第三章微生物发酵产酶描述

实验室的常用培养基：
细菌：牛肉膏/蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）； 放线菌：高氏1号合成培养基培养； 酵母菌：麦芽汁培养基； 霉菌：查氏合成培养基；
例如枯草芽孢杆菌： 一般培养：肉汤培养基或LB培养基； 自然转化：基础培养基； 观察芽孢：生孢子培养基； 产蛋白酶：以玉米粉、黄豆饼粉为主的产酶培养基；



4、酵母
（1）啤酒酵母（Saccharomyces cereviaiae）


细胞圆形、卵形、椭圆形或腊肠型。菌 落为白色，有光泽、平滑，边缘整齐。 营养细胞可直接变为子囊。 主要用于啤酒、酒类生产，还可产生丙 酮酸脱氢酶、醇脱氢酶等生产。
（2）假丝酵母（Candida）


细胞圆形、卵形或长形。无性繁殖为多 边牙殖，形成假菌丝，可生成孢子。菌 落为乳白色或奶油色。 可生产脂肪酶、尿酸酶、转化酶、醇脱 氢酶等。
3、提高产酶的措施- Translation
1、培养基
1）各种生物对营养的需求
动物 （异养） 碳源 氮源 能源 生长因子 无机元素 水分
糖类、脂肪 蛋白质及其降解物 与碳源同 维生素 无机盐 水
微生物
异养 糖、醇、有机酸等 蛋白质及其降解 物、有机氮化物、 无机氮化物、氮 与碳源同 有些需要维生素等 生长因子 无机盐 水 自养 二氧化碳、碳酸盐等 无机氮化物、氮 氧化无机物或利用日 光能 不需要 无机盐 水
三、产酶微生物的筛选与选育
1、产酶微生物的筛选
2、产酶微生物优良菌种的选育



诱变育种 原生质体融合 基因工程育种
第二节酶的发酵工艺条件及控制 一、微生物产酶方法
1、固体发酵法 2、液体发酵法
1、 固体发酵
固体发酵法（麸曲发酵）
以皮麸或米糠为主要原料，同时依需要添加其它谷糠、 豆饼等，加水搅拌成适度的含水量的半固态物料作为培养 基，以作为微生物的生长繁殖和产酶用 主要产品：淀粉酶、糖化酶 1）浅盘法 2）转桶法 3）厚层通气法。
1） 浅盘法发酵
将固态培养基平铺在浅盘内，进行微生物的培养和产酶 ，固体培养基装在木盘或竹匾上，厚3-5cm在能够控制 温度、湿度的曲房内的盘架上进行发酵。
2）转桶法发酵
是将固态培养基先接入菌种，再放入可旋转的转桶 内，培养基随转桶慢慢转动而翻动，通气及温度 湿度调节比较均匀，易于产酶。 特点：①机械化有所提高； ②转桶的清洗、灭菌操作较难。
为了维持培养基pH的相对恒定。可改变培养基的组分和比例，在培养基中 加入pH缓冲液，或在进行工业发酵时补加酸、碱。
2）温度的控制
对于微生物来说，温度直接影响其生长、繁殖和产酶。 不同微生物有其最适 生长温度：枯草杆菌 的最适生长温度为 34～37℃。 黑曲霉的最适生长温 度为28～32 ℃。 细胞发酵产酶的最适温度与细胞生长最适温度有所不同。 因此对某些微生物来说，在发酵产酶的不同阶段要控制不同温 度。 温度的控制一般采用热水升温、冷水降温的方法，在发酵罐内 外装置换热装置，如：蛇管、排管、夹套等。
3）厚层通气法发酵
是在浅盘法及竹帘法的生产实践上改进而成的。 固体培养基灭菌加入曲种多孔假底的大池内 微生物开始生长、曲温逐渐升高通入空气 特点：①成本高（设备）
②设备利用率提高
③劳动强度低。
2、 液体发酵
是利用液态培养基，进行微生物的 生长繁殖和产酶。 1）液体表面发酵
2）液体深层发酵
第三章 微生物发酵产酶
第一节、常见产酶微生物
第二节、酶的发酵工艺条件及控制
第三节、酶生产过程的动力学 第四节、固定化细胞发酵产酶 第五节 固定化微生物原生质体发酵产酶
酶的生产方法
提取分离法 (Extraction)
生物合成 (Bபைடு நூலகம்osynthesis)
化学合成 (chemicalsynthesis)

直状、近直状的杆菌，周 生或侧生鞭毛，革兰氏阳 性 ， 无 荚 膜 ， 芽 孢 0.5×1.51.8m ，中生或 近中生。 枯草芽孢杆菌是工业发酵 的重要菌种之一。生产淀 粉酶、蛋白酶、5’-核苷 酸酶、碱性磷酸酶、某些 氨基酸及核苷。

2、放线菌


具有分支状菌丝的单细胞原核生物 常用的产酶放线菌为链霉菌 链霉菌菌落成放射状，具有分支的菌丝体，菌丝直径 0.2-1.2μm,革兰氏阳性。菌丝有气生菌丝和基内菌丝 之分 链霉菌是生产葡萄糖异构酶的主要微生物，同时可生 产青霉素酰化酶、纤维素酶、碱性蛋白酶几丁质酶
1）液体表面发酵法
又称液体浅盘发酵法或静置培养法。
特点 ①无搅拌，动力消耗少 ②培养基灭菌用单独设备 ③易生杂菌 ④占地较大。
2）液体深层发酵法
此法是酶制剂发酵应用最广的
特点 ①发酵罐 ②搅拌器 ③通空气（无菌过滤器） ④培养基灭菌、冷却、发酵在同一罐中。
二、 酶的发酵工艺条件与控制
1、培养基 2、发酵条件及控制- Transcription
(2) 醋酸杆菌（Acetobacter）

菌体从椭圆至杆状，单个、成 对或成链，革兰氏阴性，运动 （周毛）或不运动，不生芽孢。 好气。含糖、乙醇和酵母膏的 培养基上生长良好。 应用：有机酸(食醋等）葡萄糖 异构酶(高果糖浆 )山梨糖 (维 C中间体）

(3)枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
3）微生物培养基：
培养基（medium）：是人工配制的，适合微生物生 长 繁殖或产生代谢产物的营养基质。
任何培养基都应该具备微生物生长所需要五大 营养要素：
（1）水 （2）碳源、 （3）氮源、 （4）无机盐、 （5） 生长因子、
水
水是微生物最基本的组分（７０％—９０％） 水是微生物体内和体外的溶剂（吸收营养成分和代谢废物） 水是细胞质组分，直接参与各种代谢活动 调节细胞温度和保持环境温度的稳定（比热高，传热快）
铵盐、硝酸盐
需要注意合适的碳氮比
无机盐
细胞的主要组成元素 参与酶的组成、激活酶活性 调节细胞渗透压、pH値 控制细胞的氧化还原电位
常用：硫酸盐、 磷酸盐、氯化物 以及含有钾、钠、 钙、镁、铁等元 素的化合物。
生长因子
生长因子是指某些微生物不能用普通的碳源、氮源物质进 行合成，而必须另外加入少量的生长需求的有机物质。 分类： 化学结构分成维生素、氨基酸、嘌呤（或嘧啶）及其衍 生物和类脂等四类 功能：以辅酶与辅基的形式参与代谢中的酶促反应 实验室中常用酵母膏、蛋白胨、牛肉膏等作为各种生长因 子的的需要，麦芽汁、米曲汁等天然培养基中本身含有各 种生长因子
(2)曲霉(Aspergillus)

分类：多数属于子囊菌亚门，少 数属于半知菌亚门。 分布：广泛分布于土壤、空气和 谷物上，可引起食物、谷物和果 蔬的霉腐变质，有的可产生致癌 性的黄曲霉毒素。 代表种：黑曲霉Asp. Niger、黄曲 霉Asp.flavus、米曲霉Asp.oryzae 应用：是制酱、酿酒、制醋的主 要菌种。是生产酶制剂（蛋白酶 、淀粉酶、果胶酶）的菌种。生 产有机酸（如柠檬酸、葡萄糖酸 等）。农业上用作生产糖化饲料 的菌种。








枯草杆菌BF7658α -淀粉酶发酵培养基：玉米粉8%，豆饼粉4%，磷酸氢二钠 0.8%，硫酸铵0.4%，氯化钙0.2%，氯化按0.15%（自然pH）。 枯草杆菌AS1.398中性蛋白酶发酵培养基：玉米粉4%，豆饼粉3%，麸皮3.2%, 糠1%, 磷酸氢二钠0.4%, 磷酸二氢钾0.03%（自然pH）。 黑曲霉糖化酶发酵培养基：玉米粉10%，豆饼粉4%，麸皮1%（pH4.4～5.0）。 地衣芽孢杆菌2709碱性蛋白酶发酵培养基：玉米粉5.5%, 豆饼4%, 磷酸氢二 钠0.4%, 磷酸二氢钾0.03%(pH 8.5)。 黑曲霉AS 3.350酸性蛋白酶发酵培养基: 玉米粉6%, 豆饼粉4%, 玉米浆0.6%, 氯化钙0.5%, 氯化铵1%, 磷酸氢二钠0.2% (pH 5.5)。 游动放线菌葡萄糖异构酶发酵培养基：糖蜜2%，豆饼粉2%，磷酸氢二钠0。1%， 硫酸镁0。05% (pH 7.2)。 桔青霉磷酸二酯酶发酵培养基：淀粉水解糖5%，蛋白胨0.5%, 硫酸镁0.05%, 氯化钙0.04%, 磷酸氢二钠0.05%, 磷酸二氢钾0.05% (自然pH)。 黑曲霉AS3.396果胶酶发酵培养基: 麸皮5%, 果胶0.3%, 硫酸铵2%, 磷酸二氢 钾0.25%, 硫酸镁0.05%, 硝酸钠0.02%, 硫酸亚铁0.001% (自然pH)。 枯草杆菌AS1.398碱性磷酸酶发酵培养基: 葡萄糖0.4%, 乳蛋白水解物0.1%, 硫酸铵1%, 氯化钾0.1%, 氯化钙0.1mmol/L, 氯化镁1.0mmol/L, 磷酸氢二钠 20mol/L ( 用pH7.4的Tris-HCl缓冲液配制)

发酵周期短,产酶量高 易培养（生长速率高、营养要求低） 遗传性能稳定，不易退化 易分离提纯。 安全可靠（非致病菌）： 凡从可食部分或食品加工中传统使用的微生物生产的酶, 安全! 由非致病微生物制取的酶,需作短期毒性实验。 非常见微生物制取的酶,需做广泛的毒性实验,包括慢性中 毒实验。
3、霉菌 (1) 根霉(Rhizopus)





分类学上属于藻状菌纲，毛霉目， 根霉属。 根霉因有假根（Rhizoid）而得名 （假根的功能是在培养基上固着， 并吸收营养）。 分布于土壤、空气中，常见于淀粉 食品上，可引起霉腐变质和水果、 蔬菜的腐烂。 代表种：米根霉（R.oryzae)黑根 霉(R.nigrican)等。 应用：根霉能产生一些酶类，如淀 粉酶、果胶酶、脂肪酶等，是生产 这些酶类的菌种。在酿酒工业上常 用做糖化菌。有些根霉还能产生乳 酸、延胡索酸等有机酸。
SOD - blood Papain-Papaya Chymotrypsin-Pancrea …… organ/tissue/cell