蛋白质研究的基本实验方法
蛋白质的检测方法
蛋白质的检测方法蛋白质是生命体内最基本的组成部分之一，它们在细胞的结构和功能中起着至关重要的作用。
因此，对蛋白质进行检测和分析是生物学和生物医学研究中的重要内容。
本文将介绍几种常见的蛋白质检测方法，帮助读者了解不同的技术原理和应用场景。
一、免疫印迹（Western Blot）。
免疫印迹是一种常用的蛋白质检测方法，它能够检测特定蛋白质在复杂混合物中的存在和表达水平。
该方法利用蛋白质与特异性抗体的结合来实现检测，首先将待测样品进行SDS-PAGE凝胶电泳分离，然后转移至膜上，接着用特异性抗体结合目标蛋白，最后通过化学发光或显色反应来检测蛋白质的存在和表达水平。
免疫印迹方法具有高灵敏度和特异性，适用于检测低表达水平的蛋白质。
二、酶联免疫吸附实验（ELISA）。
酶联免疫吸附实验是一种高度灵敏的蛋白质检测方法，它能够定量检测特定蛋白质的存在和表达水平。
该方法利用特异性抗体将待测蛋白质捕获在微孔板上，然后通过酶标记的二抗结合目标蛋白，最后加入底物产生显色反应进行定量检测。
ELISA方法具有高通量、高灵敏度和高特异性的优势，适用于临床诊断和药物筛选等领域。
三、质谱分析（Mass Spectrometry）。
质谱分析是一种高效的蛋白质检测方法，它能够对蛋白质的序列、修饰和相互作用进行全面的分析。
该方法通过将蛋白质分离并离子化，然后通过质谱仪进行质量-电荷比的测定，最后利用数据库比对来鉴定蛋白质的身份和修饰。
质谱分析方法具有高分辨率、高灵敏度和高通量的特点，适用于蛋白质组学和蛋白质相互作用研究。
四、蛋白质芯片技术（Protein Microarray）。
蛋白质芯片技术是一种高通量的蛋白质检测方法，它能够对大量蛋白质进行快速、高效的筛选和分析。
该方法通过将不同蛋白质固定在芯片表面，然后与待测样品中的蛋白质相互作用，最后利用荧光或化学发光信号进行检测和定量分析。
蛋白质芯片技术具有高通量、高灵敏度和高特异性的特点，适用于蛋白质互作网络和药物靶点筛选等研究领域。
深入解析蛋白质表征研究的实验步骤
深入解析蛋白质表征研究的实验步骤蛋白质是生物体内最基本的功能分子之一，对于了解生物体的结构和功能具有重要意义。
蛋白质的结构鉴定是生物药物领域中的关键研究内容之一。
本文将深入解析蛋白质表征研究的实验步骤，带您了解蛋白质结构鉴定的过程。
步骤一：蛋白质纯化蛋白质表征研究的第一步是蛋白质的纯化。
由于生物体内蛋白质的复杂性，需要通过一系列的纯化步骤将目标蛋白质从其他杂质中分离出来。
常用的纯化方法包括离心、层析、电泳等。
离心可以根据蛋白质的大小和密度进行分离，层析则可以根据蛋白质的特性选择合适的分离介质，电泳则可以根据蛋白质的电荷和大小进行分离。
图1。
步骤二：蛋白质结构预测在蛋白质表征研究中，蛋白质结构的预测是一个重要的环节。
通过计算机模拟和算法预测，可以得到蛋白质的二级结构、三级结构以及可能的折叠方式。
这些预测结果可以为后续的实验提供指导，同时也可以帮助科研人员更好地理解蛋白质的功能和相互作用。
图2。
步骤三：质谱分析质谱分析是蛋白质表征研究中常用的技术手段之一。
通过质谱仪的高精度测量，可以得到蛋白质的分子质量和组成。
质谱分析可以通过不同的方法，如质谱图谱、质谱成像等，对蛋白质进行全面的表征。
同时，质谱分析还可以用于检测蛋白质的修饰和变异，为蛋白质结构鉴定提供重要的信息。
步骤四：核磁共振（NMR）技术核磁共振技术是蛋白质表征研究中常用的结构鉴定方法之一。
通过核磁共振仪的测量，可以得到蛋白质的原子间距离、化学位移和耦合常数等信息，从而确定蛋白质的三维结构。
核磁共振技术具有高分辨率和非破坏性的特点，对于研究蛋白质的结构和动态性具有重要意义。
步骤五：X射线晶体学X射线晶体学是蛋白质表征研究中最常用的结构鉴定方法之一。
通过将蛋白质样品制备成晶体，并通过X射线的衍射测量，可以得到蛋白质的高分辨率结构。
X射线晶体学可以提供蛋白质的原子级别的结构信息，对于研究蛋白质的功能和相互作用具有重要意义。
步骤六：电子显微镜（EM）技术电子显微镜技术是蛋白质表征研究中新兴的结构鉴定方法之一。
测量蛋白质三种方法测定原理
测定蛋白质含量的三种方法原理院系：xxx专业：xxx姓名：xxx学号：xxx测量蛋白质三种方法测定原理【摘要】了解测量蛋白质三种测定方法的基本原理和优缺点。
三种方法为考马斯亮蓝法（Bradford法），Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。
【关键词】蛋白质含量测定考马斯亮蓝法 Folin－酚试剂法紫外吸收法蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一目前常用的有两种古老的经典方法，即Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。
另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford 法）。
其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍。
每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。
在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。
简单列表为：考马斯亮蓝法双缩脲法（Biuret法）和Folin—酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。
1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。
这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。
这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
它是一种蛋白定量法（一）实验原理考马斯亮蓝G-250（Coomassie G-250）是一种甲基取代的三苯基甲烷，分子中磺酸基的蓝色染料，在465nm处有最大吸收值。
考马斯亮蓝G-250能与蛋白质通过范得华相互作用形成蛋白质—考马斯亮蓝复合物蓝色溶液，引起该染料的最大吸收λmax的位置发生红移，在595nm处有最大吸收值。
由于蛋白质—考马斯亮蓝复合物在595nm处的光吸收远高于考马斯亮蓝在465nm处的光吸收，因此，可大大地提高蛋白质的测定灵敏度。
蛋白质—考马斯亮蓝复合物溶液颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。
蛋白质的性质实验报告
蛋白质的性质实验报告引言：蛋白质是生命体内的基本组成部分之一，也是生物体内起重要功能的分子。
为了深入了解蛋白质的性质，本次实验旨在通过多种实验方法和技术，研究蛋白质的结构、溶解性、酶解性、电泳性质以及光学性质等方面，揭示蛋白质的特点和变化规律。
实验一：溶解性实验材料与方法：1. 采用鸡蛋白、牛乳蛋白和豆腐蛋白作为实验物质。
2. 将这几种物质分别加入不同的试管中，加入相同体积的蒸馏水，并在水浴中加热搅拌。
3. 每隔10秒观察一次试管内物质的溶解情况，记录时间。
结果与分析：经过实验发现，鸡蛋白和牛乳蛋白在加热搅拌过程中逐渐溶解，反应速度较快；而豆腐蛋白则需要更长时间才能完全溶解。
这是因为不同蛋白质具有不同的溶解性，与其分子结构的差异密切相关。
鸡蛋白和牛乳蛋白中的水解蛋白在热力作用下发生构象变化，使其更易溶于水。
而豆腐蛋白含有较多的结合蛋白，抗热性较强，所以需要更长时间才能溶解。
实验二：酶解性实验材料与方法：1. 采用胰蛋白酶作为酶解物质。
2. 将鸡蛋白、牛乳蛋白和豆腐蛋白分别加入试管中。
3. 随后加入胰蛋白酶，保持适宜的温度和酸碱度。
4. 观察酶解反应的进行并记录时间。
结果与分析：通过酶解实验显示，胰蛋白酶能高效地将鸡蛋白、牛乳蛋白和豆腐蛋白分解为较小的片段。
这说明蛋白质在酶解的作用下能够发生化学反应，由长链结构转变为短链或小分子物质。
这也印证了蛋白质的特性之一——可变性。
所以，蛋白质的特性和功能不仅受其自身分子结构的影响，还受到外界环境和酶的影响。
实验三：电泳性质实验材料与方法：1. 先将鸡蛋白、牛乳蛋白和豆腐蛋白分别加入几个小孔的凝胶上。
2. 运用直流电电源进行电泳实验。
3. 观察凝胶上蛋白质的迁移情况，并记录时间。
结果与分析：通过电泳实验发现，不同蛋白质在电场的作用下迁移的速度不同。
豆腐蛋白迁移速度较快，鸡蛋白次之，牛乳蛋白最慢。
这是因为电泳性质与蛋白质的分子量和电荷有关。
在电场中，带正电荷的蛋白质离子会向负极迁移，而带负电荷的蛋白质离子则向阳极迁移。
蛋白质结构与功能的研究方法
蛋白质结构与功能的研究方法蛋白质是细胞中最重要的大分子之一，其功能多种多样，包括催化反应、传递信号、维护结构、储存物质等作用。
而蛋白质的功能和结构密切相关，因此研究蛋白质的结构是深入研究其功能的必要步骤。
本文将探讨蛋白质结构研究的方法，包括光谱学、X 射线衍射、核磁共振等。
1.光谱学光谱学是通过测量蛋白质吸收光的波长和强度等性质来研究其结构的一种方法。
光谱学可以提供有关蛋白质的二级结构、三级结构、热力学稳定性等信息。
典型的光谱学方法有紫外线吸收光谱、荧光光谱、圆二色光谱。
紫外线吸收光谱是指用紫外线光在特定波长下照射样品，测量样品吸收光的波长和强度，从而推断出蛋白质的含量、二级结构和折叠状态等信息。
荧光光谱则是利用蛋白质分子具有激发和荧光的性质，研究蛋白质的结构和功能。
圆二色光谱是用于测定蛋白质手性的一种光谱学方法，根据样品对圆极化光的旋转方向和强度的变化，可推断出蛋白质的二级结构等信息。
2.X射线衍射X射线衍射是一种非常重要的蛋白质结构研究方法，可提供高分辨率的三维结构信息。
在X射线衍射中，一束强度足够大的X 射线照射在蛋白质晶体上，形成衍射图案。
通过对衍射图案进行记录和分析，可以反推出蛋白质分子空间结构的精确位置、角度和距离等信息。
值得注意的是，蛋白质X射线衍射需要通过蛋白质晶体实验进行。
由于晶体的制备、稳定性和晶体质量等因素的限制，蛋白质晶体实验具有一定的技术难度和挑战性。
3.核磁共振核磁共振（NMR）是另一种非常重要的蛋白质结构研究方法，可提供高分辨率的结构信息。
与X射线衍射不同，NMR方法不需要利用蛋白质晶体，而是将蛋白质分子在溶液中进行NMR实验。
与X射线衍射类似，NMR方法利用蛋白质分子中的原子核的共振现象来研究蛋白质结构。
在NMR实验中，蛋白质在强磁场中进行共振，其产生的NMR信号将被记录和分析，从而推导出蛋白质分子的结构信息。
由于NMR实验不需要蛋白质晶体，因此适用于非晶态蛋白质结构的研究。
生化实验 实验一：蛋白质含量测定方法的研究
实验一：蛋白质含量测定方法的研究一、研究背景：目前常用的蛋白质含量的定方法有四种：凯氏定氮，Folin-酚法，考马斯亮蓝法，紫外法。
几种方法各有各自的优势和精确度，根据不同的材料应选择不同的检测方法。
二、研究目标：通过对不同测定蛋白质含量方法的比较，找出实际实验操作中针对不同底物的最佳选择。
三、研究策略：对同样的蛋白质样品，用紫外法，Folin-酚法，考马斯亮蓝法四种方法进行测定，再向蛋白质样品中分别加入酪氨酸，EDTA ，嘌呤，再用三种方法进行测量，再将测量结果进行比较。
四、研究方案及可行性分析：经过上周的讨论以及老师的分析，我们必须绕过“标准浓度”这个判定方法，因此用增大杂质的影响的方法进行比较。
在生物样品中分别加入不同杂质，再进行测量，受某种杂质影响较大的实验方法测量出的结果必然会与另两个的结果有较大的偏差，因此可以比较出在不同非蛋白质杂质对不同测量方法的影响，因此可以作为日常实验中的选择依据。
五、具体实验设计1.试剂与仪器（1）试剂：标准牛血清蛋白溶液，1mg/ml；考马斯亮蓝G-250；乙醇；磷酸（85%）；试剂甲：10g碳酸钠，2g氢氧化钠，0.5g酒石酸钾钠溶解后用蒸馏水定容至500ml；0.5g五水硫酸铜溶解后，用蒸馏水定容至100ml；试剂乙：1NFolin--酚试剂(乙)；蛋白质样品：绿豆芽下胚轴；EDTA0.05g，饱和酪氨酸溶液1ml；嘌呤溶液1ml（2）仪器紫外分光光度计；移液管0.5*1,1ml*2,5ml*1；试管和试管架；722型分光光度计；恒温水浴；具塞刻度试管：15ml*8；小烧杯2个，漏斗及架；分析天平，容量瓶，研钵；离心机，药物天平；量筒10ml*1,刻度吸管：1ml*2,0.1ml*2，剪刀2.具体操作步骤与原始数据记录（1）紫外法测定蛋白质含量：按下表配制溶液→1cm石英比色杯测光密度值→绘制标准曲线→1g绿豆芽下胚轴研磨→50ml容量瓶定容，过滤，取滤液为样品A1→重复上步3次，在滤液中分别加入EDTA,酪氨酸溶液，嘌呤溶液，标记为乙试剂→半小时后650nm下比色→绘制标准曲线→按步骤(1)制取相同绿豆芽下胚轴滤→595nm下比色→绘制标准曲线→按步骤（1）制取样品，标号A3，B3，C3，六、质疑及相关思考对于测定蛋白质含量的实验，是否需要做几组平行实验？如果全部都做平行实验，则实验量过大，是测量程序变得复杂，参考书上的资料，也不是全部都有平行组。
蛋白质定量法实验报告
一、实验目的1. 掌握蛋白质定量方法的基本原理和操作步骤。
2. 学会使用BCA法和Folin-酚试剂法进行蛋白质定量。
3. 了解蛋白质定量在生物研究中的应用。
二、实验原理蛋白质定量是生物研究中的一个重要环节，它可以帮助我们了解蛋白质在生物体内的含量、分布和功能。
常用的蛋白质定量方法有BCA法、Folin-酚试剂法、双缩脲法等。
本实验主要介绍BCA法和Folin-酚试剂法的原理和操作步骤。
1. BCA法BCA法（Bicinchoninic Acid法）是一种基于双缩脲反应的蛋白质定量方法。
在碱性条件下，蛋白质与Cu2+络合，将Cu2+还原成Cu+，然后BCA与Cu+螯合，产生蓝紫色，其吸光度与蛋白质浓度呈线性关系。
2. Folin-酚试剂法Folin-酚试剂法是一种基于酚试剂与蛋白质中的肽键发生反应的蛋白质定量方法。
蛋白质中的肽键与酚试剂反应生成蓝绿色化合物，其吸光度与蛋白质浓度呈线性关系。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）样品：待测蛋白质样品；（2）试剂：BCA试剂、Folin-酚试剂、双缩脲试剂、牛血清白蛋白标准品、蒸馏水等；（3）仪器：酶标仪、恒温水浴锅、移液器、试管等。
2. 实验仪器：（1）酶标仪：用于测定吸光度；（2）恒温水浴锅：用于加热反应；（3）移液器：用于准确移取试剂；（4）试管：用于混合试剂和样品。
四、实验步骤1. BCA法（1）配制BCA工作液：取BCA试剂A 50μl，加入BCA试剂B 1μl，充分混匀；（2）配制标准曲线：取6个试管，依次加入牛血清白蛋白标准液0、20、40、60、80、100μl，然后加入BCA工作液200μl，混匀；（3）加入样品：取6个试管，依次加入待测蛋白质样品0、20、40、60、80、100μl，然后加入BCA工作液200μl，混匀；（4）加热反应：将试管放入恒温水浴锅中，37℃反应30min；（5）测定吸光度：用酶标仪在562nm波长下测定各试管吸光度；（6）绘制标准曲线：以蛋白含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
研究蛋白质与蛋白质相互作用方法总结实验步骤
研究蛋白质与蛋白质相互作用方法总结实验步骤蛋白质与蛋白质相互作用是生物学领域中的一个重要研究方向，可以揭示生命活动的基本机理以及药物设计和治疗疾病的潜在靶点。
本文将总结蛋白质与蛋白质相互作用的研究方法以及实验步骤。
一、蛋白质与蛋白质相互作用研究方法总结：1.蛋白质-蛋白质亲和层析法：该方法通过利用蛋白质与目标蛋白质之间的亲和力，将目标蛋白质与其他非特异结合的蛋白质分离，可用于筛选靶向蛋白质的抑制剂或开发特定结合位点。
2.酵母双杂交方法：该方法是通过融合目标蛋白质与一组已知蛋白质相互作用的底物，通过检测底物报告基因（比如启动子）的表达来确定两个蛋白质相互作用的情况。
3.免疫共沉淀法：该方法通过利用抗体的特异性，将目标蛋白质和与其相互作用的蛋白质一同从细胞裂解液中沉淀下来，以证明它们之间存在相互作用关系。
4.光学双光子显微镜或荧光共振能量转移法：这些方法可以利用荧光染料标记的蛋白质，通过观察它们之间的相互作用情况来研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用。
5.表面等离子体共振（SPR）：该方法通过在金属表面固定一个蛋白质，然后观察黄金膜表面等离子体共振信号的变化来研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用过程。
6.核磁共振（NMR）：该方法利用蛋白质中的^1H、^13C和^15N原子的自旋，通过一系列的波形解析来确定蛋白质与蛋白质之间的相互作用，可以提供高分辨率的结构和动力学信息。
7.体外重组蛋白质表达和结合实验：利用大肠杆菌或霞赤红热单核细胞感染表达载体后表达目标蛋白质，以及通过重组技术制备的其他蛋白质，通过混合这些重组蛋白质来研究它们之间的相互作用。
二、蛋白质与蛋白质相互作用实验步骤：1.实验前准备：根据研究目的选择适当的实验方法和方法，准备相应的试剂和材料。
2.原料处理：获得目标蛋白质样品后，进行必要的纯化或浓缩处理，以去除其他污染物，并保持蛋白质的活性。
3.实验设计：根据研究目的设计实验方案，比如确定实验条件、控制实验和重复实验。
蛋白质测定实验报告
一、实验目的1. 理解蛋白质测定的原理和方法。
2. 掌握双缩脲试剂法测定蛋白质含量的基本操作步骤。
3. 学会使用分光光度计进行蛋白质定量分析。
二、实验原理蛋白质是由氨基酸通过肽键连接而成的大分子有机化合物，具有重要的生物学功能。
蛋白质含量是生物样品中的重要指标之一。
本实验采用双缩脲试剂法测定蛋白质含量，该法基于蛋白质分子中的肽键在碱性条件下与铜离子发生反应，生成紫红色络合物，其吸光度与蛋白质含量成正比。
三、实验材料与试剂1. 实验材料：鸡蛋清、牛血清白蛋白、牛血清、双缩脲试剂A、双缩脲试剂B、蒸馏水、分光光度计等。
2. 试剂：（1）双缩脲试剂A：称取硫酸铜0.1g，溶于50mL蒸馏水中；（2）双缩脲试剂B：称取酒石酸钾钠0.5g、碘化钾0.1g，溶于50mL蒸馏水中；（3）蛋白质标准溶液：配制浓度为0.1mg/mL的蛋白质标准溶液。
四、实验步骤1. 标准曲线绘制（1）取6支10mL具塞试管，分别加入0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL蛋白质标准溶液；（2）向各试管中加入1.5mL双缩脲试剂A；（3）混匀，室温放置10分钟；（4）加入5mL双缩脲试剂B；（5）混匀，室温放置10分钟；（6）以蒸馏水为空白，用分光光度计在540nm波长处测定吸光度；（7）以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 样品测定（1）取6支10mL具塞试管，分别加入0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL待测样品；（2）同标准曲线绘制步骤，测定吸光度；（3）根据标准曲线，计算样品蛋白质含量。
五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到线性方程为：y = 0.0019x + 0.0032，相关系数R² = 0.9986。
2. 样品测定根据标准曲线，计算各样品蛋白质含量如下：（1）鸡蛋清：0.5mg/mL；（2）牛血清：0.4mg/mL。
蛋白质测定常用的几种方法
I. 紫外分光光度法测定蛋白质的含量一、实验目的掌握紫外分光光度法测定蛋白质的含量的方法。
二、实验原理蛋白质分子中存在含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，使蛋白质对280nm的光波具有最大吸收值，在一定的范围内，蛋白质溶液的吸光值与其浓度成正比，可作定量测定。
该法操作简单、快捷，并且测定的样品可以回收，低浓度盐类不干扰测定，故在蛋白质和酶的生化制备中广泛被采用。
但此方法存在以下缺点：1．当待测的蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基含量差别较大是会产生一定的误差，故该法适用于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的样品。
2．若样品中含有其他在280nm吸收的物质如核酸等化合物，就会出现较大的干扰。
但核酸的吸收高峰在260nm，因此分别测定280nm和260nm两处的光吸收值，通过计算可以适当的消除核酸对于测定蛋白质浓度的干扰作用。
但因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不同的，虽经校正，测定结果还存在着一定的误差。
三、实验器材1．紫外分光光度计2．移液管3．试管及试管架4．石英比色皿四、材料与试剂1．标准蛋白质溶液：准确称取经凯氏定氮校正的牛血清清蛋白，配制成浓度为1mg/mL的溶液。
2．待测蛋白溶液：酪蛋白稀释溶液，使其浓度在标准曲线范围内。
五、操作方法1．标准曲线的制作按表1加入试剂。
表1 标准曲线的制作度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制出血清蛋白的标准曲线。
2．未知样品的测定取待测蛋白质溶液1mL，加入3mL蒸馏水，在280nm下测定其吸光度值。
并从标准曲线上查出待测蛋白质的浓度。
II. Bradford法测定蛋白质的含量一、实验目的学习考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质的原理和方法。
二、实验原理1976年Bradford建立了用考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合的原理，迅速而准确的定量蛋白质的方法。
染料与蛋白质结合后引起染料最大吸收光的改变，从465nm变为595nm。
蛋白质-染料复合物具有高的消光系数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度（最低检出量为1μg）。
5种蛋白质分析方法
蛋白质分析方法1、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。
含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。
经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。
若以甘氨酸为例，其反应式如下：NH2CH2COOH+3H2SO4——2CO2+3SO2+4H2O+NH3 (1)2NH3+H2SO4——(NH4)2SO4 (2)(NH4)2SO4+2NaOH——2H2O+Na2SO4+2NH3 (3)反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。
为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。
收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。
实验和计算方法这里从略。
计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。
如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。
评价：总氮-非蛋白氮=蛋白质氮——>蛋白质含量灵敏度低，误差大，耗时长。
2、双缩脲法（Biuret法）（一）实验原理双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。
在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。
凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。
测定范围为1-10mg蛋白质。
干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris 缓冲液和某些氨基酸等。
此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。
主要的缺点是灵敏度差。
因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。
（二）试剂与器材1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml 的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。
生命科学中的蛋白质分析与研究方法
生命科学中的蛋白质分析与研究方法蛋白质是生命中不可或缺的大分子。
它们担任着许多生命过程的重要角色，如催化、转运、结构支撑和信号传递等。
因此，研究蛋白质的结构和功能对于理解细胞运作和疾病机制至关重要。
在生命科学中，有关蛋白质的研究主要涉及两个方面：蛋白质的结构与蛋白质的功能。
蛋白质结构研究方法蛋白质的结构研究是指研究蛋白质的三维空间结构。
蛋白质的结构研究可以采用多种方法，包括X射线衍射、核磁共振（NMR）和电子显微镜（EM）等。
X射线衍射是一种能够确定蛋白质原子位置的传统方法。
该方法通过测量X射线的衍射图案来研究蛋白质的结构。
这种方法最早应用于结晶态蛋白质的研究，后又发展出了衍射在溶液中的蛋白质研究方法。
然而，该方法存在多种限制，如蛋白质晶体生长的困难和蛋白质分子不稳定的问题。
此外，X射线衍射方法还无法研究大分子的低分辨率结构，因为X射线光的波长较大，不适合用于描述大分子内部的详细结构。
与X射线衍射方法相比，NMR和EM方法具有更强的应对大分子的能力。
NMR是一种可以在溶液状态下研究生物大分子结构的方法。
NMR利用原子核在磁场中的行为和相互作用来探测样品中的排列和运动，从而揭示大分子的结构。
此外，NMR方法还可以研究大分子本身的动态变化，如蛋白质折叠中的动态过渡。
EM方法则是另一种研究大分子结构的方法。
该方法是利用电子束替换光束，以获得高分辨率下的大分子结构图像。
EM方法可以通过单颗粒分析或冷冻电镜技术来研究大分子的静态或动态结构，如高分子复合物和细胞器等。
蛋白质功能研究方法蛋白质的功能研究主要包括了在体内和体外试验等多种方法。
其中，蛋白质的自发和促进折叠在细胞内的功能非常重要。
蛋白质折叠是指蛋白质从无组织状态到其稳定的功效性的高度组织状态的过渡。
蛋白质折叠发生在细胞的特定区域内，并由多种协同作用完成。
鉴定蛋白质折叠特异性的方法包括，热失活实验、流式细胞术实验等。
其中热失活实验是将蛋白质在不同温度甚至极端温度下进行了测试。
蛋白质的检验方法
蛋白质的检验方法蛋白质是生命体内最基本的组成部分之一，它在细胞内扮演着重要的角色，参与了生命体内的许多生化过程。
因此，蛋白质的检验方法对于科研工作者和临床医生来说都是至关重要的。
本文将介绍几种常见的蛋白质检验方法，希望能够为相关领域的研究者和医生提供一些帮助。
一、免疫沉淀法。
免疫沉淀法是一种常用的蛋白质检验方法，它利用抗体与特定蛋白质结合的原理，通过沉淀的方式将目标蛋白质分离出来。
这种方法的优点是可以选择性地富集目标蛋白质，适用于复杂样品的检验。
但是，免疫沉淀法也存在一些局限性，比如需要较长的操作时间和较高的成本投入。
二、凝胶电泳法。
凝胶电泳法是一种常见的蛋白质检验方法，它利用蛋白质在电场中的迁移速度差异来分离不同的蛋白质成分。
这种方法的优点是可以直观地观察蛋白质的分布情况，对于分子量较大的蛋白质有较好的分辨率。
但是，凝胶电泳法也存在一些局限性，比如需要较长的电泳时间和较高的电泳电压。
三、质谱法。
质谱法是一种高效的蛋白质检验方法，它利用质谱仪对蛋白质进行分析，可以准确地测定蛋白质的分子量和氨基酸序列。
这种方法的优点是具有很高的灵敏度和分辨率，可以对微量的蛋白质进行检测。
但是，质谱法也存在一些局限性，比如设备昂贵、操作复杂等。
四、酶联免疫吸附试验（ELISA）。
酶联免疫吸附试验是一种常用的蛋白质检验方法，它利用酶标记的抗体与蛋白质结合后，通过酶的底物反应来检测蛋白质的含量。
这种方法的优点是操作简便、结果可靠，适用于大批量样品的检测。
但是，ELISA也存在一些局限性，比如对样品的纯度要求较高、无法直接测定蛋白质的活性等。
综上所述，蛋白质的检验方法多种多样，各有优缺点。
在实际应用中，需要根据具体的实验目的和样品特点选择合适的检验方法，以保证实验的准确性和可靠性。
希望本文介绍的内容能对相关领域的研究者和医生有所帮助。
蛋白质的鉴定实验报告
一、实验目的1. 了解蛋白质的基本性质和组成。
2. 掌握蛋白质的鉴定方法，包括颜色反应、电泳法等。
3. 通过实验，验证蛋白质的鉴定结果。
二、实验原理蛋白质是生物体内最重要的生物大分子之一，具有多种生物学功能。
蛋白质的鉴定主要通过以下方法：1. 颜色反应：利用蛋白质与特定试剂发生颜色反应，从而鉴定蛋白质的存在。
2. 电泳法：利用蛋白质在电场中的迁移速度差异，将其分离并鉴定。
三、实验材料1. 蛋白质样品：鸡蛋清、牛奶、大豆蛋白等。
2. 试剂：硫酸铵、氯化钠、考马斯亮蓝、双缩脲试剂、凝胶板、电泳仪等。
3. 仪器：天平、烧杯、滴管、移液器、离心机、凝胶板制备器、电泳仪等。
四、实验步骤1. 蛋白质样品的处理（1）取一定量的蛋白质样品，加入适量的蒸馏水，搅拌均匀，制成蛋白质溶液。
（2）用硫酸铵或氯化钠对蛋白质溶液进行盐析，使蛋白质沉淀。
（3）将沉淀物用离心机离心，收集蛋白质沉淀。
2. 颜色反应鉴定（1）取一定量的蛋白质沉淀，加入适量的双缩脲试剂，观察颜色变化。
（2）取一定量的蛋白质沉淀，加入适量的考马斯亮蓝试剂，观察颜色变化。
3. 电泳法鉴定（1）制备凝胶板：将制备好的凝胶板放入电泳仪中，连接电源。
（2）取一定量的蛋白质样品，加入适量的考马斯亮蓝试剂，制成蛋白质溶液。
（3）将蛋白质溶液加到凝胶板的孔中，启动电泳仪，观察蛋白质在电场中的迁移情况。
五、实验结果与分析1. 颜色反应鉴定（1）双缩脲试剂：蛋白质沉淀加入双缩脲试剂后，溶液呈现紫色，说明蛋白质存在。
（2）考马斯亮蓝试剂：蛋白质沉淀加入考马斯亮蓝试剂后，溶液呈现蓝色，说明蛋白质存在。
2. 电泳法鉴定（1）观察蛋白质在电场中的迁移情况，根据迁移速度和位置判断蛋白质的种类。
（2）通过比较不同蛋白质样品的电泳图谱，可以鉴定蛋白质的种类。
六、实验结论通过本实验，我们掌握了蛋白质的鉴定方法，包括颜色反应和电泳法。
实验结果表明，蛋白质在特定试剂的作用下会发生颜色变化，而在电场中迁移速度不同，从而实现蛋白质的鉴定。
蛋白质含量测定方法大全
实验一蛋白质含量测定本实验的目的是学会各种蛋白质含量的测定方法。
了解各种测定方法的基本原理和优缺点。
蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。
目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。
另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。
其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。
定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。
值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。
每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。
在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。
考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。
一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。
含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。
经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。
若以甘氨酸为例，其反应式如下：CH2COOH|+3H2SO4→2CO2+3SO2+4H2O+NH3(1)NH22NH3+H2SO4→(NH4)2SO4(2)(NH4)2SO4+2NaOH→2H2O+Na2SO4+2NH3(3)反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。
为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。
收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。
实验和计算方法这里从略。
计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。
蛋白质组学研究方法与实验方案
蛋白质组学研究方法与实验方案随着科学技术的不断发展，蛋白质组学已经成为了生物医学领域中的一个重要研究方向。
蛋白质组学是指通过对细胞或组织中的蛋白质进行分析，来探究这些蛋白质在生物体内的作用和功能。
本文将从理论和实验两个方面，详细介绍蛋白质组学的研究方法与实验方案。
一、蛋白质组学的理论基础1.1 蛋白质的结构与功能蛋白质是由氨基酸组成的大分子化合物，其结构和功能密切相关。
蛋白质的结构决定了其功能的实现，而蛋白质的功能又反过来影响其结构。
因此，对蛋白质的结构和功能进行深入研究，有助于我们更好地理解蛋白质组学的本质。
1.2 蛋白质的分离与鉴定蛋白质的分离是蛋白质组学研究的基础。
目前常用的蛋白质分离方法有凝胶过滤、亲和层析、电泳等。
这些方法可以帮助我们将复杂的混合物中的蛋白质分离出来，并对其进行初步鉴定。
1.3 蛋白质的定量与分析蛋白质的定量与分析是蛋白质组学研究的核心环节。
目前常用的蛋白质定量方法有比色法、荧光法、电化学法等。
这些方法可以帮助我们准确地测定样品中蛋白质的数量，并对其进行进一步的分析。
二、蛋白质组学的实验方案2.1 实验材料与设备在进行蛋白质组学实验时，需要准备一系列的实验材料和设备，包括：(1)细胞样本：如人类血液、尿液、组织切片等。
(2)试剂：如酶、抗体、色谱柱等。
(3)仪器设备：如高效液相色谱仪(HPLC)、质谱仪(MS)、核磁共振仪(NMR)等。
2.2 实验步骤与流程蛋白质组学实验通常包括以下几个步骤：(1)样品处理：将细胞样本进行固定、脱水、去盐等处理。
(2)蛋白质提取：利用各种试剂从样品中提取出目标蛋白质。
(3)蛋白质纯化：通过柱层析、电泳等方法将目标蛋白质纯化至一定程度。
(4)蛋白质鉴定：利用各种技术手段对目标蛋白质进行鉴定，如比色法、荧光法、电化学法等。
(5)数据分析：利用统计学方法对收集到的数据进行分析，得出结论。
2.3 结果解读与讨论在完成实验后，我们需要对实验结果进行解读与讨论。
蛋白质化学研究方法和思路
蛋白质化学研究方法和思路蛋白质化学研究是生物化学领域的一个重要分支，它涉及对蛋白质的结构、功能、相互作用和生物合成的深入研究。
以下是蛋白质化学研究的一些常见方法和思路。
1. 蛋白质分离和纯化：通过各种色谱技术（如凝胶过滤、离子交换、亲和色谱等）从混合物中分离目标蛋白质。
使用电泳技术（如SDS-PAGE）对蛋白质进行分子量分析。
2. 蛋白质结构分析：通过X射线晶体学获得蛋白质的三维结构。
利用核磁共振（NMR）光谱学分析蛋白质的二维结构。
通过冷冻电子显微镜（cryo-EM）技术观察蛋白质的近原子分辨率结构。
3. 蛋白质功能研究：通过体外酶活实验研究蛋白质的催化功能。
利用细胞生物学实验（如共转染、基因敲除等）研究蛋白质在细胞中的功能。
通过蛋白质相互作用分析（如免疫沉淀、酵母双杂交等）研究蛋白质与其他分子的相互作用。
4. 蛋白质修饰研究：分析蛋白质的磷酸化、乙酰化、泛素化等修饰形式。
研究修饰对蛋白质结构和功能的影响。
5. 蛋白质表达调控：研究蛋白质的转录后调控机制，如miRNA、转录因子等对蛋白质表达的影响。
分析蛋白质的降解途径和稳定性。
6. 蛋白质组学：利用高通量质谱技术对蛋白质进行鉴定和定量分析。
通过蛋白质组学数据挖掘，发现新的蛋白质功能和研究途径。
7. 计算生物学方法：利用生物信息学工具（如SwissProt、UniProt等）查询和分析蛋白质序列信息。
通过分子对接和分子动力学模拟研究蛋白质与配体的相互作用。
8. 系统生物学：研究蛋白质在生物网络中的角色和功能。
利用系统生物学方法分析蛋白质在复杂生物过程中的作用。
在进行蛋白质化学研究时，通常需要综合运用多种技术和方法，以获得全面的研究结果。
研究过程中，科学家们会根据研究目标和问题，选择合适的研究方法和实验设计，以揭示蛋白质在生命活动中的重要作用。
蛋白质含量的测定实验报告
蛋白质含量的测定实验报告蛋白质含量的测定实验报告引言：蛋白质是生命体内最基本的组成部分之一，对于维持生命活动具有重要作用。
因此，准确测定蛋白质含量对于生物学、医学等领域的研究具有重要意义。
本实验旨在通过一系列的实验步骤，准确测定样品中蛋白质的含量。
实验材料和方法：1. 实验材料：- 样品：选择具有高蛋白含量的食品样品，如鸡蛋、牛奶等。
- 试剂：含有蛋白质的测定试剂盒，如BCA试剂盒。
- 标准品：含有已知蛋白质含量的标准品。
2. 实验步骤：1) 样品预处理：将样品加热至一定温度，使蛋白质变性，以便更好地释放出蛋白质。
2) 标准曲线制备：取一系列已知浓度的标准品，按照试剂盒说明书的要求进行处理，制备标准曲线。
3) 样品处理：将经过预处理的样品与试剂盒中的试剂混合，按照说明书的要求进行反应。
4) 光度测定：使用分光光度计测定反应液的吸光度，并与标准曲线进行比较，计算出样品中蛋白质的含量。
结果与讨论：通过实验测定，我们得到了样品中蛋白质的含量。
根据实验数据，我们可以得出以下结论：1. 样品与标准品的比较：通过与标准品的比较，我们可以确定样品中蛋白质的相对含量。
如果样品的吸光度与标准品相近，说明样品中蛋白质含量较高；反之，如果吸光度较低，则说明样品中蛋白质含量较低。
2. 实验误差的影响：在实验过程中，存在一定的误差。
这些误差可能来自于样品的处理过程、试剂的质量以及实验操作的技巧等方面。
因此，在进行实验时，需要注意控制这些误差，以保证测定结果的准确性和可靠性。
3. 实验结果的应用：蛋白质的测定结果可以应用于许多领域。
例如，在食品工业中，可以通过测定食品样品中的蛋白质含量来评估其营养价值；在医学研究中，可以通过测定体液中的蛋白质含量来诊断疾病。
结论：通过本实验，我们成功地测定了样品中蛋白质的含量。
在实验过程中，我们掌握了一系列的实验技巧和操作步骤，并了解了蛋白质测定的原理和应用。
蛋白质的测定对于生物学和医学等领域的研究具有重要意义，通过准确测定蛋白质含量，我们可以更好地理解生命活动的机制，促进科学的发展和进步。
pr分离原理及方法
pr分离原理及方法
PR分离原理及方法是指通过分离样品中的蛋白质，实现蛋白质化学结构和功能的研究。
PR分离是蛋白质研究中基本的实验方法，也是研究蛋白质功能和结构的重要手段。
PR分离的基本原理是利用蛋白质的物理性质和化学性质，将蛋白质从混合物中分离出来。
常用的分离方法包括离心、过滤、层析、电泳等。
其中，层析是最为常用的分离方法。
层析分离是利用蛋白质在不同条件下的亲和性和分子大小差异
实现分离的一种方法。
常见的层析方法包括离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。
离子交换层析是利用蛋白质带电性质和吸附剂的离子交互作用
实现分离的方法。
凝胶过滤层析则是通过分子大小差异实现分离的方法。
亲和层析则是利用蛋白质与特定配体之间的亲和力实现分离的方法。
除了层析分离外，电泳也是常用的分离方法之一。
电泳分离是利用蛋白质在电场作用下的迁移性质，通过不同的电泳条件实现分离的方法。
常见的电泳方法包括SDS-PAGE、等电聚焦电泳等。
总之，PR分离原理及方法是蛋白质研究中的基本方法之一，通过分离蛋白质，可以实现对蛋白质结构和功能的深入研究。
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南昌大学基础医学院 生理教研室 邹惟莹
实验研究三个水平
整体水平：动物模型 细胞水平：形态、功能
分子水平：基因、蛋白质
蛋白质的调控
基因序列的变化：ErbB2 染色质水平上基因活化的调节：
染色质的结构（对核酸酶的敏感程度增加） 组蛋白的甲基化（H3-K9 基因沉默，H3-K4 基因活化） 组蛋白的乙酰化 DNA的甲基化（5%C 甲基化 m5C； 5’端CpG ）
蛋白质定量
绘制标准曲线
分别取一定体积的浓度为2mg/ml的标准BSA溶液 ，加PBS溶液至20ul配成如下浓度梯度的BSA溶液:0m g/ml、0.015625mg/ml、0.03125mg/ml、 0.0625mg/ml、0.125mg/ml、0. 25 mg/ml、0.5 mg/ml、1mg/ml、2 mg/ml。样品(样品BSA溶液或蛋 白质溶液)与PBS共25ul（0.1ml）加样，最后每孔均加 200ul（2ml）工作液（BCA：Cu 50：1 嫩绿色）混匀 ，37 "C孵育30 min, 冷却到室温后，酶标仪上562 nm 处读数。
SDS-PAGE
SDS 即十二烷基磺酸钠（CH3-(CH2)10CH2OSO3- Na）：一种阴离子表面活性剂，它 可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质 分子的二级和三级结构。 β-巯基乙醇：强还原剂，它可以断开半胱氨酸 残基之间的二硫键。
SDS-PAGE
溴酚蓝染料：用于监控整个电泳过程。 蔗糖或甘油：增大溶液密度，使加样时样品溶 液可以快速沉入样品凹槽底部。 高温处理，其目的是将SDS与蛋白质充分结合， 以使蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构 同时使整个蛋白带上负电荷。
一抗（过夜或2h）：只有待研究的蛋白质
与一抗结合，而其它蛋白质不与一抗结合，这 样清洗去除未结合的一抗后，印迹中只有待研 究的蛋白质的位置上结合着一抗。（反贴法）
Western Blot
Western Blot
二抗（1h）：带有标记的二抗与一抗结合，
可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的 位置。
转膜
转膜
电流1mA-2mA/cm2，我们通常200mA-350mA，按 照目的蛋白分子大小、胶浓度选择转移时间
Western Blot
Western Blot
封闭（2h）：用蛋白溶液（如5％的脱脂奶
粉或BSA）处理以封闭硝酸纤维素（或PVDF） 膜上剩余的疏水结合位点。（先用0.2-0.5%丽 春红预染）
最常用的一种是酶连的二抗，印迹用酶连二抗 处理后，再用适当的底物溶液处理，当酶纯化 底物生成有颜色的产物时，就会产生可见的区 带，指示所要研究的蛋白质的位置。eg：辣根 过氧化物酶；碱性磷酸酶
Western Blot
检测辣根过氧化物酶的方法
增强化学发光法（ECL；2min）
辣根过氧化物酶在H2O2 存在下，氧化化 学发光物质鲁米诺（luminol，氨基苯二酰一肼 ）并发光，在化学增强剂存在下光强度可以增 大1000 倍，通过将印迹放在照相底片上感光 就可以检测辣根过氧化物酶的存在。
Lorry法进行了改良
蛋白质定量
Bicinchoninic acid (BCA )法
近来广为应用的蛋白定量方法。 原理与Lowery法蛋白定量相似，即在碱性环境下 蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。BCA与 Cu1+ 结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562 nM处有高的光 吸收值并与蛋白质浓度成正比。 灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的颜色复合 物稳定性俱佳，并且受干扰物质影响小。 BCA法的显著优点是不受去垢剂的影响。
Bradford法
蛋白质与染料考马斯亮蓝G-250结合 最大吸收峰从465nm变为595nm 在一定的线性范围内，反应液595nm处吸光度的变化 量与反应蛋白量成正比 不能含有太高浓度的去污剂，对样品的要求较高。
蛋白质定量
Lorry法
蛋白质与碱性铜溶液中的Cu2+络和使肽键伸展， 暴露出酪氨酸和色氨酸，在碱性铜条件下与福林试剂 反应，产生蓝色，在一定浓度范围内，其颜色的深浅 与蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量成正比，由于各 种蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量各不相同，因此 在测定时需使用同种蛋白质作标准。
转膜
NC膜及滤纸的预处理：
剪裁与胶大小一致的NC膜，将其浸入1×转移 缓冲液平衡5分钟以上。（注意：必须保证NC 膜始终完全浸于转移缓冲液中）
PVDF 膜的预处理：
剪裁与胶大小一致的膜泡入甲醇中，约1-2 分 钟。将其浸入1×转移缓冲液平衡5分钟以上。
转膜
缓冲液通过凝胶时会将蛋白质带到硝酸纤维素 （或PVDF）膜上，膜可以与蛋白质通过疏水相 互作用产生不可逆的结合。 有孔的塑料和有机玻璃板将凝胶和硝酸纤维素 膜夹成"三明治"形状，而后浸入两个平行电极 中间的缓冲液中进行电泳，选择适当的电泳方 向就可以使蛋白质离开凝胶结合在硝酸纤维素 （或PVDF）膜上。
SDS-PAGE
1xSample buffer: 60mM Tris-Cl pH 6.8
2% SDS（心脏，肌肉5%） 10% glycerol 0.01% Bromophenol blue 1.5% 2-mercaptoethanol
SDS-PAGE
Sample
SDS-PAGE
pH 不连续和胶孔径大小不连续
催化剂：过硫酸铵（AP）在隔氧的状态下，最 好现配现用，使用新鲜的。 加速催化剂：TEMED，四甲基乙二胺。催化剂 的作用是使单体聚合成网状聚合物。
SDS-PAGE
SDS-PAGE
上样量：总蛋白量 20-50ug（上样量过 多使电泳条带变形）
70V，30min；110V，与待分离样品靶蛋 白分子量相适应。
电泳启动时，蛋白样品处于pH6.8 的上层（孔 径大），pH8.8 的分离胶层在下层（孔径小）， 上槽为负极，下槽为正极。
SDS-PAGE
PAGE 胶的聚合原理：甲叉双丙烯酰胺和丙烯 酰胺在过硫酸胺的作用下聚合，形成胶。
SDS-PAGE
在浓缩胶运动中，Cl¯解离度大，Pro¯解离度居中，甘 aaCOO¯解离度小，迁移顺序为（PH6.8）Cl¯> Pro¯ >—COO¯，一个Cl¯领路，—COO¯推动，蛋白在中间 ，这样就起到浓缩的作用了。 由于胶联度小，孔径大，Pro¯受阻小，因此不同的蛋 白质就浓缩到分离胶之上成层，起浓缩效应，使全部 蛋白质处于同一起跑线上。 当蛋白质进入分离胶时，此时Pro¯，Cl¯，甘aa 离子在 PH8.8 的溶液中，Cl¯完全电离而很快到达正极，甘aa 电离度加大很快跃过蛋白质，而到达正极，只有蛋白 质分子在分离胶中较为缓慢的移动。
Western Blot
蛋白免疫印迹（Immunoblotting）
凝胶电泳（SDS -聚丙烯酰胺凝胶） 样品的印迹（蛋白质转移固相支持物：硝酸 纤维素膜（NC 膜）和PVDF 膜） 免疫学检测（用特异性的抗体检测所要研究 的相应抗原）
SDS-PAGE
SDS-PAGE
原理
蛋白质中含有很多的氨基(+)和羧基(-)，不同 的蛋白在不同的pH值下表现出不同的电荷。 为了使蛋白在电泳中的迁移率只与分子量有关， 我们在上样前，通常会进行一些处理(上样缓 冲液)。即在样品中加入含有SDS 和β-巯基乙 醇的上样缓冲液。
Western Blot
必需要内参！
Western Blot
一、二抗的选择及比例 凝胶质量（气泡，脆） 电转方向，气泡，电流电压，温度 NC Tween20<0.3% 洗膜
免疫共沉淀（co-IP）
免疫沉淀(IP)
利用抗原抗体特异性结合的特性，将抗原 （靶蛋白）从混合体系沉淀下来，初步分离靶 蛋白的一种方法。
蛋白裂解液的制备
当细胞破碎的时候，蛋白水解酶就会被释放出来或被 激活。为了避免这些情况的出现，在样品制备时尽可 能在低温下进行。但是有些蛋白酶在上述条件下仍然 保持着活性，此时应当使用蛋白酶抑制剂。 Western Blot 临用前可新鲜加入最终浓度为1mM的 PMSF（苯甲基磺酰氟）。 Co-IP 蛋白酶抑制剂：胃蛋白酶抑制剂(pepstantin)、 亮抑蛋白酶肽(leupeptin)、胰蛋白酶抑制剂(aprotinin) 等；能够强烈抑制所有蛋白酶的活性（如丝氨酸蛋白 酶、巯基蛋白酶、金属蛋白酶、酸性蛋白酶）。
蛋白质定量
直接紫外吸收法
含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸 280nm附近的紫外吸收峰 测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质 嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质干扰 适合于与色谱柱联用，达到实时监控，较不准确
比色测定法
蛋白质定量
比色测定法
在典型的蛋白测定中，化学试剂加入到蛋白样品 溶液里产生颜色变化，这一变化可由分光光度计或酶 标仪检测，并与已知浓度的蛋白标准曲线作比较。
细胞样品：每份样品取1×106～1×107 细胞， PBS 清洗细胞，去PBS，加0.1ml~1ml 含蛋白 酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试 剂）抽提总蛋白（或核蛋白）。
蛋白裂解液的制备
蛋白裂解液的制备
RIPA Buffer：
裂解液和细胞应充分接触，RIPA buffer足量。
RIPA裂解液中蛋白样品含有较Fra bibliotek浓度的去垢剂，不能用 Bradford法但可用BCA法测定蛋白浓度。