实验三_硝酸还原酶活性测定
硝酸还原酶活性的测定
硝酸还原酶活性(ug／h·g)=C×10/t·m(鲜重)
四、实验报告
1、比较在两种不同溶液中的硝酸还原酶活性，并解释。
硝酸还原酶将N03-还原为N02-，产生的N02-可 以从组织内渗透到外界溶液中，并积累在溶液中， 测定反应液中的N02-含量的多少，就表示硝酸还 原酶活性的大小。
N02-含量的测定用磺胺比色法。在酸性溶液 中磺胺与N02-形成重氮盐，重氮盐再与α-萘胺 偶联形成紫红色的偶氮染料，这种偶氮染料在 520nm处有最大吸收峰，因此选用波长520nm分光 光度法进行测定。
根据Lambert-Beer定律：物质对光的吸收，吸 收的光量与物质的浓度、溶液的厚度成比例关系， 用公式表示为
1、用直径1cm的打孔器打出油菜叶圆片100片，各投50片(先称重)至溶液
(1)磷酸缓冲液5 ml + 蒸馏水5 ml； (2)磷酸缓冲液5 ml + KNO3溶液5ml 分别将溶液(1)(2)倒入20毫升针筒内，用针筒抽气使叶圆片中的空气抽去直至叶
圆片沉于溶液中，将此溶液倒回三角瓶置于30℃恒温箱中，保温作用30min后测定 N02-含量。
叶绿体色素的性质测定和分离(P46-48)
实验三 硝酸还原酶活性的测定
一、实验原理
硝酸还原酶是植物氮代谢的关键酶，它使N03-还原成N02-，并可渗到周围的溶 液中，用磺胺显色比色法测定外界溶液中的N02-含量，可以反应该酶活性的强弱。 二、器材与试剂
油菜叶片、小白菜叶片、UV-1100型紫外/可见分光光度计、20毫升针筒 0.1 mol/L pH7.5磷酸缓冲液、O.2M KNO3溶液、磺胺试剂、α-萘胺试剂 三、方法与步骤
2、绘制标准曲线（见P34）
3、N02-含量测定 溶液(1)1ml + 磺胺试剂2ml + α-萘胺试剂2ml
硝酸还原酶活性测定实验报告
硝酸还原酶活性测定实验报告硝酸还原酶活性测定实验报告引言：硝酸还原酶是一种重要的酶类，在生物体内负责将硝酸盐还原为亚硝酸盐。
硝酸还原酶活性的测定对于研究生物体对硝酸盐的代谢和环境污染物的检测具有重要意义。
本实验旨在探究硝酸还原酶的活性测定方法，并通过实验验证其可行性和准确性。
材料与方法：1. 实验材料：- 0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH 7.0）- 0.1 mol/L 硝酸钠溶液- 0.1 mol/L 硫酸铵溶液- 1% 硫胺素溶液- 10% 硝酸盐还原酶提取液- 10% 硝酸盐还原酶抑制剂- 2% 硝酸盐还原酶底物溶液- 0.1 mol/L 硫酸铵铵铁硫氰化物溶液- 0.1 mol/L 醋酸溶液- 蒸馏水2. 实验仪器：- 分光光度计- 定量移液器- 离心机- 恒温水浴槽- 试管架- 显微镜实验步骤：1. 提取硝酸盐还原酶：a. 取一定量的样品（如细胞或组织），加入磷酸盐缓冲液，用搅拌器充分破碎。
b. 将破碎后的样品转移至离心管中，以12000 rpm离心10分钟。
c. 取上清液，即为硝酸盐还原酶提取液。
2. 硝酸还原酶活性测定：a. 准备一组空白对照组，加入相同体积的磷酸盐缓冲液代替硝酸盐还原酶提取液。
b. 准备一组实验组，加入一定体积的硝酸盐还原酶提取液。
c. 分别加入一定体积的硝酸钠溶液、硫酸铵溶液、硫胺素溶液和硝酸盐还原酶底物溶液。
d. 在恒温水浴槽中，将反应体系恒温30分钟。
e. 加入硝酸盐还原酶抑制剂停止反应。
f. 加入硫酸铵铵铁硫氰化物溶液，使反应产生红色沉淀。
g. 加入醋酸溶液，混匀后离心10分钟。
h. 取上清液，以分光光度计测定其吸光度。
结果与讨论：通过实验测定，我们得到了一组吸光度数据。
根据吸光度与硝酸还原酶活性之间的关系，我们可以计算出样品中硝酸还原酶的活性。
在本实验中，我们采用了硫酸铵铵铁硫氰化物法测定硝酸还原酶活性。
该方法利用硝酸还原酶将硝酸盐还原为亚硝酸盐，再与硫酸铵铵铁硫氰化物反应生成红色沉淀。
实验三预习报告硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性的测定
实验三预习报告硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性的测定实验三、硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性的测定一、硝酸还原酶的测定[原理]:硝酸还原酶(NR)是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸(或对-氨基苯磺酰胺)及α-萘胺(或萘基乙烯胺)在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。
生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。
硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。
一般以每克鲜重含氮量表示，即以-1-1ug.g.h为单位。
NR的测定可分为活体法和离体法。
活体法步骤简单，适合快速、多组测定。
离体法复杂，但重复性较好。
[试剂]1(亚硝酸钠标准溶液:准确称取分析纯NaNO0.9857g溶于去离子水后定容至1 2-1000ml，然后再吸取5ml定容至1000ml，即为含亚硝态氮1ug.ml的标准液; 2(0.1molpH7.5的磷酸缓冲液:NaHPO.12HO30.0905g与NaHPO.2HO 2422422.4965g加去离子水溶解后定容至1 000ml;-13(1%(W/V)溶液:1.0g 对氨基苯磺酸溶于100ml 3 mol.LHCL中(25ml浓-1盐酸加水定容至100ml 即为 3 mol.LHCL);(0.02%(W/V)萘基乙烯胺溶液:0.020g萘基乙烯胺溶于100ml 去离子水中，4贮于棕色瓶中;-1-15(0.1mol.LKNO溶液:2.5275g KNO溶于250Ml 0.1mol.LPh7.5的磷酸缓冲33液中; -16(0.025mol.LPh 8.7 的磷酸缓冲液:8.864 0g NaHPO12HO，0.0570g 24.2KHOP.3HO，溶于1 000ml去离子水中; 2427( 30%三氯乙酸溶液:30g三氯乙酸。
水溶后定容至100ml。
[方法];1. 标准曲线制作:管号 1 2 3 4 5 6 7亚硝酸钠标准液 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 试剂蒸馏水 2.0 1.8 1.6 1.2 0.8 0.4 0.0 (ml) 1%磺胺 4 4 4 4 4 4 40.02%萘基乙烯胺 4 4 4 4 4 4 4每管含亚硝态氮(ug) 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0摇匀后在25度下保温30min，然后在540nm下比色测定。
实验报告 硝酸还原酶活性的测定word文档良心出品
首都师范大学生命科学学院实验报告实验题目硝酸还原酶活性的测定一、实验原理硝酸还原酶是植物氮素作用中的关键性酶，硝酸还原酶作用于NO 使之还原为NO 。
NO -+ NADH + H +— NO 2- + NAD ++ H 2O产生的NO 可以从植物组织渗透到外界溶液中，积累在溶液中。
因此，测定反 应液中NO 含量的增加即表明酶活性的大小。
NO 含量的测定----磺胺法NO 2-与磺胺和-萘胺在酸性条件下生成粉红色化合物，用比色法在520nm 下读 取光密度值。
—、实验用品1. 材料：完全营养的小麦苗，缺氮培养的小麦苗2. 仪器和用具：722型分光光度计，剪刀，真空泵，电子天平，温箱，烧杯，移液 枪，tip 头(两种规格：1000卩I ，200卩I ) 三、实验步骤1. 分别配制反应液于小烧杯中(1) 0.1M 磷酸缓冲液5ml +蒸馏水5ml(2) 0.1M 磷酸缓冲液 5ml + 0.2MKNQ 5ml 2. NO 2-的获得(1) 称取新鲜叶片0.5g 共四份,剪成小片，分别置于小烧杯内的反应液中。
(2) 在真空干燥器中抽气20min,使叶片沉于溶液底部，溶液即可渗入组织内取代其 中的空气，内部产生的NO 可渗透到外部溶液中。
3.将小烧杯转到30 r 温箱,使其不见光,保温20min 。
4.用5卩g/ml NaNQ 母液配制标准梯度溶液 5、4、3、2、1、0.5、0.1、 0 卩 g/ml 。
5.吸取不同浓度的NaNOmI 于试管中，加入磺胺试剂2ml 及a -萘胺试剂2ml ，混 合均匀，在60r 水浴中保温20min ，于比色杯中，在520nm 下进行比色，读取光 密度，然后做出光密度一浓度曲线，以光密度为纵坐标， 体步骤及结果如下表和下图所示。
课程名称植物生理实验 实验时间2010331成绩姓名唐倪文班级_3学号 1090800032NaNO 浓度为横坐标。
具试剂管号12 3 4 5 6 7 8 NaNO 母液(ml)0 0.02 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水（ml ） 1 0.98 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 1%磺胺(ml)22 2 2 2 2 2 2 0.2 %a -萘胺 (ml) 22 2 2 2 2 2 2 每管亚硝酸氮含 量（卩g ） 0 0.1 0.5 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 每管NaNO 浓度 （卩 g/ml ） 0 0.1 0.5 1.02.03.04.05.0 光密度0.0150.0520.1040.2020.3020.3960.493小麦幼苗完全培养液缺N 培养液KNOHO KNO HO 小麦鲜重（g ） 0.51 0.51 0.49 0.48 光密度0.178 0.176 0.065 0.039 亚硝酸钠浓度 （卩 g/ml ） 1.791 1.7710.6540.392亚硝态氮含量 （卩g ） 1.791 1.771 0.654 0.392 酶活性105.39104.1840.0424.505.吸取反应液各1 ml 于试管中加入磺胺和粉红色化合物.用比色法在520nm 下读取光密度值，从标准曲线上查得NO 的含量, 结果如下表。
硝酸还原酶活性测定方法
硝酸还原酶活性的测定一．试验原理：硝酸还原酶是植物氮素代谢作用中的关键酶，与作物吸收和利用硝态氮的能力相关。
它催化NO3－还原为NO2－的反应：NO3－+NADH+H+→NO2－+NAD++H2O反应产生的NO2－可从组织内渗透到外界溶液中，定时测定一定的反应溶液中NO2－含量的变化情况则可了解此酶的活性大小。
NO2－的定量测定是用磺胺比色法。
此法简单易行而又非常灵敏，可测出0.5微克/ml NaNO2含量的变化。
二．试剂：磷酸缓冲液（Na2HPO4.12H2O NaH2PO4.2H2O） KNO3溶液磺胺试剂α－萘胺试剂 NaNO2标准溶液1. 0.1molpH7.5的磷酸缓冲液：Na2HPO4.12H2O 30.0905g与NaH2PO4.2H2O2.4965g加去离子水溶解后定容至1000ml；2. 0.2 mol/L KNO3：称取 KNO3 20.22 g，用蒸馏水溶解，移入100 mL 容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀。
3.磺胺（对氨基苯磺酸胺）试剂：1克磺胺溶于25毫升浓盐酸后再用蒸馏水稀释至100 ml 。
4.α－萘胺试剂：0.2克α萘胺溶于25 ml 浓盐酸中，再用蒸馏水稀释至100 ml 。
5.NaNO2标准溶液：1克NaNO2溶于1000ml 蒸馏水中配成NaNO2母液。
实验时按处理稀释成要求浓度。
如1微克/ ml ：取母液1ml ，用蒸馏水稀释成1000 ml 。
三．仪器721型分光光度计真空泵保温箱天平真空干燥器打孔器三角瓶移液管烧杯四．试验步骤1．将新鲜取回的材料叶片用水清洗后用吸水纸吸干水份。
用打孔器取下直径为1厘米的圆片，再用蒸馏水洗2－3次，将蒸馏水吸干。
在天平上称取等重的叶子园片两份：每份0.4克左右（或每份取50个圆片）。
将两份圆片分别置于下列两种溶液中，容器使用50ml 三角瓶。
（1）0.1 M 磷酸缓冲液5 ml +蒸馏水5 ml 。
（2）0.1 M 磷酸缓冲液5 ml +0.2 M KNO3溶液5 ml 。
硝酸还原酶活性的测定.
硝酸还原酶活性的测定一、原理硝酸还原酶是植物氮素作用中的关键性酶，与作物吸收和利用N肥有关的不同品种，年龄、器官组织以及环境条件对硝酸还原活性都有影响，硝酸还原酶作用于NO3使还原为NO2NO3⎯+NADH+H→NO2⎯+NAD+H2O产生的NO2⎯可以从组织内渗到外界溶液中，并积累在溶液中因此测定反应溶液中NO2⎯的含量的增加，即表明酶活性的大小。
NO2⎯含量的测定用对氨基苯磺酸化比色法，亚硝酸对氨基苯磺酸和α-萘胺在酸性条件下生成红色化合物，颜色在2-3小时稳定，可用比色法定量，该法非常灵敏，能测定每毫升0.5微克的Na NO2。
二、仪器和药品721型分光光度计（或其他型号比色计），剪刀，真空泵（或注射器），小天平，温箱，烧杯，移液管，小烧杯（50ml）0.2MKNO3：将20、22克KNO3溶于100ml蒸馏水中。
0.1M磷酸缓冲液（PH=7.5）：将85.2%ml 1/15M磷酸氢二钠与14.8ml 1/15M磷酸二氢钾混合均匀。
1/15MNa2HPO4溶液：1000ml中含Na2HPO4•2H2O11.878克。
1/15M溶液：1000ml中含KH2PO49.078克。
对氨基苯磺酸试剂：1克对氨基苯硝酸加加25ml浓HCl，用蒸馏稀释至100ml.。
α–萘胺试剂，0.2克α–萘胺加25ml浓HCl，用蒸馏稀释至100ml。
NaNO2标准溶液：1克NaNO2用蒸馏水溶解至1000ml，然后吸取5ml，再加蒸馏水稀释成1000ml，该溶液每毫升含有NaNO2 5微克，用时稀释之。
三、实验步骤：1、将新鲜叶片（蓖麻、向日葵、小麦、棉花等），用水冲洗净，并用吸水纸吸干，用剪刀剪成小块(注意块小为宜)，然后在小天平上称取等重的两份叶片，每份约0.5克。
分别置于含有下列溶液的小烧杯中。
（1）1M磷酸缓冲溶液5ml+蒸馏水5ml（2）0.1M磷酸缓冲溶液5ml+0.2M KNO35ml然后将小烧杯置于真空干燥器中，接上真空泵抽气，放气后叶片便沉于底部（如没有真空泵，也可以20ml注射器代替，将反应液及叶片一起倒入注射器使之真空，如此进行抽气、放气反复多次，溶液即可渗入叶组织内取代了叶片内的空气，叶片便沉于溶液底部），取出小烧杯置于30℃温箱中，使不见光保温作用30分钟。
硝酸还原酶活性的测定实验报告
硝酸还原酶活性的测定实验报告硝酸还原酶活性的测定实验报告引言：硝酸还原酶是一种重要的酶类，在生物体内起着关键的作用。
它能够将硝酸根离子还原为亚硝酸根离子，参与到氮代谢中。
本实验旨在通过测定硝酸还原酶活性的方法，探究其在不同条件下的变化规律，从而深入了解这一酶的功能及其对生物体的重要性。
材料与方法：1. 实验材料：- 萝卜组织样品- 硝酸还原酶提取液- 硝酸还原酶底物溶液- 甲酚硫酸溶液- 氨水溶液- 高锰酸钾溶液- 氯化亚铁溶液- 硝酸铜溶液- 硫酸亚铁溶液- 硫酸铵铁溶液- 蒸馏水2. 实验方法：- 提取硝酸还原酶：将萝卜组织样品切碎并加入硝酸还原酶提取液，搅拌均匀后离心，取上清液作为硝酸还原酶提取液。
- 测定硝酸还原酶活性：将硝酸还原酶提取液与硝酸还原酶底物溶液混合，反应一段时间后，加入甲酚硫酸溶液停止反应。
然后，分别加入氨水溶液和高锰酸钾溶液，测定吸光度。
- 构建标准曲线：分别取一系列浓度的硝酸铜溶液，加入硫酸亚铁溶液和硫酸铵铁溶液，测定吸光度。
根据吸光度与浓度的关系，绘制标准曲线。
结果与讨论：通过实验测定，我们得到了硝酸还原酶活性的数据，并根据标准曲线计算了不同样品中硝酸还原酶的活性。
首先，我们观察到在不同温度条件下，硝酸还原酶活性的变化。
结果显示，在较低的温度下，硝酸还原酶活性较低，随着温度的升高，酶活性逐渐增加，但在一定温度范围内，酶活性会达到峰值后开始下降。
这表明硝酸还原酶对温度敏感，适宜的温度能够促进酶的活性，但过高的温度则会导致酶的变性和失活。
其次，我们研究了不同pH值对硝酸还原酶活性的影响。
结果显示，在中性pH范围内，硝酸还原酶活性较高，而在酸性或碱性条件下，酶活性明显下降。
这说明硝酸还原酶对于酸碱度有一定的适应范围，过高或过低的pH值都会影响酶的活性。
此外，我们还研究了不同浓度的底物对硝酸还原酶活性的影响。
结果显示，在一定范围内，随着底物浓度的增加，硝酸还原酶活性呈现出增加的趋势。
植物生理学实验实验三 硝酸还原酶活性测定
1. 实验目的意义
硝酸还原酶（EC.1.6.6.1，缩写NR）是硝酸盐同化中第一 个酶，也是限速酶，处于植物氮代谢的关键位置。它与植 物吸收利用氮肥有关，对农作物产量和品质有重要影响， 因而硝酸还原酶活性被当作植物营养或农田施肥的指标之 一，也可作为品种选育的指标之一。
7. 思考题
1） 为何提前一天施KNO3，并且取样应在晴天进行？
2） NR酶活性（ NO2- ，uMol/h•gfw）= [ NO2- ] ×10ml/1ml ÷（鲜重g×0.5h） 公式中的0.5 h 指哪一个？
酶反应要在暗条件下进行的原因是叶绿体在光合作用时可产生 亚硝酸还原酶的辅酶铁氧还蛋白，与亚硝酸还原酶同时存在时 可还原NO2- ，所以在暗条件下进行反应可阻止NO2- 的继续反 应，以保证测定结果的准确。
⑥ 取A液和B液1ml代替反应液，加入2ml磺胺试剂和2mlα-萘胺试剂，作 为对照管，在540nm测定样品的吸光值（以蒸馏水为对照） 。
5. 结果与分析
分析硝酸盐对硝酸还原酶活性的影响。
处理
吸光度 [ NO2- ] NR活性
吸光度 [ NO2- ] NR活性
（uMol/ml）（uMol/h•gfw）
（uMol/ml）（uMol/h•gfw）
[ NO2- ] （uMol/ml）= 0.0026＋0.359OD540 NR活性（ NO2- , uMol/h•gfw）= [ NO2- ] ×10ml/1ml ÷（鲜重g×0.5h）
6. 注意事项
① 抽真空放气后，摇晃直至叶段沉于溶液中； ② 硝酸还原过程应在黑暗中进行； ③ 磺胺试剂和α-萘胺试剂加入时，注意顺序； ④ 正确使用分光光度计； ⑤ 避免移液管使用交叉感染。
实验三 硝酸还原酶活性测定
3. 材料与试剂
两种处理的小麦： 两种处理的小麦：水 (ck)， KNO3（N） ， ） A液：磷酸缓冲液: 水: DNP溶液 蔗糖溶液 ＝ 5: 5: 1: 1 液 磷酸缓冲液 溶液: 溶液 B液：磷酸缓冲液: KNO3: DNP溶液: 蔗糖溶液 ＝ 5: 5: 1: 1 液 溶液
磷酸缓冲液(pH7.5): 0.2mol/L； KNO3溶液 0.2mol/L 溶液: 磷酸缓冲液 ； DNP (2-4-二硝基苯酚 溶液 1mmol/L； 蔗糖溶液 2.5mmol/L 二硝基苯酚)溶液 二硝基苯酚 溶液: ； 蔗糖溶液:
NO2-含量测定（磺胺比色法） 含量测定（磺胺比色法）
在酸性溶液中， 与磺胺形成重氮盐，重氮盐再与α在酸性溶液中，NO2-与磺胺形成重氮盐，重氮盐再与 萘胺偶联，形成紫红色的偶氮化合物。该偶氮化合物在 540nm有最大吸收峰，可以用分光光度计测定（OD540）。 有最大吸收峰， 有最大吸收峰 可以用分光光度计测定（
酶反应要在暗条件下进行的原因是叶绿体在光合作用时可产生 亚硝酸还原酶的辅酶铁氧还蛋白， 亚硝酸还原酶的辅酶铁氧还蛋白，与亚硝酸还原酶同时存在时 可还原NO2- ，所以在暗条件下进行反应可阻止 所以在暗条件下进行反应可阻止NO2- 的继续反 可还原 以保证测定结果的准确。 应，以保证测定结果的准确。
处 理 A液 吸光度 [ NO2- ] NR活性 活性 B液 吸光度 [ NO2- ] NR活性 活性
（uMol/ml）（uMol/h•gfw） ） ）
（uMol/ml）（uMol/h•gfw） ） ）
H2 O KNO3 对照 [ NO2- ] （uMol/ml）= 0.0026＋0.359OD520 ） ＋ NR活性（ NO2- , uMol/h•gfw）= [ NO2- ] ×10ml/1ml ÷（鲜重 ×0.5h） 活性（ 鲜重g× 活性 ） ）
硝酸还原酶(NR)活性的测定
硝酸还原酶(NR)活性的测定硝酸还原酶是一种重要的酶，参与植物的氮代谢和植物的抗逆能力等生理过程。
硝酸还原酶的活性可以反映出植物对外界环境变化的适应能力和生长发育状态。
因此，硝酸还原酶活性的测定具有重要的生物学意义。
一、实验目的本实验主要目的是通过测定植物中硝酸还原酶活性的变化，探究外界环境对硝酸还原酶活性的影响。
另外，本实验还旨在掌握硝酸还原酶活性的检测方法。
二、实验原理硝酸还原酶 (NR) 是一种能将 NO3- 还原为 NO2- 的酶。
其催化反应的速率与硝酸还原酶的活性密切相关。
因此，硝酸还原酶活性的测定，是利用一定体系中 NO3- 还原成NO2- 的速率或反应产物的含量，来评价細胞內硝酸还原酶活性大小的一种生化方法。
实验中通常采用光度法来测定硝酸还原酶的活性。
光度法是将产生的 NO2- 与苯磺酸二苯胺 ( sulfanilamide) 反应生成硝基苯偶氮苯磺酸 (N-(1-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride，NED) ，然后用紫外可见分光光度计测定产生的吸光度。
三、实验步骤3.1 实验前准备1）制备显色液：将 1g 苯磺酸二苯胺和 0.02 g NED 加入 10mL 硫酸中，用水稀释至100 mL 。
2）制备反应液：在无氧条件下，将浓硝酸滴入 50mL 去离子水中，制备100μM 硝酸钾溶液。
3）制备酶提取液：将新鲜植物组织（如叶片、幼芽等）用磨汁机研磨成细胞浆，加入0.05M 磷酸盐缓冲液 (PH=7.5) 中，按 1：5 的比例(即 1g 组织加 5mL 缓冲液) 收集悬液，离心 15 分钟，将上清液称取至 1mL，即为酶提取液。
3.2 检测方法1）在96孔板中加入100μL 酶提取液，40℃孵育20分钟。
2）加入100 μL 反应液，制备最终反应物质的浓度应为：10mM NaNO3、2mM Na2S2O4、0.05M 磷酸盐缓冲液 (pH 7.5)。
硝酸还原酶活力的测定
硝酸还原酶活力的测定1、试剂：（1）亚硝态氮标准溶液称取1 g分析纯NaNO2溶于无离子水并定容至1000mL，然后再吸取1mL定容至1000mL,即为1μg/mL亚硝态氮的标准液。
（2）0、1mol/L pH7、5的磷酸缓冲液称取30、0905 g Na2HPO412H2O与2、4965 g NaH2PO42H2O，加无离子水溶解后定容至1000mL。
（3）10 g/L磺胺溶液称取1、00 g 磺胺溶于100mL3mol/L HCl中（取25mL浓盐酸加无离子水定容至100mL，即为3mol/L HCl）。
（4）0、2 g/L萘基乙烯胺溶液称取0、0200 g 萘基乙烯胺溶于100mL无离子水中，贮于棕色瓶中。
（5）0、1mol/L KNO3溶液称取2、5275 g KNO3 溶于250mL 0、1mol/L pH7、5的磷酸缓冲液。
（6）0、025mol/L pH8、7的磷酸缓冲液称取8、864 g Na2HPO412H2O和0、057 g K2HPO43H2O，溶于1000mL无离子水中。
（7）提取缓冲液称取0、1211 g半胱氨酸和0、0372 gEDTA，溶于100mL 0、025mol/L pH8、7的磷酸缓冲液。
（8）2 mg/mL NADH溶液称取2 mg NADH溶于1mL 0、1mol/L pH7、5的磷酸缓冲液(临用前配制)。
2．实验步骤（1）标准曲线制作取7支15mL干净的试管按表1顺序加入试剂，配成每管含0~2、0μg亚硝态氮的系列标准溶液，摇匀后在25℃下保温30 min，然后在540nm下比色测定，以每管中亚硝态氮的量（μg）为横坐标（x），吸光度值（y）为纵坐标绘制标准曲线或建立回归方程。
试剂管号1234567亚硝酸钠标准液/mL00、20、40、81、21、62、0蒸馏水/mL2、01、81、61、20、80、40、010g/L磺胺/mL44444440、2g/L萘基乙烯胺/mL4444444每管含亚硝态氮量/μg00、20、40、81、21、62、0（2）硝酸还原酶活力测定1、酶液提取取10mL藻液，在4500r/min离心15分钟，去掉上清液，加4mL酶提取液，超声波破碎10min，4℃,4000r/min离心15min,上清液即为粗酶提取液2、酶反应取粗酶液0、4mL加入10mL试管中，再加入1、2mL 0、1mol/L KNO3磷酸缓冲液和0、4mL NADH溶液，在25℃水浴中准确保温30 min。
硝酸还原酶(NR)活性的测定
硝酸还原酶(NR)活性的测定
制作人： 车永梅 单 位： 生命科学学院
一、实验目的
了解硝酸还原酶在氮代谢中的地位，掌握硝酸还
原酶活性测定的方法。
二、实验原理
植物吸收的硝酸根离子，首先通过硝酸还原酶的 催化，被还原成亚硝酸根离子。其反应如下： NO3-+NADH+H+ → NO2-+NAD++H2O 产生的亚硝酸根离子可以从组织内渗到外界溶液中， 测定反应液中亚硝酸含量，通过一定公式计算就可 得硝酸还原酶活性的大小。
2. 取样
3. NaNO2 含量测定
五、实验结果
按下式计算酶活性： NR活性（gNO2-/gFW· h）＝
查表值×(46/69) 材料鲜重（g）×反应时间
六、思考题
1.NR活性测定时取材前为什么要进行一段时间光合
作用？ 2.测定Байду номын сангаас促反应时为什么要在暗处保温？ 3.NR活性测定时加入磺胺、盐酸萘乙二胺和KNO3 的作用各是什么？
试剂（ml）
试管号
1
0 1 2 2 0
2
0.1 0.9 2 2 0.5
3
0.2 0.8 2 2 1
4
0.4 0.6 2 2 2
5
0.6 0.4 2 2 3
6
0.8 0.2 2 2 4
7
1 0 2 2 5
NaNO2标准液(5微克／ml) 蒸馏水 对氨基苯磺酸(或磺胺) 盐酸萘乙二胺(或α-萘胺) 每管含NaNO2的微克数
亚硝酸离子的测定用比色法。其反应如下： 对氨基苯磺酸(或磺胺)+2H++NO2- → 叠氮化合物 叠氮化合物+α-萘胺（或盐酸萘乙二胺） → 偶氮化 合物(红色) 生成的红色偶氮化合物在520nm波长比色，其光密 度值与NO2-含量成正比。
硝酸还原酶活性的测定实验报告
硝酸还原酶活性的测定实验报告一、实验目的硝酸还原酶（NR）是植物氮代谢中的关键酶之一，其活性的高低与植物氮素利用效率密切相关。
本实验旨在掌握硝酸还原酶活性的测定方法，了解不同植物材料或不同处理条件下硝酸还原酶活性的差异，为进一步研究植物氮代谢机制和氮素营养调控提供依据。
二、实验原理硝酸还原酶能够催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐。
在一定条件下，产生的亚硝酸盐量与硝酸还原酶活性成正比。
通过测定反应体系中亚硝酸盐的含量，可以间接反映硝酸还原酶的活性。
本实验采用磺胺比色法测定亚硝酸盐含量。
在酸性条件下，亚硝酸盐与磺胺发生重氮化反应，生成重氮盐，再与 N（1-萘基）乙二胺盐酸盐（NED）偶联，形成红色偶氮化合物。
该化合物在 540nm 波长处有最大吸收峰，其吸光度与亚硝酸盐含量成正比。
三、实验材料、仪器与试剂1、实验材料选取新鲜的植物叶片，如小麦、玉米、大豆等。
2、仪器分光光度计、离心机、恒温水浴锅、移液器、研钵、容量瓶、刻度试管等。
3、试剂（1）01mol/L pH 75 的磷酸缓冲液；（2）02mol/L KNO₃溶液；（3）1%磺胺溶液（磺胺溶于 30%乙酸中）；（4）002% N（1-萘基）乙二胺盐酸盐溶液（NED）；（5）5μg/mL 亚硝酸钠标准溶液。
四、实验步骤1、酶液提取称取新鲜植物叶片 05g，剪碎后放入研钵中，加入 5mL 01mol/L pH 75 的磷酸缓冲液，在冰浴中研磨成匀浆。
将匀浆转移至离心管中，在4℃下以 10000r/min 离心 15min，上清液即为酶提取液。
2、反应体系设置取两支刻度试管，分别标记为对照管（CK）和测定管（T）。
对照管：加入 1mL 01mol/L pH 75 的磷酸缓冲液和 1mL 02mol/L KNO₃溶液。
测定管：加入 1mL 酶提取液和 1mL 02mol/L KNO₃溶液。
将两支试管置于 30℃恒温水浴锅中保温 30min。
3、终止反应保温结束后，向对照管和测定管中分别加入 1mL 磺胺溶液和 1mL NED 溶液，摇匀，以终止反应。
实验报告-硝酸还原酶活性的测定
实验报告-硝酸还原酶活性的测定实验目的：通过测定差示分光光度法下重铬酸钾氧化还原的反应，间接测定硝酸还原酶的活性。
实验原理：硝酸还原酶是一种以二价铁离子为电子受体的酶，能将NO2-还原为NO，是硝化作用的逆反应。
硝酸还原酶活性含量的测定常用于土壤、水环境等环境污染的检测。
本实验采用差示分光光度法来测定硝酸还原酶活性。
本实验中的差示分光光度法，利用重铬酸钾通过氧化还原反应，证明硝酸还原酶活性的存在。
重铬酸钾可以与硫酸铵和硝酸根离子反应，生成过氧化双铬离子和金属铵盐，同时溶液中的硝酸根离子被还原成氨氮产生气体释放出来。
通过测定溶液中氨氮的浓度，就可以计算出硝酸还原酶的活性含量。
实验步骤：1.准备A、B、C三个样品液。
A液：葡萄糖酸钙0.2g、1.5ml缓冲溶液、0.3ml菌液，加水至50ml。
B液：A液中再加菌液0.1ml。
C液：A液中再加无菌蒸馏水0.1ml代替菌液。
2.分别在三个位于水浴中的试管中加入A、B、C液各5ml并在水浴中孵育30分钟。
3.在孵育A液和C液试管的时间中，用硫酸铵和硝酸铵配制1%的硝酸根离子的溶液，重铬酸钾以及0.05%的草酸铁溶液。
4.在孵育后立即对A、B、C液各加入10ml配制好的硝酸根离子溶液。
5.再依次加入相同体积的重铬酸钾、草酸铁溶液，灵敏管测定氨氮的相对吸收值。
实验结果：样品重铬酸钾溶液的吸光度草酸铁溶液的吸光度比值氨氮浓度（mg/L）A 0.87 0.28 3.11 4.7B 0.77 0.25 3.08 4.6C 0.05 0.03 1.67 2.5实验分析：由上表可知，A、B两个样品的吸光度比值相差不太明显，说明A液中添加的0.1ml菌液对硝酸还原酶的活性没有显著的提高作用，而C液则比较显著地破坏了硝酸还原酶的活性，其氨氮浓度只有A、B两个样品的一半。
通过本次实验的差示分光光度法测定硝酸还原酶活性的方法，我们发现添加微生物菌液可以提高硝酸还原酶的活性，而加入无菌蒸馏水则会对其产生损害。
硝酸还原酶(NR)活性测定
实验三：硝酸还原酶（NR）活性测定一、实验目的了解硝酸还原酶的活性测定的原理，掌握活体测定硝酸还原酶地方法二、实验原理硝酸还原酶是植物氮元素代谢过程中的关键酶，于作物的吸收和利用氮元素有关，他们作用于硝酸根，使之还原为亚硝酸根根：NO3-+NADH++H+ NR NO2-+NAD++H2O产生的亚硝酸根可以从组织内渗入到外界溶液中，从而测定溶液中亚硝酸根的含量的增加即为NR活性大小测定时间磺胺与亚硝酸钠形成重氮盐，再与α-奈氨偶联形成紫色物质。
反应液的酸度和温度都会对反应产生影响。
三、试剂与器材1、材料：小白菜叶片2、试剂：0.1mol/L ph7.5磷酸缓冲液，磺胺试剂、α-奈氨、0.2mol/LKNO3、NaNO2标准溶液3、器材：分光光度计、注射器、试管、天平、烧杯、移液管、恒温箱四、实验步骤1、按下列表格配置不同浓度的NaNO2溶液2、另取7支试管编号，取上述配置好的溶液各1ml，分别加入磺胺2ml、α-奈氨2ml摇匀静置30min，在520nm处比色以NaNO2终浓度为横坐标绘制标准曲线3、将小白菜叶片剪成0.5cm2大小称取两分，每份各0.5g放入另个烧杯中，一个烧杯中加入0.1ml/L磷酸缓冲液5ml再加入蒸馏水5ml，作为对照组。
林一个烧杯中加入0.1mol/L磷酸缓冲液5ml和0.2mol/LKNO3溶液5ml作为实验组。
将材料与溶液混合置于射器中抽气至材料沉入溶液。
4、将含材料的烧杯置于30℃恒温箱中30min，之后分别取1ml溶液按第二步进行NO2-含量测定5、结果分析：酶活性（NO2- μg g-1h-1）=（实验组NO2-含量-对照组NO2-含量）/材料重量（g）/时间（h）五、实验结果实验分析及感悟:由于实验过程中，移液管的混用可能会导致部分溶液污染导致实验产生误差。
叶片剪切的由于抽气不够是结果偏小。
本次试验经历了很长时间，我们从上午10点一直做到下午一点才做完。
当然经过努力的数据分析我们最终得到了我们所渴求的实验结果。
硝酸还原酶活性测定实验报告
硝酸还原酶活性测定实验报告硝酸还原酶（nitrate reductase）是峰莱斯郎（Pierre van Laerzem）和卡尔·诺顿·塞尔西格（Carl Norton Searcy）于1943年发现的一种负责将硝酸还原为亚硝酸的酶。
该酶在许多生物体中都很常见，包括细菌、真菌、植物和动物等。
硝酸还原酶在土壤中特别重要，因为它可以将植物的主要氮源硝酸盐还原为植物可以利用的亚硝酸盐。
本实验旨在测定硝酸还原酶活性，从而了解该酶在样本中的含量及其催化亚硝酸盐的能力。
下面将详细介绍实验步骤和结果。
实验步骤：1. 取样本：从实验样本中获取合适的样品，如土壤样品、植物组织等。
2. 制备样品提取液：将样品加入合适的缓冲液中（一般为磷酸盐缓冲液），并进行均匀混合。
3. 离心：离心样品提取液，以去除悬浮的杂质及固体颗粒。
4. 超声处理：用超声波仪器对样品进行超声处理，破坏细胞结构，释放出硝酸还原酶。
5. 萃取：将样品提取液进行适度的萃取，以得到含有硝酸还原酶的萃取液。
6. 酶活性分析：将萃取液与适量的硝酸盐和辅助酶（如辅酶、酶辅酶等）混合，并在适合的温度和pH条件下孵育，一段时间后停止反应。
7. 颜色反应：使用格里希法或其他适当的方法，在反应停止后通过颜色反应测定亚硝酸盐的生成量。
亚硝酸盐的浓度与硝酸还原酶活性成正比。
8. 计算硝酸还原酶活性：根据样品的反应结果和标准曲线，计算出硝酸还原酶的活性。
实验结果：实验结果应包括标本中硝酸还原酶的活性以及对照组的活性值。
通常，对照组是以无酶萃取物为基准进行分析。
硝酸还原酶活性的测定单位为μmol/min/g（或μmol/h/g）。
讨论和结论：根据实验结果，可以比较不同样本之间的硝酸还原酶活性。
较高的活性值表明样本中含有较高水平的硝酸还原酶。
这可以用来评估土壤氮素转化能力、植物对硝酸盐的吸收能力等。
同时，本实验的成功与否也与实验流程相连。
在实验中，合适的采样技术、样品提取和超声处理等步骤对保证提取液中酶的完整性和活性至关重要。
硝酸还原酶活性的测定
2. NO2- 含量测定
反应液1ml 反应液 磺胺试剂2ml 磺胺试剂 α- 萘胺 萘胺2ml 搅匀，静置30min 搅匀，静置
比色A520 比色
3. 计算 C×反应液总体积（10ml） ×反应液总体积（ ） ＝ 反应时间（0.5hr） 样品重量（g） 反应时间（0.5hr）×样品重量（g） ug / g·FW·h
作业： 作业：
测定硝酸还原酶活性时，反应过程中为何要在避光 测定硝酸还原酶活性时， 条件下进行？ 条件下进行？
实验三 硝酸还原酶活性的测定 活体法） （活体法）
【实验原理】 实验原理】
本身不存在该酶， 本身不存在该酶，外加 NO3-，诱导生成 ，
硝酸还原酶（ ） 该酶为诱导酶 诱导酶。 硝酸还原酶（NR）是植物氮素代谢作用中的关键性的酶 ，该酶为诱导酶。
NO3
NR
NO2
- 可以从细胞中很快地分泌到反应液中， NO2 可以从细胞中很快地分泌到反应液中，故只要测
⑴ 叶片水洗吸干
钻孔得小圆片（直径 钻孔得小圆片（直径1cm） ）
称取2份 每份 称取 份，每份0.4g
NO.1: 磷酸缓冲液 5ml ＋蒸馏水 5ml ⑵ 取2只三角瓶 只三角瓶 NO.2: 磷酸缓冲液 5ml ＋0.2M KNO3 5ml
⑶ 加入叶片
抽气至叶片沉淀（抽气彻底，以使溶液与质膜充分接触， ⑷ 抽气至叶片沉淀（抽气彻底，以使溶液与质膜充分接触，使反应 顺利进行） 顺利进行）
的增加，可计算该酶活性的大小。 定反应液中的 NO2- 的增加，可计算该酶活性的大小。
NO2 ＋ 磺胺
酸性 重氮盐 ＋ α- 萘胺 紫红色偶氮染料
小时内稳定） （颜色在2～3小时内稳定） 颜色在 ～ 小时内稳定
实验报告-硝酸还原酶活性的测定
首都师范大学生命科学学院实验报告课程名称植物生理实验实验时间2010331 成绩__________ 姓名唐倪文班级_3 __________ 学号1090800032实验题目硝酸还原酶活性的测定_______________________________________一、实验原理硝酸还原酶是植物氮素作用中的关键性酶，硝酸还原酶作用于NO使之还原为NO。
NO-+ NADH + H+—NO2- + NAD+ + H2O产生的NO可以从植物组织渗透到外界溶液中，积累在溶液中。
因此，测定反应液中NO含量的增加即表明酶活性的大小。
NO含量的测定----磺胺法NO 2-与磺胺和:-萘胺在酸性条件下生成粉红色化合物，用比色法在520nm下读取光密度值。
二、实验用品1. 材料：完全营养的小麦苗，缺氮培养的小麦苗2. 仪器和用具：722型分光光度计，剪刀，真空泵，电子天平，温箱，烧杯，移液枪，tip 头(两种规格：1000卩I，200卩I )三、实验步骤1. 分别配制反应液于小烧杯中(1) 0.1M 磷酸缓冲液5ml +蒸馏水5ml(2) 0.1M 磷酸缓冲液5ml + 0.2MKNQ 5ml2. NO2-的获得(1) 称取新鲜叶片0.5g共四份,剪成小片，分别置于小烧杯内的反应液中。
(2) 在真空干燥器中抽气20min,使叶片沉于溶液底部，溶液即可渗入组织内取代其中的空气，内部产生的NO可渗透到外部溶液中。
3. 将小烧杯转到30 T温箱，使其不见光，保温20min。
4. 用5卩g/ml NaNO2母液配制标准梯度溶液5、4、3、2、1、0.5、0.1、0 卩g/ml。
5. 吸取不同浓度的NaNOml于试管中，加入磺胺试剂2ml及a -萘胺试剂2ml，混合均匀，在60C水浴中保温20min,于比色杯中，在520nm下进行比色，读取光密度，然后做出光密度一浓度曲线，以光密度为纵坐标，NaN染度为横坐标。
具体步骤及结果如下表和下图所示。
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2. 实验原理
硝酸还原酶可将NO3-还原成NO2- ，其反应为：
NO3- + NADH + H+
NR
NO2- + NAD+ + H2O
在一定条件下，NO2- 的生成量与硝酸还原酶的活性 呈正相关，因此，可以测定NO2- 的生成量来代表硝酸还 原酶的NR活性。
NO2-含量测定（磺胺比色法）
在酸性溶液中，NO2-与磺胺形成重氮盐，重氮盐再与α萘胺偶联，形成紫红色的偶氮化合物。该偶氮化合物在 540nm有最大吸收峰，可以用分光光度计测定（OD540）。
公式中的0.5 h 指哪一个？
酶反应要在暗条件下进行的原因是叶绿体在光合作用时可产生 亚硝酸还原酶的辅酶铁氧还蛋白，与亚硝酸还原酶同时存在时 可还原NO2- ，所以在暗条件下进行反应可阻止NO2- 的继续反 应，以保证测定结果的准确。
5. 结果与分析
分析硝酸盐对硝酸还原酶活性的影响。
处 理 吸光度 A液 [ NO2- ] 吸光度 B液 [ NO2- ]
NR活性
NR活性
（uMol/ml）（uMol/h•gfw）
（uMol/ml）（uMol/h•gfw）
H2 O KNO3 对照 [ NO2- ] （uMol/ml）= 0.0026＋0.359OD520 NR活性（ NO2- , uMol/h•gfw）= [ NO2- ] ×10ml/1ml ÷（鲜重g×0.5h）
硝酸还原酶活性测定
离体法：将材料磨成匀浆，经过滤或离心除去残渣，以上清液 为硝酸还原酶粗酶液进行测定。 缺点：由于研磨中NADH受损失，必需外加NADH方可测定。
活体法：直接用鲜活组织进行测定。环境中的NO3-进入细胞后 被NR还原成NO2-，并扩散到细胞外在溶液中积累，测 定溶液中NO2- 的含量即可得知NR的大小。 优点：不破坏细胞原有的酶反应系统，NADH可由代谢反应不 断生成，无需外加。简便、快速，不需要贵重仪器设 备及低温条件。 缺点: 重复性欠佳，应作一定量的重复。
两种处理的小麦幼苗叶片 中段各取0.3g (各2份)
水(ck)
KNO3 （N）
A液 B液 放气后摇晃直至叶 段沉于溶液中
10 ml
A液
B液
抽气30分钟 25～30℃温箱中黑暗保温30分钟 取A液或B液1ml 代替反应液作为 对照管
取1ml反应液+2ml磺胺试剂+2ml α-萘胺试剂 注意加液顺序 混匀 25 ℃水浴反应5分钟 取出后桌面静置10分钟 540 nm测定样品的吸光值
实验3 硝酸盐和光诱导对硝酸还原 酶（NR）活性的影响
硝酸还原酶
植物从土壤中吸收的NO3－必须经代谢性还原才能被利用，因 为细胞组分中的N均呈高度还原态，而NO3－中的N为高度氧化 态。
受光促进
硝酸盐的还原由硝酸还原酶(nitrate reductase, NR)催化。 硝酸还原酶存在于细胞液中，为一种诱导酶。 诱导酶(induced enzyme):植物体本来不含有，但在特定外 来物质(如底物)的诱导下,可以产生的酶。
6. 注意事项
① 抽真空放气后，摇晃直至叶段沉于溶液中； ② 硝酸还原过程应在黑暗中进行；
③ 磺胺试剂和α-萘胺试剂加入时，注意顺序；
④ 正确使用分光光度计； ⑤ 避免移液管使用交叉感染。
7. 思考题
1） 为何提前一天施KNO3，并且取样应在晴天进行？ 2） NR酶活性（ NO2- ，uMol/h•gfw）= [ NO2- ] ×10ml/1ml ÷（鲜重g×0.5h）
磺胺试剂 α-萘胺试剂
4. 实验步骤
① 取样前一天，用50mM KNO3加到培养小麦的水中，光照，以诱导硝酸 还原酶产生。
② 两种材料[水(ck)，KNO3 (N)]各取2份新鲜叶片中段，用蒸馏水洗净、 擦干，剪成1cm小段，称取0.3克；将4份（ck、N）叶段分别置于含有 10ml A、B溶液的两只试管中，即ckA、ckB、NA和NB四管； ③ 用纱布将材料压于试管底部，将试管放在真空干燥器中抽气30分钟， 放气后摇晃直至叶段沉于溶液中； ④ 将试管置于25～30℃温箱中，黑暗保温30分钟； ⑤ 立即吸取1ml反应液，加入2ml磺胺试剂，摇匀，再加入2mlα-萘胺试剂 （注意顺序），用漩涡仪混合摇匀，25 ℃水浴（水浴锅）反应5分钟, 取出后桌面静置10分钟，随后5分钟内，在540nm测定样品的吸光值 （以蒸馏水为对照）。 ⑥ 取A液和B液1ml代替反应液，加入2ml磺胺试剂和2mlα-萘胺试剂，作 为对照管，在540nm测定样品的吸光值（以蒸馏水为对照） 。
（不稳定，见光容易分解，测定需迅速。）
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
当磺胺与α-萘胺均过量时，所生成的红色深浅与NO2-含量成 直线关系。 NO2-含量标准曲线： [ NO2- ](µ mol/ml) = 0.0026＋0.359OD540 [NO2-] (µ mol/ml)×稀释倍数 鲜重(g)×时间(h)
NR活性(NO2- , µmol/h•gfw) =
3. 材料与试剂
两种处理的小麦：水 (ck)， KNO3（N） A液：磷酸缓冲液: 水: DNP溶液: 蔗糖溶液 ＝ 5: 5: 1: 1 B液：磷酸缓冲液: KNO3: DNP溶液: 蔗糖溶液 ＝ 5: 5: 1: 1
磷酸缓冲液(pH7.5): 0.2mol/L； KNO3溶液: 0.2mol/L DNP (2-4-二硝基苯酚)溶液: 1mmol/L； 蔗糖溶液: 2.5mmol/L
1. 实验目的意义
硝酸还原酶（EC.1.6.6.1，缩写NR）是硝酸盐同化中第一 个酶，也是限速酶，处于植物氮代谢的关键位置。它与植 物吸收利用氮肥有关，对农作物产量和品质有重要影响， 因而硝酸还原酶活性被当作植物营养或农田施肥的指标之 一，也可作为品种选育的指标之一。
掌握硝酸还原酶活性的测定方法 了解硝酸还原酶的特性