96孔微量板定量检测细菌生物膜的方法步骤

96孔微量板定量检测细菌生物膜的方法步骤(protocol) 摘要：96孔微量板定量检测法（polystyrene microtiter plate assay）检测细菌生物膜有着许多优势。一方面，在对大批样品快速操作时能保持试验的一致性。另一方面，微量板定量检测法不仅能对细菌形成生物膜定性，而且还能定量计算细菌形成生物被的能力，因此96孔微量板法被广泛应用于定量检测细菌生物被膜的方法。

关键词：生物膜 , 菌膜

尤其是在对大批样品快速操作时还能保持试验的一致性，使得96孔板，乃至384

microtiter plate assay）不仅能定性细菌能否形成生物膜，而且和不同染色方法结合，还能定量计算细菌形成生物被的能力，这对实验室生物被膜研究工作是非常有利的，因此96孔微量板定量检测法是目前实验室广泛应用的定量检测细菌生物被膜的方法。

主要试剂和仪器：

聚苯乙烯96孔板、PBS缓冲液、甲醇、1%结晶紫溶液、33%冰乙酸溶液、酶标仪或分光光度计。

实验步骤：

(1) 在96孔聚苯乙烯微孔培养板中每孔加入100μl培养液，接种10μl过夜培养菌液，37°C静置孵育36h；

(2)将培养液吸出，每孔加入200μl无菌PBS缓冲液清洗板孔3次；

(3) 每孔加入100μl甲醇固定15min，然后吸出培养孔中的甲醇，自然风干；

(4) 每孔加入100μl 1%结晶紫溶液，室温下染色5min；

(5) 吸出培养孔中的结晶紫染色液后，用流水把多余的染料冲洗干净；

(6) 把培养板倒置在滤纸上除去残余的水，并在37°C烘箱中烘干或室温凉干；

(7) 完全干燥后，每孔加入100μl 33%冰乙酸溶液，在37°C培养箱中作用30min以溶解结晶紫；

(8) 590nm条件下，用酶标仪测定培养孔中溶液的OD值；

(9) 每次试验每种菌株做3个孔的重复，试验数值取3次平均值（D值）；

(10) 以未接种菌的培养液作为阴性对照，阴性值的2倍作为界限值(Dc)。

结果判定：

基于D值，菌株可分为3类：

（1）强生物被膜形成株（D＞2×Dc）；

（2）弱生物被膜形成株（Dc＜D≤2×Dc）；

（3）无生物被膜形成株（D≤Dc）。

2004年，Fox等采用微量板定量检测法对分离自45个奶牛场的牛奶、奶牛乳头皮肤和挤奶器的221株金黄色葡萄球菌的生物被膜形成情况进行了研究，鉴定出牛奶中分离的葡萄球菌41.4%有生物膜形成，皮肤和机器中分离的葡萄球菌分别为24.7%、14.7%有生物膜形成，表明与牛奶密切相关的金黄色葡萄球菌比乳腺外源葡萄球菌更容易形成生物被膜，并证明生物被膜形成是奶牛乳内感染的一个危险因素。