大豆蛋白改性酶解制备大豆肽的研究
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鉴定 ［J］ ． 质谱学报， 2009， 30 （3）： 171～174．
基 金 项 目 ： 科 技 部 农 业 科 技 成 果 转 化 资 金 项 目 （2009GB2C600198）； 山东省自主创新成果转化重大专项 （2009ZHZX1A1303） 收稿日期： 2010－07－15 作者简介： 徐同成 （1980—）， 男 ， 助 理 研 究 员 ， 博 士 ， 主 要 从 事 粮 油加工及其营养与安全评价研究。 通讯作者： 杜方岭 （1972—）， 男 ， 研 究 员 ， 所 长 ， 主 要 从 事 粮 油 加 工研究。 通信地址： （250100） 济南市工业北路 198 号
【关键词】 大豆分离蛋白； 大豆肽； 大豆蛋白改性酶； 抗氧化 中图分类号： TQ 936．2 文献标识码： A 文章编号： 1673-7199(2010)11-0038-05
大豆含有丰富的油脂和蛋白质， 其中蛋白质占 40％左 右 。 大 豆 蛋 白 质 含 有 全 部 人 体 的 8 种 必 需 氨 基 酸， 且比例合理， 赖氨酸含量可以与动物蛋白相媲美， 而且具有优良的乳化性、 发泡性和黏结性， 目前成为 食品加工业的重要原料。 但是， 大豆蛋白质的分子量 大， 低 pH 值时溶解度低， 高浓度时黏度大， 含有腹胀 因子、 胰蛋白酶抑制剂、 血球凝集素等抗营养因子， 消化率和生物效价远不及牛奶等动物蛋白， 因此限制
min 离心 15min， 取上清液冻干。 1．3．3 大豆肽的分子量分布
大豆肽的分子量测定参照 GB ／ T 22492－2008。 采用日本岛津高效液相色谱系统， 在一定条件下， 以蛋白质分子量标准品和肽分子量标准品的色谱图为 标准， 得到相对分子质量校正曲线及其方程， 将大豆 肽样品溶液在同等条件下色谱分析后 ， 用 GPC 软件进 行数据处理， 用峰面积归一法计算得到不同肽段相对 分子质量分布。 1．3．4 大豆肽的抗氧化能力 大豆肽对超氧阴离子 （O2·－） 的清除能力测定采用 邻 苯 三 酚 自 养 化 法 ， 大 豆 肽 对 羟 自 由 基 （·OH） 的 清 除能力测定采用邻二氮菲－Fe2＋氧化法。 2 结果与分析 2．1 大豆蛋白改性酶水解大豆分离蛋白的单因素试验 2．1．1 底物浓度对水解的影响 水解条件： 酶和底物比 8 000U ／ g， 温度 50℃， pH 值 7．5， 水 解 时 间 4h。 以 水 解 度 为 指 标 研 究 10、 20、 30、 40、 50g ／ L 的底物浓度对水解的影响， 结 果如图 1 所示。 大豆蛋白改性酶水解大豆分离蛋白在水溶液中进 行， 大豆分离蛋白不易溶解于水而是分散在水中形成 悬浊液， 随着蛋白浓度的增加溶液的黏度增加， 分散 性变差。 由图 1 可知： 底物浓度对水解度的影响很大， 水解度随着底物浓度的增加而显著下降。 实际生产中 不仅要考虑水解度， 还要考虑生产效率， 选择合适的 蛋白浓度。 2．1．2 酶与底物比对水解的影响 水 解 条 件 ： 底 物 浓 度 20g ／ L， 温 度 50℃ ， pH 值 7．5， 水解时间 4h。 以水解度为指标研究 4 000、 6 000、
水解条件： 底物浓度 20g ／ L， 酶和底物比 8 000U ／ g， 温度 50℃， pH 值 7．5。 以水解度为指 标 研 究 2、 3、 4、 5、 6h 的水解时间对水解的影响， 结果如图 3 所示。
图 4 pH 值对水解度的影响 所示。
由 图 4 可 知 ： 在 pH 值 小 于 7．5 时 ， 水 解 度 随 pH 值的升高显著提高； 在 pH 值大于 7．5 时， 水解度随 pH 值 增 加 逐 渐 降 低 ； 在 pH 值 为 7．5 时 ， 水 解 度 达 到 最 大。 这是因为大豆分离蛋白的等电点为酸性， 在中性 偏酸性条件下， 溶解度会进一步降低， 水解度受到酶 催化活性和底物溶解性的双重影响而变化较大； 在偏 碱性条件下， 水解度只受到酶催化活性的影响。 因此， 本试验条件下， 大豆蛋白改性酶水解大豆分离蛋白的 最适 pH 值为 7．5。 2．1．5 水解温度对水解的影响
技术·油脂工程 ＞＞＞
CEREALS AND OILS PROCESSING
大豆蛋白改性酶解制备大豆肽的研究
邹险峰 陈 星 李晓磊 李 丹 高长城 （长春大学农产品深加工重点实验室）
【摘要】 利用大豆蛋白改性酶水解大豆分离蛋白制备大豆肽， 以单因素试验和正交试验确定 酶解最佳条件， 通过高效液相法分析大豆肽的分子量分布， 并检测了大豆肽的体外抗氧化效果。 结 果 显 示 ： 在 20g ／ L 的 底 物 浓 度 下 的 最 佳 条 件 为 酶 和 底 物 比 8 000U ／ g、 温 度 55℃、 pH 值 7．5、 水解时间 5h， 水解度为 51．4％。 大豆肽主要为 130～1 000u 的短肽， 占肽总量的 86．3％。 大豆肽对 超氧阴离子 （O2·－） 和羟自由基 （·OH） 的 半 最 大 清 除 浓 度 分 别 为 1．3mg ／ mL 和 8．0mg ／ mL。 表 明大豆蛋白改性酶对大豆分离蛋白的水解能力较强， 大豆肽有较强的抗氧化功能。
图 1 底物浓度对水解度的影响
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8 000、 10 000、 12 000U ／ g 的 酶 与 底 物 比 对 水 解 的 影 响， 结果如图 2 所示。
图 2 酶与底物比对水解度的影响
在工业酶解生产大豆肽中， 酶浓度是影响成本的 重要因素。 本试验采用大豆蛋白改性酶固态直接掺入 水相反应体系， 操作简便。 由图 2 可知： 在底物浓度 一定时， 随着酶浓度的增加， 水解度呈上升趋势， 但 是当酶与底物比达到 8 000U ／ g 时， 水解度基本达到峰 值， 继续增加酶与底物比水解度增加有限。 从经济上 考虑， 酶与底物比对为 8 000U ／ g 较为合适。 2．1．3 水解时间对水解的影响
了大豆蛋白质的利用。 近年来， 通过酶法水解大豆蛋 白得到大豆肽已经得到了科学界的重视。 大豆肽分子 量小、 溶解度高、 黏度低、 在体内消化吸收快、 抗原 性低， 而且具有抗疲劳、 抗氧化、 降血压、 降低胆固 醇、 提高免疫力、 抗肿瘤以及控制肥胖等多种生理功 能， 使其应用范围大大扩大， 提高了大豆产品的附加 值。
水解条件： 底物浓 度 20g ／ L， 酶 和 底 物 比 8 000U ／ g， pH 值 7．5， 水解时间 5h。 以水解度为指标研究 40、 45、 50、 55、 60℃的水解温度对水解的影响， 结果如图 5 所示。
图 3 水解时间对水解度的影响
由图 3 可知： 随着酶解时间的增加， 蛋白水解度 逐渐增大， 在 5h 左右达到最大， 继续延长反应时间水 解度不再增加。 这是因为蛋白酶对热敏感， 随时间延 长会逐渐失活。 因此， 本试验条件下， 大豆蛋白改性 酶水解大豆分离蛋白的最适反应时间为 5h。 2．1．4 pH 值对水解的影响
FDU －2100 型 冷 冻 干 燥 仪 ， 日 本 EYELA 公 司 ； pHS－2 型精密酸度计， 上海雷 磁仪器厂； J－26XP 型高 速冷冻离心机， 美国 BECKMAN COULTER 公司； LC－ 20A 型 高 效 液 相 色 谱 仪 、 2201 型 紫 外－可 见 分 光 光 度 仪， 日本岛津公司。 1．3 方法 1．3．1 指标测定
The oily press； 1993． ［17］ Brockerhoff H． A stereospecific analysis of triglycerides ［J］ ． J
Lipid Res， 1965 （6）： 10～15． ［18］ 林 晓 珊 ， 黄 晓 兰 ， 吴 惠 勤 ， 等． 蚕 蛹 油 中 脂 肪 酸 组 成 及 其 酯 型
大豆分离蛋白是将豆粕去除大豆油和水溶性非蛋
酸组成的分析 ［J］ ． 乳业科学与技术， 2009 （135）： 71～73． ［12］ Williams JP， Khan MU， Wong D． A simple technique for the
analysis of positional distribution of fatty acids on di－ and triacylglycerols using lipase and phospholipase A2 ［ J］ ． J Lipid Res， 1995， 36 （6）： 1407～1412． ［13］ 赵雷， 刘国琴， 李琳， 等． 声波加速脂肪酸价值花的研究 ［J］ ． 中国油脂， 2008， 33 （1）： 33～36． ［14］ 范亚苇 ， 邓 泽 元 ， 余 永 红 ， 等． 不 同 脂 肪 酸 甲 酯 化 方 法 对 共 轭 亚油酸分析的影响 ［J］ ． 中国油脂， 2007， 32 （1）： 52～55． ［15］ Park Y， Albright KJ， Cai ZY， et al． Comparison of methylation procedures for conjugated linoleic acid and artifact formation by commercial （trimethylsilyl） diazomethane ［J］ ． J Agric Food Chem， 2001， 49 （3）： 1158～1164． ［ 16］ Christie WW． Advances in lipid methodology －two． Dundee：
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＜＜＜ 油脂工程·技术
CEREALS AND OILS PROCESSING
Fra Baidu bibliotek
白组分后得到的一种蛋白质含量不少于 90％的混合物， 其组成、 结构和性质与大豆蛋白相似， 基本可以代表 纯的大豆蛋白。 目前， 用于大豆蛋白水解的酶类主要 包括： 碱性蛋白酶、 中性蛋白酶、 木瓜蛋白酶、 胃蛋 白酶、 胰蛋白酶， 或者采用双酶复合水解。 大豆蛋白 改性酶是目前工业生产大豆蛋白粉的生物复合酶， 用 于提高大豆蛋白粉的溶解性和分散性， 将大豆蛋白改 性酶用于生产大豆肽还未见报道。 本研究采用大豆蛋 白改性酶作为水解酶水解大豆分离蛋白， 研究了酶解 条件， 并对酶解产物大豆肽的清除活性氧自由基的效 果进行了分析， 为大豆肽的工业生产提供理论依据。
大豆分离蛋白→调浆→酶解→灭酶→酸沉离心分离→ 上清液冷冻干燥
准确称量大豆分离蛋白加蒸馏水搅拌均匀， 加入 一定量的大豆蛋白改性酶， 在一定的温度和 pH 值条件 下水解， 到达时间后， 90℃灭酶 10min， 冷却至室温后 加入 1mol ／ L HCl 调 pH 值 4．2 沉淀未水解蛋白， 8 000r ／
1 材料与方法
1．1 材料与试剂 大豆分离蛋白， 吉林省通榆蛋白质厂； 大豆蛋白
改性酶， 南宁庞博生物工程有限公司； 蛋白质分子 量 标 准 品 （Holo －transferrin， 77 000u； Apomyoglobin， 16 951u； Ribonuclease A ， 13 700u ； Cytochrome C ， 12 400u）， 肽分子量标准品（Gly－Tyr， 239．2u； Val－Tyr－ Val， 379．5u； Leu－enkephalin， 569．7u； Met－ekephalin， 573．7u； Angiotensin Ⅱ， 1 296u）， 美国 Sigma 公司； 乙 腈， 美国 Tedia 公司， 其他化学试剂均为国产分析纯。 1．2 仪器与设备
蛋白酶活力测定参照 SB ／ T 10317－1999， 蛋白酶活 力 测 定 法 。 蛋 白 质 含 量 测 定 参 照 GB ／ T 5009．5－2003， 食 品 中 蛋 白 质 的 测 定 法 。 水 解 度 （the Degree of Hydrolysis， DH） 的测定采用三氯乙酸 （TCA） 法。 1．3．2 酶解工艺路线
基 金 项 目 ： 科 技 部 农 业 科 技 成 果 转 化 资 金 项 目 （2009GB2C600198）； 山东省自主创新成果转化重大专项 （2009ZHZX1A1303） 收稿日期： 2010－07－15 作者简介： 徐同成 （1980—）， 男 ， 助 理 研 究 员 ， 博 士 ， 主 要 从 事 粮 油加工及其营养与安全评价研究。 通讯作者： 杜方岭 （1972—）， 男 ， 研 究 员 ， 所 长 ， 主 要 从 事 粮 油 加 工研究。 通信地址： （250100） 济南市工业北路 198 号
【关键词】 大豆分离蛋白； 大豆肽； 大豆蛋白改性酶； 抗氧化 中图分类号： TQ 936．2 文献标识码： A 文章编号： 1673-7199(2010)11-0038-05
大豆含有丰富的油脂和蛋白质， 其中蛋白质占 40％左 右 。 大 豆 蛋 白 质 含 有 全 部 人 体 的 8 种 必 需 氨 基 酸， 且比例合理， 赖氨酸含量可以与动物蛋白相媲美， 而且具有优良的乳化性、 发泡性和黏结性， 目前成为 食品加工业的重要原料。 但是， 大豆蛋白质的分子量 大， 低 pH 值时溶解度低， 高浓度时黏度大， 含有腹胀 因子、 胰蛋白酶抑制剂、 血球凝集素等抗营养因子， 消化率和生物效价远不及牛奶等动物蛋白， 因此限制
min 离心 15min， 取上清液冻干。 1．3．3 大豆肽的分子量分布
大豆肽的分子量测定参照 GB ／ T 22492－2008。 采用日本岛津高效液相色谱系统， 在一定条件下， 以蛋白质分子量标准品和肽分子量标准品的色谱图为 标准， 得到相对分子质量校正曲线及其方程， 将大豆 肽样品溶液在同等条件下色谱分析后 ， 用 GPC 软件进 行数据处理， 用峰面积归一法计算得到不同肽段相对 分子质量分布。 1．3．4 大豆肽的抗氧化能力 大豆肽对超氧阴离子 （O2·－） 的清除能力测定采用 邻 苯 三 酚 自 养 化 法 ， 大 豆 肽 对 羟 自 由 基 （·OH） 的 清 除能力测定采用邻二氮菲－Fe2＋氧化法。 2 结果与分析 2．1 大豆蛋白改性酶水解大豆分离蛋白的单因素试验 2．1．1 底物浓度对水解的影响 水解条件： 酶和底物比 8 000U ／ g， 温度 50℃， pH 值 7．5， 水 解 时 间 4h。 以 水 解 度 为 指 标 研 究 10、 20、 30、 40、 50g ／ L 的底物浓度对水解的影响， 结 果如图 1 所示。 大豆蛋白改性酶水解大豆分离蛋白在水溶液中进 行， 大豆分离蛋白不易溶解于水而是分散在水中形成 悬浊液， 随着蛋白浓度的增加溶液的黏度增加， 分散 性变差。 由图 1 可知： 底物浓度对水解度的影响很大， 水解度随着底物浓度的增加而显著下降。 实际生产中 不仅要考虑水解度， 还要考虑生产效率， 选择合适的 蛋白浓度。 2．1．2 酶与底物比对水解的影响 水 解 条 件 ： 底 物 浓 度 20g ／ L， 温 度 50℃ ， pH 值 7．5， 水解时间 4h。 以水解度为指标研究 4 000、 6 000、
水解条件： 底物浓度 20g ／ L， 酶和底物比 8 000U ／ g， 温度 50℃， pH 值 7．5。 以水解度为指 标 研 究 2、 3、 4、 5、 6h 的水解时间对水解的影响， 结果如图 3 所示。
图 4 pH 值对水解度的影响 所示。
由 图 4 可 知 ： 在 pH 值 小 于 7．5 时 ， 水 解 度 随 pH 值的升高显著提高； 在 pH 值大于 7．5 时， 水解度随 pH 值 增 加 逐 渐 降 低 ； 在 pH 值 为 7．5 时 ， 水 解 度 达 到 最 大。 这是因为大豆分离蛋白的等电点为酸性， 在中性 偏酸性条件下， 溶解度会进一步降低， 水解度受到酶 催化活性和底物溶解性的双重影响而变化较大； 在偏 碱性条件下， 水解度只受到酶催化活性的影响。 因此， 本试验条件下， 大豆蛋白改性酶水解大豆分离蛋白的 最适 pH 值为 7．5。 2．1．5 水解温度对水解的影响
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大豆蛋白改性酶解制备大豆肽的研究
邹险峰 陈 星 李晓磊 李 丹 高长城 （长春大学农产品深加工重点实验室）
【摘要】 利用大豆蛋白改性酶水解大豆分离蛋白制备大豆肽， 以单因素试验和正交试验确定 酶解最佳条件， 通过高效液相法分析大豆肽的分子量分布， 并检测了大豆肽的体外抗氧化效果。 结 果 显 示 ： 在 20g ／ L 的 底 物 浓 度 下 的 最 佳 条 件 为 酶 和 底 物 比 8 000U ／ g、 温 度 55℃、 pH 值 7．5、 水解时间 5h， 水解度为 51．4％。 大豆肽主要为 130～1 000u 的短肽， 占肽总量的 86．3％。 大豆肽对 超氧阴离子 （O2·－） 和羟自由基 （·OH） 的 半 最 大 清 除 浓 度 分 别 为 1．3mg ／ mL 和 8．0mg ／ mL。 表 明大豆蛋白改性酶对大豆分离蛋白的水解能力较强， 大豆肽有较强的抗氧化功能。
图 1 底物浓度对水解度的影响
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8 000、 10 000、 12 000U ／ g 的 酶 与 底 物 比 对 水 解 的 影 响， 结果如图 2 所示。
图 2 酶与底物比对水解度的影响
在工业酶解生产大豆肽中， 酶浓度是影响成本的 重要因素。 本试验采用大豆蛋白改性酶固态直接掺入 水相反应体系， 操作简便。 由图 2 可知： 在底物浓度 一定时， 随着酶浓度的增加， 水解度呈上升趋势， 但 是当酶与底物比达到 8 000U ／ g 时， 水解度基本达到峰 值， 继续增加酶与底物比水解度增加有限。 从经济上 考虑， 酶与底物比对为 8 000U ／ g 较为合适。 2．1．3 水解时间对水解的影响
了大豆蛋白质的利用。 近年来， 通过酶法水解大豆蛋 白得到大豆肽已经得到了科学界的重视。 大豆肽分子 量小、 溶解度高、 黏度低、 在体内消化吸收快、 抗原 性低， 而且具有抗疲劳、 抗氧化、 降血压、 降低胆固 醇、 提高免疫力、 抗肿瘤以及控制肥胖等多种生理功 能， 使其应用范围大大扩大， 提高了大豆产品的附加 值。
水解条件： 底物浓 度 20g ／ L， 酶 和 底 物 比 8 000U ／ g， pH 值 7．5， 水解时间 5h。 以水解度为指标研究 40、 45、 50、 55、 60℃的水解温度对水解的影响， 结果如图 5 所示。
图 3 水解时间对水解度的影响
由图 3 可知： 随着酶解时间的增加， 蛋白水解度 逐渐增大， 在 5h 左右达到最大， 继续延长反应时间水 解度不再增加。 这是因为蛋白酶对热敏感， 随时间延 长会逐渐失活。 因此， 本试验条件下， 大豆蛋白改性 酶水解大豆分离蛋白的最适反应时间为 5h。 2．1．4 pH 值对水解的影响
FDU －2100 型 冷 冻 干 燥 仪 ， 日 本 EYELA 公 司 ； pHS－2 型精密酸度计， 上海雷 磁仪器厂； J－26XP 型高 速冷冻离心机， 美国 BECKMAN COULTER 公司； LC－ 20A 型 高 效 液 相 色 谱 仪 、 2201 型 紫 外－可 见 分 光 光 度 仪， 日本岛津公司。 1．3 方法 1．3．1 指标测定
The oily press； 1993． ［17］ Brockerhoff H． A stereospecific analysis of triglycerides ［J］ ． J
Lipid Res， 1965 （6）： 10～15． ［18］ 林 晓 珊 ， 黄 晓 兰 ， 吴 惠 勤 ， 等． 蚕 蛹 油 中 脂 肪 酸 组 成 及 其 酯 型
大豆分离蛋白是将豆粕去除大豆油和水溶性非蛋
酸组成的分析 ［J］ ． 乳业科学与技术， 2009 （135）： 71～73． ［12］ Williams JP， Khan MU， Wong D． A simple technique for the
analysis of positional distribution of fatty acids on di－ and triacylglycerols using lipase and phospholipase A2 ［ J］ ． J Lipid Res， 1995， 36 （6）： 1407～1412． ［13］ 赵雷， 刘国琴， 李琳， 等． 声波加速脂肪酸价值花的研究 ［J］ ． 中国油脂， 2008， 33 （1）： 33～36． ［14］ 范亚苇 ， 邓 泽 元 ， 余 永 红 ， 等． 不 同 脂 肪 酸 甲 酯 化 方 法 对 共 轭 亚油酸分析的影响 ［J］ ． 中国油脂， 2007， 32 （1）： 52～55． ［15］ Park Y， Albright KJ， Cai ZY， et al． Comparison of methylation procedures for conjugated linoleic acid and artifact formation by commercial （trimethylsilyl） diazomethane ［J］ ． J Agric Food Chem， 2001， 49 （3）： 1158～1164． ［ 16］ Christie WW． Advances in lipid methodology －two． Dundee：
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白组分后得到的一种蛋白质含量不少于 90％的混合物， 其组成、 结构和性质与大豆蛋白相似， 基本可以代表 纯的大豆蛋白。 目前， 用于大豆蛋白水解的酶类主要 包括： 碱性蛋白酶、 中性蛋白酶、 木瓜蛋白酶、 胃蛋 白酶、 胰蛋白酶， 或者采用双酶复合水解。 大豆蛋白 改性酶是目前工业生产大豆蛋白粉的生物复合酶， 用 于提高大豆蛋白粉的溶解性和分散性， 将大豆蛋白改 性酶用于生产大豆肽还未见报道。 本研究采用大豆蛋 白改性酶作为水解酶水解大豆分离蛋白， 研究了酶解 条件， 并对酶解产物大豆肽的清除活性氧自由基的效 果进行了分析， 为大豆肽的工业生产提供理论依据。
大豆分离蛋白→调浆→酶解→灭酶→酸沉离心分离→ 上清液冷冻干燥
准确称量大豆分离蛋白加蒸馏水搅拌均匀， 加入 一定量的大豆蛋白改性酶， 在一定的温度和 pH 值条件 下水解， 到达时间后， 90℃灭酶 10min， 冷却至室温后 加入 1mol ／ L HCl 调 pH 值 4．2 沉淀未水解蛋白， 8 000r ／
1 材料与方法
1．1 材料与试剂 大豆分离蛋白， 吉林省通榆蛋白质厂； 大豆蛋白
改性酶， 南宁庞博生物工程有限公司； 蛋白质分子 量 标 准 品 （Holo －transferrin， 77 000u； Apomyoglobin， 16 951u； Ribonuclease A ， 13 700u ； Cytochrome C ， 12 400u）， 肽分子量标准品（Gly－Tyr， 239．2u； Val－Tyr－ Val， 379．5u； Leu－enkephalin， 569．7u； Met－ekephalin， 573．7u； Angiotensin Ⅱ， 1 296u）， 美国 Sigma 公司； 乙 腈， 美国 Tedia 公司， 其他化学试剂均为国产分析纯。 1．2 仪器与设备
蛋白酶活力测定参照 SB ／ T 10317－1999， 蛋白酶活 力 测 定 法 。 蛋 白 质 含 量 测 定 参 照 GB ／ T 5009．5－2003， 食 品 中 蛋 白 质 的 测 定 法 。 水 解 度 （the Degree of Hydrolysis， DH） 的测定采用三氯乙酸 （TCA） 法。 1．3．2 酶解工艺路线