶学课件之蛋白酶

高岭土吸附
洗脱、压滤
汁液
吸附物
洗脱液
盐析
盐析物
离心湿粗酶饼溶解、过滤澄清液
沉淀湿酶
干燥
精品
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菠萝蛋白酶
(2)单宁沉淀法工艺流程
压榨
菠萝下脚料
汁液
去杂质
澄清液加稳定剂
稳稳定定液液
加单宁单宁沉淀物洗脱
滤液
干燥
酶制品
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菠萝蛋白酶
(3)超滤浓缩法工艺流程
菠萝下脚料压榨
汁液去杂质
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金属蛋白酶的特性
❖ 从鲤鱼肌肉中纯化得到的金属蛋白酶活性温度范围为30～50℃；
❖ 来源于草鱼肌肉的金属蛋白酶最适温度为 40℃；
❖ 来源于微生物的金属蛋白酶其对温度的耐受性更强。
❖ 最适pH值在7.5～8.0之间。
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1）广泛存在于动物胰脏、细菌、霉菌中,活性中心含丝氨酸残基,酶活性可受到二异丙基磷酰氟(DFP),苯甲基磺酰氟(PMSF)和马铃薯抑制剂（PI)等的专一性抑制。
2）酶学性质 ➢ 酶的最适pH在9.5~10.5，个别为中性 ➢ 分子量在15~30kDa ➢ 等电点PI约9,在低温下于pH9~10稳定,但在65℃时
3、4、2、3 天门冬氨酸蛋白酶类
[carboxyl(asid) pritelnase]
活性中心含 Asp,最适pH 在5以下
胃蛋白酶凝乳酶
3、4、2、4 金属蛋白酶类
活性中心含有
(metallopritelnase)学习文档Z等n金2+属、 Mg2+
枯草杆菌蛋白酶嗜热菌蛋白酶
2.1 丝氨酸蛋白酶

6.2 蛋白酶

Haihui Zhang Email：z_haihui@
影响凝乳酶活性的因素
（1）PH：在酸性环境中凝乳酶活力最强，原奶酸度的任何微小变化均能显著影响凝乳酶的活力。凝乳酶活力大部分来源于其中的胰蛋白酶，小部分来源于牛胃蛋白酶（不过猪凝乳酶中的有效成分是猪胃蛋白酶）。胰蛋白酶的最适PH为5.4，而胃蛋白酶的最适PH低于胰蛋白酶。（2）温度：凝乳酶的最适温度是42摄氏度。（到55-60摄氏度，酶本身受到破坏）因为乳温明显影响凝结速度。乳温30摄氏度时原奶凝结时间是42摄氏度的2-3倍。不过实际干酪生产中乳温通常保持在 30-33摄氏度，一是考虑到乳酸菌的最适温度（比如链球菌属的最适温度在30摄氏度左右，最高不能超过40摄氏度）；二是较高乳温下凝块硬化速度太快，以至随后的切割比较困难。（3）Ca 2+浓度：只有原奶中存在自由钙离子时，被凝乳酶转化的酪蛋白才能凝结。因此钙离子浓度将会影响凝乳时间、凝块硬度和乳清排出。
2、明胶的生产、
原料动物的皮或骨生产方法酸法或碱法，也可用蛋白酶水解法生产。酸法或碱法，也可用蛋白酶水解法生产。酶法生产明胶的工艺流程如下：酶法生产明胶的工艺流程如下：
原料炭处理切割、切割、捣碎过滤干燥水洗加酶水解除酶提取活性
明胶产品
Haihui Zhang Email：z_haihui@
Haihui Zhang Email：z_haihui@
1、氨基酸的生产、
• 基本工艺流程蛋白质酸混合液 • 前处理一般采用热处理的方法，也可采取生化分离技术将蛋白质先提取出来，再进行酶解。原料处理分离纯化加蛋白酶氨基酸产品水解氨基
Haihui Zhang Email：z_haihui@

蛋白酶整理

一、蛋白酶的分类、主要用途及作用二、产蛋白酶菌株的筛选三、产酶发酵四、蛋白酶活性测定的方法蛋白酶的分类、主要用途及作用酶：酶是具有生物催化功能的生物大分子。

蛋白酶：水解蛋白质肽键的一类酶的总称蛋白酶分类：1据水解多肽的方式分为内肽酶和外肽酶2据反应的最适pH值分为酸性，碱性，中性蛋白酶蛋白酶简介：广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。

微生物蛋白酶，主要由霉菌、细菌，其次由酵母、放线菌生产。

催化蛋白质水解的酶种类很多，重要的有胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶等。

蛋白酶对所作用的底物有严格的选择性，一种蛋白酶只能作用于蛋白质分子中一定的肽键，如胰蛋白酶催化水解碱性氨基酸所形成的肽键。

蛋白酶分布广泛，主要存在于人和动物消化道中，在植物和微生物中含量丰富，由于动植物资源有限，工业生产上生产蛋白酶制剂主要利用枯草杆菌等微生物发酵设备。

一、酸性蛋白酶定义：酸性蛋白酶是一种能在酸性环境下水解蛋白质的酶类注：酸性蛋白酶是指蛋白酶具有较低的最适pH,不是指酸性基团存在于酶的活性部位.简介：主要来源于动物的脏器和微生物分泌物，包括胃蛋白酶、凝乳酶和一些微生物蛋白酶。

根据其产菌的不同，微生物酸性蛋白酶可以分为霉菌酸性蛋白酶、酵母菌酸性蛋白酶和担子菌酸性蛋白酶，根据作用方式可以分为两类：一类是与胃蛋白酶相似，主要的产酶微生物是曲霉、青霉和根酶等；另一类是与凝乳酶相似，主要产酶微生物是毛酶和栗疫酶等，从酶的活力-PH曲线分析,在酶的活性部位中含有一个或更多的羧基，这一类蛋白酶中研究最彻底的是胃蛋白酶。

酸性蛋白酶具有较好的耐酸性，目前用于工业化生产的酸性蛋白酶大多为霉菌酸性蛋白酶，此类酶的最适作用pH值为3.0左右，当pH值升高时，酸性蛋白酶的酶活会明显降低，且此类酶不耐热，当温度达到50℃以上时很不稳定，从而限制了酸性蛋白酶的应用范围。

基本性质酸性蛋白酶的最适PH从2左右(胃蛋白酶)到4左右应用1酿酒：酸性蛋白酶在酿酒的过程中起协同作用，具有溶解发酵原料，促进微生物繁殖，降解酵母菌体蛋白等多种功能。

蛋白质的酶促降解和代谢

3、氧化为CO2和H2O
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丙氨酸苏氨酸甘氨酸
丝氨酸
碳骨架的氧化
CoASH
精氨酸组氨酸谷氨酰胺脯氨酸
半胱氨酸
柠檬酸
丙酮酸
乙酰CoA 草酰乙酸
乙酰乙酰CoA
天冬酰胺
异柠檬酸
谷氨酸
异亮氨酸
甲硫氨酸
α-酮戊二酸
缬氨酸
苯丙氨酸酪氨酸亮氨酸赖 O2 + H2O D或L－AA氧化E
NH2
O
R－C－COOH + NH3 + H2O2
（存在于动物肝、肾和某些细菌、真菌中）
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COOH
CHNH2 CH2 + H2O CH2 COOH 谷氨酸
COOH C=O 谷氨酸脱氢酶 CH2 + NH3 NAD(P)+ NADPH CH2
嗜热菌蛋白酶
O
O
O
H2N－CH－C－N－CH－C－N－CH－C－N－CH－
R1
H R2
H R3
H R4
氨
胃芳胰凝非
肽
蛋香乳蛋极
酶
白族白酶性
酶 AA
AA
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O
O
O
O
－C－N－CH－C－N－CH－C－N－CH－C－N－CH－COOH
H R5
碱性
AA Lys Arg
？
体内水循环迅速，NH3浓
度低，扩散流失快，毒
哺乳、两栖动物排尿素性小。
现在是30页\一共有38页\编辑于星期五
？
H2N

蛋白酶的生产和应用

注：PFP．二异丙基磷酰氟甲基磺酰氟 Ph 马铃薯蛋白酶抑制剂 EDTA：乙二胺四乙酸
PCMB：对氯汞苯甲酸 PMSF．"苯 DAN：重氮乙酰正．DL．亮氨酸甲酯 OP：郯二氮杂菲)(菲绕啉)
2．关于微生物蛋白酶的生产
蛋白酶是用途最广泛的酶制剂之一，主要用于洗涤剂，制革、毛皮、蛋白水解物、酿酒、酱油，以及纺织、医药品、化妆品等的生产上。全球蛋白酶的销售额占酶制剂市场的60％，我国2005 年全国(外资合资企业不计)微生物酶制剂产量约48 万吨，总销售额约20 亿人民币，其中蛋白酶约10 万吨，销售额近9 亿人民币。
食品、饲料加工
蛋白质水解、脱苦、调味液
食品饲料加工
动植物蛋白水解、面包、发酵食品
面包制造
。·
动植物蛋白水解、调味液
弱碱性蛋白酶、调味液
水解蛋白质
Actinase(科研医药)
灰色链霉菌
试剂、食品加工、医药
13
Pantiase NP-2(Yokult)
酸性蛋白酶： SumizymeAP(新日本) Sumizyme RP(新日本) Molsin(Seishin 制药) Neulase F(天野)
奶酪制造
3．蛋白酶的利用蛋白酶的用途非常广泛(表3)，最大的用户是洗涤剂，其次用于饲料、食品工业、酿
酒酿造，以及制革工业和医药。
用途
说明
表3 蛋白酶的用途
干酪制造
凝固酪蛋白，缩短成熟时间酱油酿造
预处理大豆，提高蛋白质利用率天然调
味液制造
水解蛋白质，增强风昧，制HVP、HAP
酒精，酿酒
水解蛋白质，促进酵母发酵
啤酒澄清酿醋
分解啤酒单宁蛋白沉淀，延长保质期缩短酿醋周期，增加食醋得率

酶的提取和分离纯化.pptx

破碎细胞的方法有: 机械法，物理法，化学法和酶法
第9页/共139页
11.2.1 机械破碎法 • 指通过机械运动所产生的剪切力使细胞破碎的方法，常用的有如下几种：
• 1.机械捣碎法
• 利用捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力将组织细胞破碎。 10000r/min
• 此法在实验室和生产规模均可采用。
• 2.研磨法
• 突然降压法的另一种形式为爆破性减压法是将菌体悬浮在高压容器中，用氮气或二氧化碳加压到几十至几百大气压，振荡几分钟，使气体扩散到细胞内，然后突然排出气体，压力骤降，使细胞破碎。
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压力差破碎法
• （3）渗透压差法是利用渗透压的变化而使细胞破碎。 • 应用时先将对数生长期的细胞从培养液中分离出来，再悬浮在20%左右的蔗糖
第33页/共139页
球蛋白溶解度-溶液离子强度关系
第34页/共139页
盐析
• 中性盐类使蛋白质发生沉淀的原因： • 1).中和蛋白质分子表面电荷 • 2).与蛋白质颗粒竞争水分子 • 不同蛋白质表面极性基团、带电数目及分布等不
同，因而可以分级沉淀。 • 盐析法应控制pH使接近等纯化酶的等电点。蛋
• 性质
方法
• 分子大小
离心，超离心法、凝胶过滤，
膜分离技术（超滤，反渗透，
微孔过滤，透析，电渗析等）
• 溶解度
法，
盐析法，有机溶剂沉淀法，共沉淀
选择性沉淀法，结晶
• 电荷或基团
离子交换色谱，电泳，等电聚焦，
吸附色谱，疏水色谱，聚焦色谱
• 稳定性
选择性变性法（热，酸碱，
表面活性剂）
• 特殊（专一性结合）第30亲页/共和13色9页谱，亲和洗脱，亲和电

蛋白酶结构ppt课件

.
1.酸性蛋白酶
• 酸性蛋白酶的热稳定性较差，一般在50℃ 都很快失活，此外，酶的热稳定行还受到基质的pH的影响；有酸性蛋白酶不耐低温，在低温条件下，很快失活。许都酸性蛋白酶分子中含有5-10%多糖，对酶的稳定有益
.
2.碱性蛋白酶性能
• 碱性蛋白酶是经细菌原生质体诱变方法造育的2709枯草杆微生物通过深层发酵、提取及精制而成的一种蛋白水解酶，属于一种丝氨酸脆外高碱性蛋白酶，它能水解蛋白质分子肽链生成多肽或氨基酸，具有较强的分解蛋白质的能力。生产工艺是采用微滤超滤膜分离、喷雾干燥或真空冷冻干燥等先进技术，广泛应用于食品、医疗、酿造、丝绸、制革等行业。碱性蛋白酶是目前市场上流行的洗涤添加剂，能大幅度
.
蛋白酶的制备 ————胰蛋白酶的制备
• （4）胰蛋白酶的结晶
• 将上述胰蛋白酶滤饼（粗胰蛋白酶）溶解后进行结晶：按每克滤饼溶于1.0ml pH9.0 的0.4M硼酸缓冲液的量计加入缓冲液，小心搅拌溶解。
• 用2M NaOH调pH至8.0，注意要小心调节，偏酸不易结晶，偏碱易失活，存放于冰箱。放置数小时后，应出现大量絮状物，溶液逐渐变稠呈胶态，再加入总体积的1/4～1/5
• 用5M NaOH调pH至8.0，加入极少量猪胰蛋白酶（约2-5mg）轻轻. 搅拌，于室温下活化
蛋白酶的制备 ————胰蛋白酶的制备
• （3）胰蛋白酶的分离 • 1. 将已激活的胰蛋白酶溶液按242g/L加入
细粉状固体硫酸铵，使溶液达到0.4饱和度，放置数小时后，抽滤，弃去滤饼。 • 2．滤液按250g/L加入研细的硫酸铵，使溶液饱度达到0.75，放置数小时，抽滤，弃去性：中性蛋白酶的热稳定性较差，如枯草杆菌的中性蛋白酶在pH7,60℃处理15 分钟，失活90%；稀土曲霉的中性蛋白酶在 pH7,55℃处理10分钟，失活80%以上；

微生物发酵生产蛋白酶

❖ 1）菌种保存：产酶菌种在选育出来以后，必须
妥善保存，才能保证其产酶特性不异、不死亡、
不被杂菌污染。
❖ 2）菌种活化：产酶菌种在使用钱必须接种于斜
面培养基上，在一定条件下，进行培养，以恢复
细胞的生命活动能力。
❖ 3）扩大培养：活化了的菌种，一般还要经一级至数级的扩大培养。
❖ 4）分离纯化：发酵结束后得到的酶可能含有一些杂
微生物发酵生产蛋白酶
一、蛋白酶
❖ 定义：催化蛋白质中肽键水解的酶。根据酶的活性中心起催化作用的基团属性，可分为：丝氨酸/苏氨酸蛋白酶(编号：EC 3.4.21.-/EC 3.4.25.-)、巯基蛋白酶(编号：EC 3.4.22.-).、金属蛋白酶(编号：EC 3.4.24.-)和天冬氨酸蛋白酶 (编号：EC 3.4.23.-)等。
❖ 1、从菌种保存机构和有关研究部门获得 ❖ 2、通过筛选获得
五、培养基的配制
❖ 枯草杆菌ASL.398中性蛋白酶发酵培养基：
❖ 玉米粉8%，豆饼粉4%，麸皮3.2%，米糠1%，磷酸氢二钠0.4%，磷酸二氢钠 0.03%.
六、发酵工艺流程
保藏菌种菌种活化种子扩大培养
发酵分离纯化
酶
七、剖析：
❖ 蛋白酶广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。微生物蛋白酶，主要由霉菌、细菌，其次由酵母、放线菌生产。
二、酶发酵的方式
❖ 1、固体培养发酵 ❖ 2、液体深层发酵 ❖ 3、固定化细胞或固定化原生质体发酵
三、各种发酵方式发酵模式：
❖1、固定培养发酵：
❖ 以麸皮、米糠等为培养基的主要原料，加入其它必需的营养成分而制成的固体或半固体的麦曲，经灭菌、冷却后，接入产酶菌株，在一定条件下，发酵产酶。

微生物蛋白酶的分

2. Asp蛋白酶：是一类催化活性依赖asp的内肽酶。多数在低pH时表现最大活性。活性位点Asp-Ser/Thr-Gly。被胃酶抑素抑制。
3. Cys/巯基蛋白酶：催化活性包括Cys和His 催化二分体。通常只在有还原基团（HCN 或 Cys）存在下才有活性。中性至碱性pH。对巯基化合物敏感，但不受DFP和金属螯合物影响 . 4. 金属蛋白酶：活性依赖二价金属离子。活性易被螯合物比如EDTA抑制，但不受巯基化合物或DFP的影响。研究最多的是嗜热菌蛋白酶和胶原酶。
例如：用于洗涤剂的碱性蛋白酶应有1）广泛的底物特异性，以加速多种污迹的去除。2）在洗涤剂各种助剂如螯合剂、氧化剂等共存下稳定。纳豆激酶：溶栓作用。

四. 蛋白酶动力学机制

研究蛋白酶动力学，必先纯化，纯化方法有亲和层析，离子交换层析，凝胶过滤层析等。

1.丝氨酸蛋白酶：据其底物偏好可分为：类胰蛋白酶，类糜蛋白酶和类弹性蛋白酶。丝氨酸蛋白酶含有Ser-His-Asp催化三联体。 It involves a two-step reaction for hydrolysis. This acylation step is followed by a deacylation process which occurs by a nucleophilic attack on the interme-diate by water, resulting in hydrolysis of the peptide.
七. 蛋白质工程
• 快速发展归功于重组DNA技术和定点突变技
术。 • 两大主要任务:基因鉴定和蛋白三维结构分析。 • 细菌中以枯草杆菌蛋白酶为例，二硫键的引入增强了其热稳定性。 • 真菌中以天冬氨酸蛋白酶为例，用定点突变技术对其活性部位asp76突变为ser，确定此此酶的底物结合位点特异性。

蛋白酶结构PPT课件

————胰蛋白酶的制备
• （4）胰蛋白酶的结晶 • 将上述胰蛋白酶滤饼（粗胰蛋白酶）溶解后进行结
晶：按每克滤饼溶于1.0ml pH9.0 的0.4M硼酸缓冲液的量计加入缓冲液，小心搅拌溶解。 • 用2M NaOH调pH至8.0，注意要小心调节，偏酸不易结晶，偏碱易失活，存放于冰箱。放置数小时后，应出现大量絮状物，溶液逐渐变稠呈胶态，再加入总体积的1/4～1/5 • 的pH8.0的0.2M硼酸缓冲液，使胶态分散，必要时加入少许胰蛋白酶晶体。 • 放置2～5天可得到大量胰蛋白酶结晶，待结晶析出完全时，抽滤，母液回收。
张艳梅等对汞离子对木瓜蛋白酶结构的影响及抑制机理的研究发现：
写在最后
经常不断地学习,你就什么都知道。你知道得越多,你就越有力量 Study Constantly, And You Will Know Everything. The More
You Know, The More Powerful You Will Be
蛋白酶的制备 ————胰蛋白酶的制备
• （2）胰蛋白酶原激活 • 向胰蛋白酶原粗制品滤饼分次加入10倍体积（按饼重计）
冷的蒸馏水，使滤饼溶 • 解，得胰蛋白酶原溶液。将研细的固体无水氯化钙慢慢
加入酶原溶液中（滤饼中硫酸铵的含量按饼重的四分之一边计搅）拌，，使使C溶a液2+中与最SO终42-仍结含合有后0，.1边M加Ca边Cl搅2。拌均匀，边加 • 用5M NaOH调pH至8.0，加入极少量猪胰蛋白酶（约25mg）轻轻搅拌，于室温下活化8～10h，（2～3小时取样一次，并用0.001M HCl稀释），测定酶活性增加的情况。 • 活化完成（比活约3500～4000BAEE单位）后，用2.5M H2SO4调pH至2.5～3.0，抽滤除去CaS制备

-腐乳的制作

D. 无机盐、维生素
答案：A
第32页，共36页。
2. 食盐在豆腐坯腌制中起到的作用是（）
①渗透盐分，析出水分
②给腐乳以必要的咸味
③防止毛霉继续生长和污染的杂菌繁殖
④浸提毛霉菌丝上的蛋白酶
A. ①②③ B. ③④
C. ①②③④ D. ①③
答案：C
第33页，共36页。
3. 卤汤中香辛料的作用是（）
第29页，共36页。
腌制腐乳：
豆腐坯加水煮沸后，加盐腌制，装坛加入辅料，发酵成腐乳。
特点：豆腐坯不经前期发酵，直接装坛，进行后发酵，依靠辅料中带入的微生物而成熟。
缺点：蛋白酶不足，后期发酵时间长，氨基酸含量低，色香味欠佳。
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课堂小结
毛霉
制作
主要微生物
根霉
曲霉
腐原理
酵母
乳的
课题重点：说明腐乳制作过程的科学原理，设计并完成腐乳的制作。
课题难点：在实践中摸索影响腐乳品质的条件。
第9页，共36页。
一、基础知识
小资料
据史料记载，早在公元5 世纪魏代古籍中，就有腐乳生产工艺的记载，到了明代我国就大量加工腐乳，而今腐乳已成长为具现代化工艺的发酵食品。
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成功的腐乳应具有以下特点：
色泽基本一致、味道鲜美、咸淡适口、无异味、块形整齐、厚薄均匀、质地细腻、无杂质。
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C 能否总结不同条件对腐乳风味和质量的影响
从盐、酒的用量、发酵的温度、发酵时间的长短、以及香辛料等因素中的某一因素说明其对腐乳风味或质量的影响。
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第20页，共36页。
4. 当毛霉生长旺盛，并呈淡黄色时，去除包裹平盘的保鲜膜以及扑在上面的粽叶，使豆腐块的热量和水分能够迅速散失，同时散去霉味；

微生物蛋白酶的分-精共33页

微生物蛋白酶的分-精
41、实际上，我们想要的不是针对犯罪的法律，而是针对疯狂的法律。 ——马克·吐温 42、法律的力量应当跟随着公民，就像影子跟随着身体一样。— —贝卡利亚 43、法律和制度必须跟上人类思想进步。— —杰弗逊 44、人类受制于法律，法律受制于情理。— —托·富勒
45、法律的制定是为了保证每一个人自由发挥自己的才能，而不是为了束缚他的才能。—— 罗伯斯庇尔
谢谢
11、越是没有本领的就越加自命不凡。——邓拓 12、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。——爱尔兰 13、知人者智，自知者明。胜人者有力，自胜者强。——老子 14、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。——歌德 15、最具挑战性的挑战莫过于