实验三_硝酸还原酶活性测定

5. 结果与分析
分析硝酸盐对硝酸还原酶活性的影响。
处 理 吸光度 A液 [ NO2- ] 吸光度 B液 [ NO2- ]
NR活性
NR活性
（uMol/ml）（uMol/h•gfw）
（uMol/ml）（uMol/h•gfw）
H2 O KNO3 对照 [ NO2- ] （uMol/ml）= 0.0026＋0.359OD520 NR活性（ NO2- , uMol/h•gfw）= [ NO2- ] ×10ml/1ml ÷（鲜重g×0.5h）
6. 注意事项
① 抽真空放气后，摇晃直至叶段沉于溶液中； ② 硝酸还原过程应在黑暗中进行；
③ 磺胺试剂和α-萘胺试剂加入时，注意顺序；
④ 正确使用分光光度计； ⑤ 避免移液管使用交叉感染。
7. 思考题
1） 为何提前一天施KNO3，并且取样应在晴天进行？ 2） NR酶活性（ NO2- ，uMol/h•gfw）= [ NO2- ] ×10ml/1ml ÷（鲜重g×0.5h）
硝酸还原酶活性测定
离体法：将材料磨成匀浆，经过滤或离心除去残渣，以上清液 为硝酸还原酶粗酶液进行测定。 缺点：由于研磨中NADH受损失，必需外加NADH方可测定。
活体法：直接用鲜活组织进行测定。环境中的NO3-进入细胞后 被NR还原成NO2-，并扩散到细胞外在溶液中积累，测 定溶液中NO2- 的含量即可得知NR的大小。 优点：不破坏细胞原有的酶反应系统，NADH可由代谢反应不 断生成，无需外加。简便、快速，不需要贵重仪器设 备及低温条件。 缺点: 重复性欠佳，应作一定量的重复。
磺胺试剂 α-萘胺试剂
4. 实验步骤
① 取样前一天，用50mM KNO3加到培养小麦的水中，光照，以诱导硝酸 还原酶产生。
② 两种材料[水(ck)，KNO3 (N)]各取2份新鲜叶片中段，用蒸馏水洗净、 擦干，剪成1cm小段，称取0.3克；将4份（ck、N）叶段分别置于含有 10ml A、B溶液的两只试管中，即ckA、ckB、NA和NB四管； ③ 用纱布将材料压于试管底部，将试管放在真空干燥器中抽气30分钟， 放气后摇晃直至叶段沉于溶液中； ④ 将试管置于25～30℃温箱中，黑暗保温30分钟； ⑤ 立即吸取1ml反应液，加入2ml磺胺试剂，摇匀，再加入2mlα-萘胺试剂 （注意顺序），用漩涡仪混合摇匀，25 ℃水浴（水浴锅）反应5分钟, 取出后桌面静置10分钟，随后5分钟内，在540nm测定样品的吸光值 （以蒸馏水为对照）。 ⑥ 取A液和B液1ml代替反应液，加入2ml磺胺试剂和2mlα-萘胺试剂，作 为对照管，在540nm测定样品的吸光值（以蒸馏水为对照） 。
（不稳定，见光容易分解，测定需迅速。）
当磺胺与α-萘胺均过量时，所生成的红色深浅与NO2-含量成 直线关系。 NO2-含量标准曲线： [ NO2- ](µ mol/ml) = 0.0026＋0.359OD540 [NO2-] (µ mol/ml)×稀释倍数 鲜重(g)×时间(h)
NR活性(NO2- , µmol/h•gfw) =
1. 实验目的意义
硝酸还原酶（EC.1.6.6.1，缩写NR）是硝酸盐同化中第一 个酶，也是限速酶，处于植物氮代谢的关键位置。它与植 物吸收利用氮肥有关，对农作物产量和品质有重要影响， 因而硝酸还原酶活性被当作植物营养或农田施肥的指标之 一，也可作为品种选育的指标之一。
掌握硝酸还原酶活性的测定方法 了解硝酸还原酶的特性
3. 材料与试剂
两种处理的小麦：水 (ck)， KNO3（N） A液：磷酸缓冲液: 水: DNP溶液: 蔗糖溶液 ＝ 5: 5: 1: 1 B液：磷酸缓冲液: KNO3: DNP溶液: 蔗糖溶液 ＝ 5: 5: 1: 1
磷酸缓冲液(pH7.5): 0.2mol/L； KNO3溶液: 0.2mol/L DNP (2-4-二硝基苯酚)溶液: 1mmol/L； 蔗糖溶液: 2.5mmol/L
2. 实验原理
硝酸还原酶可将NO3-还原成NO2- ，其反应为：
NO3- + NADH + H+
NR
NO2- + NAD+ + H2O
在一定条件下，NO2- 的生成量与硝酸还原酶的活性 呈正相关，因此，可以测定NO2- 的生成量来代表硝酸还 原酶的NR活性。
NO2-含量测定（磺胺比色法）
在酸性溶液中，NO2-与磺胺形成重氮盐，重氮盐再与α萘胺偶联，形成紫红色的偶氮化合物。该偶氮化合物在 540nm有最大吸收峰，可以用分光光度计测定（OD540）。
公式中的0.5 h 指哪一个？
酶反应要在暗条件下进行的原因是叶绿体在光合作用时可产生 亚硝酸还原酶的辅酶铁氧还蛋白，与亚硝酸还原酶同时存在时 可还原NO2- ，所以在暗条件下进行反应可阻止NO2- 的继续反 应，以保证测定结果的准确。
两种处理的小麦幼苗叶片 中段各取0.3g (各2份)
水(ck)
KNO3 （N）
A液 B液 放气后摇晃直至叶 段沉于溶液中
10 ml
A液
ห้องสมุดไป่ตู้B液
抽气30分钟 25～30℃温箱中黑暗保温30分钟 取A液或B液1ml 代替反应液作为 对照管
取1ml反应液+2ml磺胺试剂+2ml α-萘胺试剂 注意加液顺序 混匀 25 ℃水浴反应5分钟 取出后桌面静置10分钟 540 nm测定样品的吸光值
实验3 硝酸盐和光诱导对硝酸还原 酶（NR）活性的影响
硝酸还原酶
植物从土壤中吸收的NO3－必须经代谢性还原才能被利用，因 为细胞组分中的N均呈高度还原态，而NO3－中的N为高度氧化 态。
受光促进
硝酸盐的还原由硝酸还原酶(nitrate reductase, NR)催化。 硝酸还原酶存在于细胞液中，为一种诱导酶。 诱导酶(induced enzyme):植物体本来不含有，但在特定外 来物质(如底物)的诱导下,可以产生的酶。