食品营养学实验1-3

实验一烹调前后食物总抗坏血酸含量的改变

（2,4-二硝基苯肼比色法）

(一)目的意义

食物中的抗坏血酸包括还原型和脱氢型两种形式。当食物放置时间较长或经过烹调处理后，有相当一部分抗坏血酸转变为脱氢型，脱氢型的抗坏血酸仍有85%左右的维生素C活性，测定总抗坏血酸可以评价烹调方法对食物中抗坏血酸的影响。

(二)原理

总抗坏血酸包括还原型、脱氢型和二酮古乐糖酸,样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸,再与2,4-二硝基苯肼作用生成红色脎,根据脎在硫酸溶液中的含量与总抗坏血酸含量成正比,进行比色定量。

(三)仪器与试剂

1. 恒温箱：37 ±0.5℃。

2. 可见-紫外分光光度计。

3. 捣碎机。

4. 4.5mol/L硫酸: 谨慎地加250mL硫酸(比重1.84)于700mL水中,冷却后用水稀释至1000mL。

5. 85%硫酸：谨慎地加900mL硫酸(比重1.84)于100mL水中。

6. 2%2,4-二硝基苯肼溶液:溶解2g2,4-二硝基苯肼于100mL4.5mol/L硫酸内,过滤。不用时存于冰箱内,每次用前必

须过滤。

7. 2%草酸溶液:溶解20g草酸(H2C2O2)于700mL水中,稀释至1000mL。

8. 1%草酸溶液:稀释500mL2%草酸溶液到1000mL。

9. 1%硫脲溶液:溶解5g硫脲于500mL1%草酸溶液中。

10. 2%硫脲溶液:溶解10g硫脲于500mL1%草酸溶液中。

11. 1mol/L盐酸:取100ml盐酸,加入水中,并稀释至1200mL。

12. 抗坏血酸标准溶液:溶解100mg纯抗坏血酸于100 mL1%草酸中,配成每毫升相当于1mg抗坏血酸。

13. 活性炭:将100g活性炭加到750mL 1mol/L盐酸中,回流1～2h,过滤,用水洗数次,至滤液中无铁离子(Fe3+)为止,

然后置于110℃烘箱中烘干。

检验铁离子方法:利用普鲁士蓝反应。将2%亚铁氰化钾与1%盐酸等量混合,将上述洗出滤液滴入,如有铁离子则产生蓝色沉淀。

(四)操作步骤

1.样品的制备

全部实验过程应避光。

（1）烹调处理将食物分为两份，一份不进行烹调处理，另一份放入沸水中煮5分钟

（2）样品提取均匀取未经烹调及烹调后的样品100g加100g2%草酸溶液,倒入捣碎机中打成匀浆,取10～40g 匀浆(含1～2mg抗坏血酸)倒入100mL容量瓶中,用1%草酸溶液稀释至刻度,混匀，过滤，滤液备用。

2. 氧化取上述滤液2.5mL,加入2g活性炭,振摇1min,过滤,弃去最初数毫升滤液。取10mL此氧化提取液,加入

10mL2%硫脲溶液,混匀，备用。

3. 脎的形成取3个试管，A为空白管，B为未经烹调样品管、C为烹调后样品管、三支试管内分别加入4ml

上述氧化后的样品液，B、C管各再加入1.0ml 2% 2，4-二硝基苯肼溶液。将所有试管放入37±0.5℃恒温箱或水浴中,保温3h。取出放置室温下，A管加2% 2，4-二硝基苯肼溶液1.0ml，放置10-15min。

4. 脎的溶解各管放置冰水浴中缓慢加入5mL 85 %硫酸,滴加时间至少需要1min,需边加边摇动试管。将试管自

冰水中取出,在室温放置30min后比色。

5. 比色用1cm比色杯,以空白液调零点,于540nm波长测吸光值。

6．标准曲线绘制加2g活性炭于50mL标准溶液中,摇动1min,过滤。取10mL滤液放入500mL容量瓶中,加

5.0g硫脲,用1%草酸溶液稀释至刻度,抗坏血酸浓度20μg/mL。取5,10,20,25,40,50,60mL稀释液,分别放入7个

100mL容量瓶中,用1%硫脲溶液稀释至刻度,使最后稀释液中抗坏血酸的浓度分别为1,2,4,5,8,10,12μg/mL。按样品测定步骤形成脎并比色。以吸光值为纵坐标,以抗坏血酸浓度(μg/mL)为横坐标绘制标准曲线。

(五)结果计算

c·V 100

X=━━━━━×F×━━━━

m 1000

式中：X─—样品中总抗坏血酸含量,mg/100g;

c─一由标准曲线查得或由回归方程算得“样品氧化液”中总抗坏血酸

的浓度,μg/ mL；

V─—试样用1%草酸溶液定容的体积,mL；

F──样品氧化处理过程中的稀释倍数；

m──试样质量,g。

(六)注意事项

1.加85%的硫酸溶液形成脎时应边加边振摇试管，防止样品中糖类成分碳化而使溶液变黑。

2.加入硫酸30min后必须比色，因为颜色会继续加深。

3.硫脲可防止抗坏血酸被氧化，并有助于脎的形成。

实验二 维生素C 尿负荷试验

（一）目的及意义：评价被检者维生素C 的营养状况。

（二）原理：

还原型抗坏血酸具有还原性，能还原2,6-二氯酚靛酚染料。该染料在酸性溶液中呈红色，被还原后红色失去。还原型抗坏血酸还原染料后，本身被氧化成脱氢型抗坏血酸。一定量的尿样能还原标准染料的量与样品中所含抗坏血酸的量成正比。

❖ 成人尿负荷4小时（口服500mg 抗坏血酸）

❖ 不足 < 3mg

❖ 正常 3~10mg

❖ 充裕 > 10mg

（三）仪器与试剂

❖ 容量瓶（50ml ）；微量滴定管；三角烧瓶（50ml ）；吸管等

❖ 1%草酸溶液；0.02％ 2,6-二氯酚靛酚溶液；标准抗坏血酸溶液

（四）操作步骤

（1）样品制备 晨起空腹时被检者排出晨尿后，口服500mg 抗坏血酸，收集其后4小时尿液。在尿液中加入一定量草酸，置于4度保存。

（2）溶液配制

❖ VC 应用液配制 取1ml VC 储备液（1mg/ml)→50ml 容量瓶，以1%草酸溶液定容。

（3）空白试验 取10ml 1％草酸溶液→三角瓶，以染料滴定至粉红色，记录用量（C ）。

（4）染料标定 取5ml VC 应用液和5ml 1％草酸溶液于三角瓶，以染料滴定至粉红色，15s 不褪色为终点，记录用量（A ）。

（5）以吸管吸取尿样2~5ml 至50ml 三角瓶，加入1%草酸5ml 。

（6）立即用标定过的2,6-二氯酚靛酚染料滴定之，直至淡粉红色15s 不褪色为终点，记录染料用量。做平行样。

（五）结果计算

计算T 值

T

尿中还原型抗坏血酸排出量=

（六）注意事项 ❖ 操作要迅速，滴定要准确。

❖ 样品中可能含有其他物质能还原2,6-二氯酚靛酚染料，但还原染料的速度要比抗坏血酸慢，所以滴定时以C A VC -⨯=用量应用液浓度小时尿量滴定用尿样量

数染料相当于抗坏血酸每样品－空白）染料用量4)(m g m l (⨯⨯T