96孔微量板定量检测细菌生物膜的方法步骤
β2-微球蛋白(β2M)检测试剂盒 SEA260Hu使用说明书
[需自备的设备及试剂]
1、450±10nm 滤光片的酶标仪（建议仪器使用前提前预热） 2、单道或多道微量移液器及吸头 3、稀释样品的 EP 管 4、蒸馏水或去离子水 5、吸水纸 6、盛放洗液的容器 7、0.01mol/L（或 1×）磷酸缓冲盐 (PBS)，pH=7.0-7.2
[试剂盒的储存及有效期]
2、 血浆：用 EDTA 或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的 30 分钟内于 2-8oC 1,000×g 离心 15 分钟，
取上清即可检测，或将上清置于-20oC 或-80oC 保存，避免反复冻融。 3、 尿液：请收集清晨第一次尿液（中段尿），或 24 小时尿液，2,000×g 离心 15 分钟后收集上清，并将标本保
[实验原理]
将β2M 抗体包被于 96 孔微孔板中，制成固相载体，向微孔中分别加入标准品或标本，其中β2M 与连接于固相载 体上的抗体结合，然后加入生物素化的β2M 抗体，在将未结合的生物素化抗体洗净后，加入 HRP 标记的亲和素， 再次彻底洗涤后加入 TMB 底物显色。TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（O.D.值），计算样品浓度。
[标本处理]
1、 本公司只对试剂盒本身负责，不对因使用该试剂盒所造成的样本消耗负责，请使用者使用前充分考虑到样本 的可能使用量，预留充足的样本。
2、 实验前应预测标本含量，如果标本浓度过高，应对标本进行稀释，使稀释后的标本符合试剂盒的检测范围， 计算时再乘以相应的稀释倍数。
3、 血清或血浆标本推荐稀释大约 500 倍，如：稀释 500 倍，首先取 20μL 血清或血浆样本加入 180μL PBS， 做 10 倍稀释，然后再取 10 倍稀释后的样本 10μL 加入 490μL PBS 即可，稀释的每一步都需混匀。标本使 用 0.01mol/L 的 PBS 稀释(PH=7.0-7.2）。
DL-96Ⅲ细菌测定系统操作规程
DL-96Ⅲ细菌测定系统操作规程1.目的规范DL-96Ⅲ细菌测定系统操作规程，保证检验质量。
2.原理细菌测定系统，是对已分离培养出来的细菌、真菌等微生物进行种、属鉴定，并同时测定该菌对各种抗菌药物MIC的专用设备。
细菌测定系统由检测装置、嵌入式控制装置组成，测定系统采用比色、比浊法判定随机体外诊断试剂板微量反应孔阴阳性结果进行检测和分析，并自动生成细菌种类和抗菌药物MIC半定量分析结果。
试剂板由生化反应孔和抗菌药物MIC测定孔组成。
在生化反应孔中加入细菌悬液，经35-37℃孵育，在细菌代谢作用下生化反应直接颜色变化或经加入显色剂后产生颜色变化；抗菌药物MIC采用微量肉汤稀释法，加入还有细菌的MH肉汤培养基，经35-37℃孵育，根据试验孔是否出现浑浊（沉淀）确定细菌是否生长。
测定系统采用比色法对各项生化反应进行结果判定，根据细菌生化反应的概率来完成细菌的鉴定；测定系统通过比浊法对抗生素进行MIC半定量测定分析MIC值。
3.工作环境环境温度：5-40℃相对湿度：≤80% 大气压力：76KPa-106 KPa 电源电压：AC220V±22V，50Hz±1Hz 光照度：避免阳光直射。
4.操作程序4.1 使用本试剂板的基本要求：4.1.1无特殊营养要求的革兰氏阳性菌、革兰阴性菌和真菌等病原菌4.1.2 18-24小时分离培养的单个纯菌落（或纯培养物）。
4.2 随机试剂板的选择：4.2.1 根据待测菌的培养特性、菌落特征、氧化酶实验、触酶试验结果以及革兰染色情况，选择好相应的试剂板。
4.2.2 试剂板的选择DL-96E 、DL-96NE、 DL-96STAPH、DL-96STREP、DL-96FUNGUS4.3 试剂板的接种4.3.1 DL-ZD1浊度仪的校准连接浊度仪电源，仪器运行正常，依次放入调零样品和调幅样品，调节仪器测试分别到达“0”和“100”即可使用。
4.3.2 菌悬液与药敏液的配置菌悬液制备：挑取纯培养单个菌落于稀释液瓶内壁研磨呈细菌悬液，要求如下：DL-96E 、DL-96NE、 DL-96STAPH的菌悬液都制备0.5麦氏单位；DL-96STREP菌悬液制备2麦氏单位；DL-96FUNGUS菌悬液都制备1麦氏单位；药敏液的配置：具体请见细菌测定系统随机体外诊断试剂板使用说明书4.3.3 试剂板的接种与孵育具体请见细菌测定系统随机体外诊断试剂板使用说明书。
biofilm
生物被膜（BF）的定义
微生物有组织生长的聚集体。
细菌不可逆的附着于惰性或活性实体的 表面，繁殖、分化，并分泌一些多糖基 质、将菌 体群落包裹其中而形成的细 菌聚集体膜状物。
单个生物被膜可由同种或不同种微生物 形成。
生物被膜（BF）的组成及结构
包括分泌的多糖蛋白、多糖基质、纤维蛋白、脂蛋白 等多糖蛋白复合物。 粘附细胞之间散在着一些“水通道”,即细菌群落之间 存在的充满环境液体的内隙。 成熟生物被模型从外到内包括主体生物膜层、连接层、 条件层、基质层。
三、氧浓度变化对铜绿假单胞菌生物被膜 形成的影响
研究无氧、低氧(10%氧浓度)、正常氧(20%)及高氧(30%、 40%、50%、60%)七个不同氧浓度条件下生物被膜和藻 酸盐的产生情况。 实时定量检测不同氧浓度对Lasl、RhlI、algU表达的影响 建立生物被膜生成量和Lasl、RhlI、algU表达量之间的关 系图。
研究生物被膜（BF）的意义
近年来随着医学界对某些环境中常见细菌所致的一些 慢性和顽固性疾病的深入了解 ,发现生物膜是导致这 些细菌性疾病难以根治的主要原因 。 以生物膜形式存在的细菌不同于浮游细菌 ,它们对抗 生素等杀菌剂、恶劣环境及宿主免疫防御机制有很强 的抗性,生物膜内细菌在生理、代谢、对底物的降解或 利用和对环境的抵抗能力等方面都具有独特的性质
生物被膜（BF）的体外鉴定
一、96孔微量板定量检测法
是目前各实验室广泛应用的定量检测细菌生物被膜的 公认方法。目前几乎所有的细菌都以该方法被报道。 不仅能定性细菌形成生物被膜，而且和不同的染色方 法结合还能定量计算细菌形成生物被膜的能力。
生物被膜形成曲线的测定
食源性克雷伯氏菌的分离鉴定与生物膜形成特性
食源性克雷伯氏菌的分离鉴定与生物膜形成特性汤纯; 史云娇; 卞欢; 孙芝兰; 刘芳; 朱云龙【期刊名称】《《江苏农业学报》》【年(卷),期】2019(035)005【总页数】6页(P1216-1221)【关键词】新鲜鸭血; 克雷伯氏菌; 生物膜; 胞外多糖【作者】汤纯; 史云娇; 卞欢; 孙芝兰; 刘芳; 朱云龙【作者单位】江苏省农业科学院农产品加工研究所江苏南京 210014; 扬州大学旅游烹饪学院江苏扬州 225127【正文语种】中文【中图分类】TS251.7克雷伯氏菌属细菌(Klebsiella sp.)，是重要的条件致病菌和医源性感染菌，广泛存在于人的肠道和呼吸道中，在人体免疫力低下时，会引发败血症等疾病[1]。
经过临床病理研究和细菌学研究发现克雷伯氏菌肠道感染的可能性远大于呼吸道感染的可能性，现已检测出多起克雷伯氏菌病例，可能与食用地沟油等非正规渠道生产的食品有关[2]。
Hamza等[3]对埃及的5个肉鸡场调查发现，在肉鸡及养殖人员的粪便、饮用水中产碳青霉烯酶的肺炎克雷伯氏菌检出率较高。
韩坤等[4]从水貂中分离得到10株肺炎克雷伯氏菌，其中大部分菌株对多种临床常用药物表现出耐药性，对青霉素类、氨基糖苷类、喹诺酮类、三代头孢菌素类及磺胺类抗生素的耐药性较高，临床治疗十分困难。
同时，克雷伯氏菌属细菌能产胞外多糖[5]，有较强的生物膜形成能力。
生物膜，又称为生物被膜，是微生物有组织生长的聚集体，能够在有生命、无生命的物体表面附着[6]。
在自然界中，大部分微生物以生物膜的形式存在[7]，同时生物膜中大量的黏性基质形成了一个物理屏障，使抗生素和宿主的免疫系统不能对细菌产生有效的攻击[8-9]。
本研究利用结晶紫染色法[10]，以在取血过程中极易被微生物污染的新鲜鸭血[11-13]为样本，定量检测鸭血中优势腐败菌的生物膜形成能力。
以其中1株成膜能力最强的克雷伯氏菌K6为目标菌株，测定该菌7 d内形成的生物膜内菌数及胞外多糖含量，研究其成膜特性，为今后禽体取血加工过程中腐败微生物的控制及该菌生物膜的抑制剂开发提供基础。
Biolog微生物鉴定步骤
氧化酶阳性或氧化酶阴性但三糖铁实验为K/K或K/Aw
则该菌株为非肠道菌(GN-NENT)
氧化酶阴性以及三糖铁实验为A/A或K/A
则该菌株为肠道菌(GN-ENT)
如果菌株①需要在巧克力培养基上或需要6.5% CO2培养
②在BUG+B培养基上生长非常差
形成针尖大小的菌落
那么可以认为这些菌是苛生菌(GN-FAS)
非肠道菌 GN-ENT
肠道菌 GN-FAS
苛生菌 GP-COCCUS-ROD杆球菌、GP-COCCUS球菌、GP-ROD杆菌 GP-ROD
（芽孢杆菌） AN
厌氧菌 YT
酵母菌 FF
丝状真菌 扩大培养基 BUG+B BUG+B 巧克力培养基 BUG+B BUG+M+T BUA+B BUY 2%ME 培养温度 30℃ 35-37℃ 35-37℃ 35-37℃ 30℃ 35-37℃ 26℃ 26℃ 培养气体 空气 空气 6.5% CO2 空气或6.5% CO2 空气 无氢气的厌氧环境 空气 空气 接种液类型 GN/GP-IF GN/GP-IF+T GN/GP-IF+T GN/GP-IF+T GN/GP-IF AN-IF 水 FF-IF 接种浊度/
应把鉴定板拿出冰箱
让鉴定板恢复到常温
因为有些菌种（如Neisseria ）对温度的快速变化很敏感
6. 仔细校正浊度计
接种菌悬液的浊度应在规定的范围内
7. 鉴定板中包含多种对温度和光照敏感的物质
如果个别孔出现棕黑色
说明碳源已经被降解
有时候
在保质期内或超过保质期不长的时间里
SHENTEK 质粒 DNA 残留检测试剂盒 （PCR-荧光探针法） 说明书
SHENTEK®质粒DNA残留检测试剂盒（PCR-荧光探针法）说明书货号：SK030217PL100版本：A/4仅供研究用湖州申科生物技术有限公司⏹试剂盒简介SHENTEK®质粒DNA残留检测试剂盒用于定量检测基因治疗产品中质粒DNA残留的专用检测试剂盒，如CAR-T细胞治疗中慢病毒载体制备相关的质粒DNA。
本试剂盒利用Taqman探针原理，通过各质粒共有DNA序列，如ColE1/pMB1/pBR322/pUC来源的复制子，定量检测样本中质粒DNA的残留。
客户可以事先将质粒DNA序列给本公司技术人员进行确认。
本试剂盒检测快速，专一性强，性能可靠，最低检测限可以达到102copies/μl。
试剂盒配套有质粒DNA定量参考品。
本试剂盒与SHENTEK®宿主细胞残留DNA样本前处理试剂盒配套使用，可准确定量样本中残留的微量质粒DNA。
⏹试剂盒成份表1.试剂盒组份组份装量储存条件Plasmid DNA定量参考品50μl×1管-18℃及以下Plasmid Primer&Probe MIX300μl×1管-18℃及以下，避光qPCR Reaction Buffer850μl×2管-18℃及以下，避光DNA稀释液 1.5ml×3管-18℃及以下IPC MIX150μl×1管-18℃及以下，避光⏹规格：100Reactions。
⏹有效期:规定储存条件下24个月。
⏹适用机型（包括但不限于）ABI PRISM®7500Real-Time PCR SystemCFX96(Bio-Rad)Linegene9600plus（博日）⏹实验所需但试剂盒中未含材料1.5ml无菌离心管96孔qPCR板1000μl，100μl，10μl无菌有滤芯枪头⏹相关设备荧光定量PCR仪1000μl，100μl，10μl移液枪⏹操作过程Plasmid DNA定量参考品的稀释和标准曲线的制备Plasmid DNA定量参考品浓度为1.2ng/μl，通过如下公式换算成拷贝数：2.98×108copies/μl。
微生物检测菌落总数测定方法
微生物学检验菌落总数的测定1 原理微生物活体数量的测定方法，常用平板培养计数法。
它是通过将样品制成均匀的一系列不同稀释度的稀释液，再取一定的稀释液接种，使其均匀分布于培养皿中特定的培养基内，最后根据在平板上长出的菌落数计算出每克（或mL ）样品中的活菌数量。
2 材料和仪器2.1 平皿：φ90mm 。
2.2 无菌锥形瓶：容量250mL ，500 mL 。
2.3 无菌吸管：1mL （具0.01mL 个度）,10mL （具0.1mL 刻度）或微量移液器及吸头。
2.4 灭菌锅。
2.5 恒温培养箱2.6 涂棒。
2.7 酒精灯。
2.8 超净工作台。
2.9 磁力搅拌器。
2.10 漩涡振荡器3 检验程序菌落总数的检验程序见下图。
方法①↙ ↘方法②↘ ↙4 操作步骤4.1 培养基和试剂的配制4.1.1 平板计数琼脂培养基：LB培养基（最常用）牛肉膏5g蛋白胨10g氯化钠5g琼脂20g蒸馏水1LpH 7.0～7.2将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH值，分装锥形瓶中，121℃高压灭菌30分钟。
4.1.2 无菌生理盐水的配制：称取8.5g氯化钠溶解于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌30分钟。
4.2 样品的稀释：4.2.1 固体样品：称取10g固体样品置于盛有90mL无菌生理盐水的无菌锥形瓶中（内装数粒无菌玻璃珠），在旋转式摇床上200r/min充分振荡30min，制成1：10的样品均液，即10-1稀释液。
4.2.2用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品均液1mL（吸取前需要摇匀1：10稀释液），缓慢加入盛有9mL无菌生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不能触及稀释液面），用漩涡振荡器振荡，混合均匀，制成1：100的样品稀释均液。
4.2.3按照4.2.2操作程序，制备10倍系列样品稀释液，每递增稀释一次，换用一次1mL无菌吸管或吸头。
4.2.4 根据对样品活菌数量的估计，选择3~4个适宜稀释度的样品均液（比如10-6，10-7，10-8，10-9稀释液）。
标准操作规程(SOP)——流感禽流感微量中和抗体检测
标准操作规程（SOP）——一、目的微量中和试验是一种敏感性高、特异性强的血清学方法，用于测定血清中的病毒特异性中和抗体水平。
中国国家流感中心的所有技术人员，必须按照本文件相关的操作规程，进行流感/禽流感微量中和抗体检测实验，以确保实验的准确性。
二、范围适用于中国国家流感中心的所有技术人员进行流感/禽流感微量中和抗体检测。
三、责任进行流感/禽流感微量中和抗体检测的技术人员需严格按照规定进行操作。
四、程序（一）生物安全要求H5，H7亚型高致病性禽流感病毒，H2N2亚型流感病毒的操作需要在生物安全3级（BSL-3）实验室中进行。
其余流感病毒的操作需要在生物安全2级（BSL-2级）实验室中进行。
操作人员必须严格按照相应实验室的要求做好个人防护。
（二）材料1．中和反应实验材料（1）病毒：一般采用接种鸡胚尿囊腔后收获的流感/禽流感病毒液，在-70℃中保存，并且注意避免反复冻融。
进行中和试验之前，需先进行病毒滴度（TCID50）的滴定。
具体步骤如下，1）病毒的稀释：可采取对数或者半对数稀释的方法。
以下介绍半对数稀释法。
取1管冻存病毒尿囊液，用病毒培养液进行1:100稀释。
第一列4个孔每孔加入146μL 1:100稀释过的病毒液，其它各列每孔加入100 μL 病毒培养液。
然后用多道加样器从第一孔吸46μL 至第二孔，做系列半对数稀释，使之成为10－2、10－2.5、10－3、10－3.5……10－7。
每孔含有100μL 病毒液。
2）每孔加入100μL MDCK 细胞悬液（1.5×104细胞/孔），37℃，5%CO 2培养箱孵育18～22h 。
每一滴度作平行4孔。
3）细胞固定、ELISA 操作如下述。
4）OD 值 〉2倍MDCK 细胞对照OD 值判定为阳性5）病毒滴度计算见组织细胞半数感染量滴定SOP 。
（2）血清样品：包括待检血清、阳性及阴性血清对照。
如果待检血清有可能需要多次检测，则需将待检血清进行小量分装，-20℃至-70℃保存均可，避免多次反复冻融。
Molecular Devices FlexStation 3 微孔板检测系统操作简介
Molecular Devices -5-
软件界面
1. 菜单栏
Molecular Devices, 021-68878820 / 010-64108629 技术支持-单良 / 维修支持-徐伟
‘File’下拉菜单内含另存，保存，输出，打印等命令。 ‘Edit’下拉菜单内含剪切，复制，粘贴，删除，重新计算等命令。 ‘Experiment’下拉菜单内含新实验，新记录，新微孔板，新比色皿，新图等命令。 ‘View’下拉菜单内含关于页面显示的命令。 ‘Protocols’下拉菜单内含超过 120 种可以应用于各类生化和细胞实验的模版。 ‘Control’下拉菜单内含开关插槽，震板，温控等命令。 ‘Window’下拉菜单内含页面排列的命令。 ‘Help’下拉菜单内含软件版本号，SoftMax Pro User Guide 和 Formula Reference Guide.
FlexStation 3 操作简介
Molecular Devices -1-
Molecular Devices, 021-68878820 / 010-64108629 技术支持-单良 / 维修支持-徐伟
仪器和软件总体介绍 ........................................................................................3 硬件操作步骤及注意事项 .................................................................................4
仪器保养注意
1） 有良好的电源，保持 24 小时开机。 2） 保持避光和干净的室内环境，维持一定的湿度(30%-80%)。 3） 维持室内比较恒定的温度，以 20-22 度为最适宜。 4） 适用 6-384 孔板。96 孔微孔板内每孔可检测 100-300ul 溶液，最佳检测体积为 200ul。 5） 384 孔微孔板内每孔可检测 50-100ul 溶液，最佳检测体积为 80ul。 6） 检测后的微孔板不要长期置于仪器插槽中，检测完后就从仪器中取出，避免溶液蒸发腐
酵母菌BIOLOG 96孔板介绍 2
YT 鉴定使用YT鉴定板提供94个生化测试反应来鉴定/特征化一系列酵母菌。
A—C行测定是颜色，以A1孔作为参照孔。
D—H行测定的是浊度，以D1孔作为参照孔。
鉴定板培养24，48，或/和72h，形成特定图谱，读取获得鉴定结果。
注意事项：1 用纯化后的菌落2 用特定的培养基，最好转接2代3 无菌操作，避免污染4 尽量用一次性玻璃器皿5 使用前预热接种用无菌水和鉴定板至室温6 校正浊度仪，配制特定浓度范围的菌悬液7 biolog的化合物包含对光和温度敏感的成分。
鉴定板孔颜色变为深褐色表明碳源也变质。
一些孔显示黄色或粉红色是正常的。
8 鉴定板测试的是活体细胞的代谢特性，一些菌在受到一些压力选择，如温度，PH，渗透压即使几秒也会失去代谢活力。
为得到最好的结果，一定确保细胞有活性，操作时也要注意。
无菌水自己制备无菌水，在无菌间将其转入biolog提供的相同的规格的玻璃管中。
（20ml 容量，20×150mm），每管放入12-15ml无菌水测试步骤1 在BUY培养基上26℃培养待鉴定的酵母菌。
凡能用YT鉴定板鉴定的菌都可以在该条件下培养生长。
2 样品准备及观察特征利用湿法制备（水片法）或革兰氏染色（如果需要的话）来确认待鉴定菌株是酵母菌。
转到BUY培养基培养，最好培养两代。
细胞需要新鲜培养，平板培养基上培养时间为24-48h如果菌量较少不足以接种鉴定板，多接几块平板，培养24-48h3 接种准备以装有空白无菌水玻璃管调100%T透光率用标准比浊管校正，应为47%T制备特定浓度菌悬液接种上鉴定板，不要操作20min，每孔100ul4 培养放于26℃培养鉴定板将板放入一个密闭的塑料袋或其他盒中，加入浸湿的纸团或毛巾，用以保持湿度，避免在培养过程中使鉴定板中菌悬液因蒸发而减少影响结果。
培养鉴定板24，48或72h，直到得到鉴定结果。
结果A1孔作为A-C行的参照孔，D1孔作为D-H行的参照孔。
以590nm处峰值用来分别测试A-C行的颜色变化，D-H行的浊度变化。
肺炎克雷伯菌胞外多糖抗生物膜活性研究
肺炎克雷伯菌胞外多糖抗生物膜活性研究刘姝灵， 税 剑， 马小华， 潘建华， 石国民， 喻 容， 周前选， 龙江文， 易一行， 向延根摘要：目的探讨肺炎克雷伯菌胞外多糖的抗生物膜活性。
方法 96孔板筛选分泌具有抗表皮葡萄球菌生物膜活性物质的肺炎克雷伯菌菌株；煮沸法、酶处理法、高碘酸钠氧化法分析抗生物膜活性物质的化学性质；乙醇法粗提胞外多糖，浓硫酸-苯酚法测定肺炎克雷伯菌胞外多糖含量，稀释法探索抗生物膜活性是否具有浓度依赖性；结晶紫染色法检测肺炎克雷伯菌胞外多糖的广谱抗生物膜活性。
结果 20株肺炎克雷伯菌临床菌株上清液对表皮葡萄球菌ATCC 35984生物膜具有不同程度的抑制，抑制率为16.1%～73.5%；上清液中抗生物膜的活性物质为多糖；生物膜抑制率为73.5%，菌株粗提多糖含量为200.1 mg/L，此菌株胞外多糖对表皮葡萄球菌生物膜的抑制作用具有浓度依赖性；该多糖对铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌、粪肠球菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌临床菌株生物膜具有显著抑制作用（P＜0.05）。
结论检出一种具有广谱抗细菌生物膜活性的肺炎克雷伯菌胞外多糖，该多糖抑制生物膜的效果具有浓度依赖性。
关键词：肺炎克雷伯菌；胞外多糖；抗生物膜活性中图分类号：R378.99 文献标识码：A 文章编号：1009-7708 ( 2021 ) 03-0303-06DOI: 10.16718/j.1009-7708.2021.03.011Anti-biofilm activity of Klebsiella pneumoniae extracellular polysaccharideLIU Shuling, SHUI Jian, MA Xiaohua, P AN Jianhua, SHI Guomin, YU Rong, ZHOU Qianxuan, LONG Jiangwen, YI Yihang, XIANG Yangen（Department of Laboratory Medicine, Changsha Central Hospital Affiliated to University of South China, Changsha 410004, China）Abstract: Objective To examine the anti-biofilm activity of Klebsiella pneumoniae extracellular polysaccharides. Methods The K. pneumoniae strains secreting active substances for inhibiting Staphylococcus epidermidis biofilm formation were screened out on 96-well plate. The chemical properties of the active substances were characterized by boiling, enzyme method, and sodium periodate oxidation method. The extracellular polysaccharides were extracted by ethanol method. The content of K. pneumoniae extracellular polysaccharides was assayed by concentrated sulfuric acid-phenol method. Dilution method was used to investigate whether the anti-biofilm activity was concentration-dependent. The broad-spectrum anti-biofilm activity of K. pneumoniae extracellular polysaccharides was analyzed by crystal violet staining. Results The supernatant of 20 clinical K. pneumoniae strains inhibited the biofilm formation of S. epidermidis ATCC 35984 with inhibition rate of 16.1%-73.5%. The active anti-biofilm substance in the supernatant was identified as polysaccharides. The crude polysaccharide content was 200.1 mg/L in the strain showing a biofilm inhibition rate of 73.5%. The inhibitory effect of the extracellular polysaccharides of this strain on S. epidermidis biofilm formation was concentration-dependent. The polysaccharide had significant inhibitory effect on the biofilm formation in clinical strains of Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Acinetobacter baumannii, Enterococcus faecalis, S. epidermidis and Staphylococcus aureus (P < 0.05). Conclusions An extracellular polysaccharide of K. pneumoniae was identified with broad-spectrum anti-biofilm activity. The inhibitory effect of this polysaccharide on biofilm formation is concentration-dependent.Keywords:Klebsiella pneumoniae,extracellular polysaccharide,anti-biofilm activity·论著· 基金项目：湖南省卫生和计生委员会科研课题（132016156）。
线粒体复合体Ⅳ活性检测试剂盒说明书 微量法
线粒体复合体Ⅳ活性检测试剂盒说明书微量法注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。
货号：BC0945规格：100T/96S产品内容：提取液：液体75mL×2瓶，4℃保存；试剂一：液体21mL×1瓶，4℃保存；试剂二：粉剂×1支，-20℃保存；试剂三：粉剂×1支，4℃保存；工作液的配制：临用前取试剂一、试剂二、试剂三各一支，将试剂二和试剂三依次转移到试剂一中混合溶解。
产品说明：线粒体复合体Ⅳ又称细胞色素C氧化酶，也是线粒体呼吸电子传递链主路和支路的共有成分，负责催化还原型细胞色素C的氧化，并最终把电子传递给氧生成水。
还原型细胞色素C在550nm有特征光吸收，线粒体复合体Ⅳ催化还原型细胞色素C生成氧化型细胞色素C，因此550nm光吸收下降速率能够反映线粒体复合体Ⅳ酶活性。
需自备的仪器和用品：可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：一、复合体Ⅳ的提取：1称取约0.1g组织或收集500万细胞，加入1.0mL提取液，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
24℃600g离心10min。
3将上清液移至另一离心管中，4℃11000g离心15min。
4上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅳ（此步可选做，可以判断线粒体提取效果）。
5在沉淀中加入400uL提取液，超声波破碎（功率20％，超声5秒，间隔10秒，重复15次），用于复合体Ⅳ酶活性测定，并且用于蛋白含量测定。
二、测定步骤：1、可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至550nm，蒸馏水调零。
2、样本测定（1）将工作液置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育15min；用不完的试剂4℃可保存一周；（2）在微量玻璃比色皿/96孔板中分别加入试剂名称测定管空白管样品（μL）10-蒸馏水（μL）-10工作液（μL）200200立即混匀，分别记录测定管和空白管550nm处初始吸光值A1和1min后的吸光值A2，测定管的记为A1测定管，A2测定管，空白管的记为A1空白管，A2空白管。
平板菌落计数法操作步骤(精)教学文稿
平板菌落计数法操作步骤(精)教学文稿平板菌落计数法操作步骤（精）平板菌落计数法一、目的要求学习平板菌落计数的基本原理和方法。
二、基本原理平板菌落计数法是将等测样品经适当稀释后，其中的微生物充分分散为单个细胞，取一定量的稀释液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成的肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。
统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。
但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的2~3或更多个细胞。
因此平板菌落计数的结果往往偏低。
现在常使用菌落形成单位。
该计数法的缺点是操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是这种计数方法最大的优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验，以及食品、饮料和水等含菌指数或污染度的检测。
三、器材大肠杆菌悬液，LB琼脂培养基，1mL 5mL无菌吸管，无菌平皿，无菌水，无菌试管，试管架和记号笔等。
四、操作步骤1、编号取无菌平皿9套，分别标明为10-4、10-5、10-6各三套，另取6支无菌试管分别标记为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。
2、稀释用1mL无菌吸管吸取1mL已充分混匀的大肠杆菌菌悬液，精确地放0.5mL至10-1的试管中，此即为10倍稀释，将多余的菌液放回原菌液中。
将10-1试管充分振荡、混匀。
另取一支1ml吸管插入10-1试管中来回吹吸菌液三次，进一步将菌体分散、混匀。
动作不要太猛太快，吸时插入，吹时提出，再用此吸管吸取10-1菌液1mL精确地放0.5mL至10-2试管中，此即为100倍稀释，依次类推，3、取样用三支1ml无菌吸定分别吸取10-4、10-5、10-6的稀释菌悬液各1mL对号放入编好号的无菌平皿中，每个平皿放0.2mL4、倒平板尽快向上述盛有不同稀释菌液的平皿中倒入融化后冷却至45度的LB培养基约15-20ml，置水平位置迅速旋动平皿，使培养基与菌液混合均匀。
02DL-96NE细菌测定系统作业指导书
DL-96NE细菌测定系统作业指导书【适用范围】适用于氧化酶试验阳性或氧化酶试验阴性但厌氧葡萄糖不产酸的革兰氏阴性杆菌的鉴定和抗菌药物MIC测定。
【适用仪器】DL-96NE细菌测定系统。
【原理】试剂板由生化反应孔和抗菌药物MIC测定试验孔组成，在生化反应孔中加入细菌悬液，抗菌药物MIC测定试验孔中加入培养基，经35-37℃孵育.生化反应在细菌代谢作用下直接产生颜色变化或经加入显色剂后产生颜色变化，抗菌药物MIC测定试验根据试验孔是否出现浑浊（沉淀）确定细菌是否生长，通过细菌测定系统分析从而将细菌快速、准确的鉴定到种属同时分析抗菌药物MIC值。
【主要组成成份】1.DL-96NE试剂板10块2.肉汤培养基、稀释液10人份3.辅助试剂（硝酸盐还原试剂A、硝酸盐还原试剂B、无菌石蜡油、靛基质试剂）10人份4.说明书1份【标本要求】使用本试剂板的被测菌应符合以下三项要求：●无特殊营养要求的革兰氏阴性杆菌；●氧化酶试验阳性，或氧化酶阴性但厌氧葡萄糖不产酸；●18-24小时分离培养的单个纯菌落（或纯培养物）【检验方法】生化试验操作方法1.菌悬液制备：挑取纯培养单个菌落于稀释液瓶内壁研磨呈细菌悬液（0.5麦氏单位）。
2.连续移液器（配无菌吸头）吸取该菌液加入试剂板A1-A12孔，B1-B12孔，每孔100μl。
3.在A1-A7孔分别滴加无菌石蜡油2滴。
抗菌药物MIC测定试验操作方法1.吸取菌悬液50μl，加至肉汤培养基，混匀，继续加入试剂板的其余各孔（所有的MIC测定试验及生长对照C+及6.5%Nacl），每孔100μl。
2.剩余的菌液及吸头浸入杀菌溶液内浸泡灭菌。
3.撕开不干胶的纸对齐贴于试剂板，35-37℃孵育18-24h后，判读结果。
【结果判读】1. 先于A11孔（IND）滴加靛基质试剂一滴，数分钟后再于A10孔（NIT）滴加硝酸盐还原试剂A、B各一滴，立即判读结果。
2. 将试剂板放进细菌测定系统分析，分析完毕后，自动判定细菌种属和抗菌药物MIC半定量结果,并打印报告单（细菌测定系统的详细操作另介绍）。
96孔微量板定量检测细菌生物膜的方法步骤
96孔微量板定量检测细菌生物膜的方法步骤(protocol)摘要：96孔微量板定量检测法（polystyrene microtiter plate assay）检测细菌生物膜有着许多优势。
一方面，在对大批样品快速操作时能保持试验的一致性。
另一方面，微量板定量检测法不仅能对细菌形成生物膜定性，而且还能定量计算细菌形成生物被的能力，因此96孔微量板法被广泛应用于定量检测细菌生物被膜的方法。
关键词：生物膜, 菌膜相对于其它细菌生物膜体外培养方法而言，微孔板法有着当然的批处理优势，尤其是在对大批样品快速操作时还能保持试验的一致性，使得96孔板，乃至384孔板检测法大量应用于细菌生物膜的研究。
微量板定量检测法（polystyrene microtiter plate assay）不仅能定性细菌能否形成生物膜，而且和不同染色方法结合，还能定量计算细菌形成生物被的能力，这对实验室生物被膜研究工作是非常有利的，因此96孔微量板定量检测法是目前实验室广泛应用的定量检测细菌生物被膜的方法。
主要试剂和仪器：聚苯乙烯96孔板、PBS缓冲液、甲醇、1%结晶紫溶液、33%冰乙酸溶液、酶标仪或分光光度计。
实验步骤：(1) 在96孔聚苯乙烯微孔培养板中每孔加入100μl培养液，接种10μl过夜培养菌液，37°C静置孵育36h；(2)将培养液吸出，每孔加入200μl无菌PBS缓冲液清洗板孔3次；(3) 每孔加入100μl甲醇固定15min，然后吸出培养孔中的甲醇，自然风干；(4) 每孔加入100μl 1%结晶紫溶液，室温下染色5min；(5) 吸出培养孔中的结晶紫染色液后，用流水把多余的染料冲洗干净；(6) 把培养板倒置在滤纸上除去残余的水，并在37°C烘箱中烘干或室温凉干；(7) 完全干燥后，每孔加入100μl 33%冰乙酸溶液，在37°C培养箱中作用30min以溶解结晶紫；(8) 590nm条件下，用酶标仪测定培养孔中溶液的OD值；(9) 每次试验每种菌株做3个孔的重复，试验数值取3次平均值（D值）；(10) 以未接种菌的培养液作为阴性对照，阴性值的2倍作为界限值(Dc)。
实验操作指南
实验操作指南一、亚洲I型口蹄疫抗体检测液相阻断ELISA（LB-ELISA）试验液相阻断ELISA主要用于检测抗体。
应用于两个方面的目的：⑴检测FMD病毒感染，广泛用于国际贸易中；⑵监测免疫抗体，评价FMD疫苗免疫效力，也就是疫苗免疫动物的抗强毒攻击能力。
1、反应原理预先滴定好的固定量病毒抗原与被检血清首先在液相中反应，然后将抗原抗体复合物转移到包被了FMD型特异性抗体的ELISA板中，没有完全被血清抗体阻断的病毒抗原被ELISA板中的抗体捕获，亦与随后加入的豚鼠搞血清中的抗体结合，再通过兔抗豚鼠IgG酶结合物和底物溶液显色。
按试验孔呈现的颜色与抗原对照（未加血清）孔呈现颜色相比较判定结果。
抗体滴定以能阻断50%病毒抗原的血清稀释度表示。
2、主要试剂与耗材⑴主要试剂①捕获抗体：口蹄疫146S兔抗血清②检测抗体：口蹄疫病毒146S豚鼠抗血清③酶结合物：兔抗豚鼠IgG-辣根过氧化物酶结合物④病毒抗原及病毒对照抗原：用BEI灭活的病毒细胞培养物⑤标准阳性血清和阴性血清⑥底物溶液：邻苯二胺（OPD）/H2O2溶液（具体配制溶化后，再加2片OPD片剂，充分溶解，分装成5 ml或10 ml/瓶，避光-20度保存。
用前避光溶化，临用时每10 ml上述溶液加100ul配备的3%的双氧水）⑦终止液：1.25mol/LH2SO4⑧缓冲液包被缓冲液：0.05MNa2CO3/NaHCO3，PH9.6稀释液：0.05%（V/V）Tween-20加入0.01MPBS，PH7.4（PBST）豚鼠抗血清稀释液：5%脱脂奶粉-PBST洗涤液：0.01MPBST，PH7.4⑵主要仪器材料①ELISA板：96孔平底聚苯乙烯ELISA板。
②抗原抗体反应板：96孔U形夜工聚丙微量板。
③移液器：0.5-20ul，5-40 ul，50-200 ul，200-2000 ul可调节移液器各一把，8道或12道移液器一把，移液槽5-6个，各配套移液枪尖若干。
Biolog微生物鉴定步骤
Biolog微生物鉴定步骤一检测原理Biolog微生物鉴定系统测试的是微生物在鉴定板中利用或氧化化和物的能力。
测试会产生特征性的紫色孔模式，组成代谢指纹。
所有必需的营养物质和生化试剂都预先加进96孔板中，四唑紫是一种氧化还原染料，指示碳源的利用情况。
.鉴定步骤非常简单，纯化分离到的菌株经扩大培养，再制成接种液加到鉴定板中。
在培养过程中，一些孔中的化学物质能被氧化并将显色物质成紫色，对照孔（A-1）和阴性孔仍然为无色。
鉴定板在相应的培养条件下培养4-6小时或16-24小时即可形成代谢模式。
系统软件自动和数据库对比，如果能找到合适的匹配，就可以得出一个鉴定结果。
二所需器材和消耗品：培养基、接种液、巯基乙酸钠、长棉签、接种棒、储液槽、八道移液器、移液器头、浊度仪、浊度标准品、控温培养箱和相应的鉴定板。
其中接种液自行配制，接种棒、储液槽可选用国产品牌代替。
三鉴定步骤：Biolog微生物鉴定样品处理步骤分离纯化培养基BUG+B通用培养基加羊血BUA+B厌氧培养基加羊血BUY酵母培养基2%ME2%的麦芽汁提取物革兰氏染色和菌落菌株形态观察革兰氏染色结果革兰氏阴性革兰氏阳性厌氧菌酵母菌丝状真菌确认实验氧化酶反应阳性氧化酶反应阴性、三糖铁实验A/A或K/A需在巧克力培养基上或需要6.5%CO2培养确认实验氧化酶反应阴性、三糖铁实验K/K或K/A w第一步：在用户自己的培养基上纯化菌株，如果菌株为冻干或冷冻样品，需要传代培养2-3代，让菌株恢复活力。
对纯化好的菌株做革兰氏染色，确定菌株是革兰氏阴性还是阳性。
观察菌落外部形态或用显微镜观察菌株形态，确定是酵母还是丝状真菌，是球菌还是杆菌。
如果是革兰氏阴性菌，还需要最终确认是肠道菌、非肠道菌或苛生菌。
方法是，氧化酶阳性或氧化酶阴性但三糖铁实验为K/K或K/A w，则该菌株为非肠道菌(GN-NENT)，氧化酶阴性以及三糖铁实验为A/A或K/A，则该菌株为肠道菌(GN-ENT)。
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96孔微量板定量检测细菌生物膜的方法步骤(protocol) 摘要：96孔微量板定量检测法（polystyrene microtiter plate assay）检测细菌生物膜有着许多优势。
一方面，在对大批样品快速操作时能保持试验的一致性。
另一方面，微量板定量检测法不仅能对细菌形成生物膜定性，而且还能定量计算细菌形成生物被的能力，因此96孔微量板法被广泛应用于定量检测细菌生物被膜的方法。
关键词：生物膜 , 菌膜
尤其是在对大批样品快速操作时还能保持试验的一致性，使得96孔板，乃至384
microtiter plate assay）不仅能定性细菌能否形成生物膜，而且和不同染色方法结合，还能定量计算细菌形成生物被的能力，这对实验室生物被膜研究工作是非常有利的，因此96孔微量板定量检测法是目前实验室广泛应用的定量检测细菌生物被膜的方法。
主要试剂和仪器：
聚苯乙烯96孔板、PBS缓冲液、甲醇、1%结晶紫溶液、33%冰乙酸溶液、酶标仪或分光光度计。
实验步骤：
(1) 在96孔聚苯乙烯微孔培养板中每孔加入100μl培养液，接种10μl过夜培养菌液，37°C静置孵育36h；
(2)将培养液吸出，每孔加入200μl无菌PBS缓冲液清洗板孔3次；
(3) 每孔加入100μl甲醇固定15min，然后吸出培养孔中的甲醇，自然风干；
(4) 每孔加入100μl 1%结晶紫溶液，室温下染色5min；
(5) 吸出培养孔中的结晶紫染色液后，用流水把多余的染料冲洗干净；
(6) 把培养板倒置在滤纸上除去残余的水，并在37°C烘箱中烘干或室温凉干；
(7) 完全干燥后，每孔加入100μl 33%冰乙酸溶液，在37°C培养箱中作用30min以溶解结晶紫；
(8) 590nm条件下，用酶标仪测定培养孔中溶液的OD值；
(9) 每次试验每种菌株做3个孔的重复，试验数值取3次平均值（D值）；
(10) 以未接种菌的培养液作为阴性对照，阴性值的2倍作为界限值(Dc)。
结果判定：
基于D值，菌株可分为3类：
（1）强生物被膜形成株（D＞2×Dc）；
（2）弱生物被膜形成株（Dc＜D≤2×Dc）；
（3）无生物被膜形成株（D≤Dc）。
2004年，Fox等采用微量板定量检测法对分离自45个奶牛场的牛奶、奶牛乳头皮肤和挤奶器的221株金黄色葡萄球菌的生物被膜形成情况进行了研究，鉴定出牛奶中分离的葡萄球菌41.4%有生物膜形成，皮肤和机器中分离的葡萄球菌分别为24.7%、14.7%有生物膜形成，表明与牛奶密切相关的金黄色葡萄球菌比乳腺外源葡萄球菌更容易形成生物被膜，并证明生物被膜形成是奶牛乳内感染的一个危险因素。