2011CB944000-G哺乳动物后肾发育重要环节及关键调控因子的研究

二、预期目标1、本项目的总体目标通过系统而创新性地研究肾脏发育过程中三个重要环节（后肾间充质和输尿管芽的相互作用、帽状间充质细胞分化为上皮细胞以及肾单位的形成）所涉及的关键分子的表达变化、功能作用及其主要分子信号通路，阐明哺乳动物后肾发育过程中细胞定向分化的分子调控机制。

建立和完善肾脏输尿管发育异常和遗传性肾病患者及家系成员的临床信息及生物样本资源库，开展相关疾病的遗传分子诊断。

提出并验证急性肾损伤修复再生的过程是肾脏发育某些过程的重现的学术观点，成功应用肾脏发育关键因子促进损伤肾脏的修复再生。

建立健全我国肾脏发育生物学研究的科研基地和技术平台，在肾脏发育生物学研究的国际前沿，取得一批具有自主知识产权的研究成果，提升我国在肾脏发育生物学研究领域的国际学术地位。

建立、培养、锻炼一支从事肾脏发育生物学基础和应用研究的高素质、高水平的学术团队，培养一批热爱肾脏发育生物学研究并具有一定专业技术水平的博士后、博士和硕士研究生等后备队伍。

2、五年预期目标（1）阐明Robo2基因变异导致肾输尿管发育异常、Cox2基因敲除导致表浅肾单位成熟障碍的分子机制。

（2）明确肾脏发育关键分子及主要信号通路在肾脏发育重要环节细胞定向分化过程中新的作用机制。

（3）构建后肾帽状间充质细胞分化为肾脏上皮细胞重要环节不同部位不同分化命运的细胞文库、基因表达谱和关键调控因子的分子解剖图谱。

（4）发现肾发育异常新的致病基因或基因突变位点；开展肾发育异常及遗传性肾病的遗传分子诊断。

（5）提出并验证急性肾损伤修复再生的过程是肾脏发育某些过程的重现的学术观点，应用肾脏发育关键因子促进损伤肾脏的修复再生。

（6）建立胚肾发育特异性表达GFP的转基因品系以及靶器官特异性Cre/loxP、条件性敲除靶基因的动物模型及其后续研究的技术平台。

（7）建立健全肾发育异常及遗传性肾病患者的临床信息及生物样本资源库。

（8）发表高水平的SCI收录论文40篇以上，申请专利2项以上。

（9）锻炼和造就一支从事肾脏发育生物学研究的高素质、高水平的学术团队，培养一批博士后、博士和硕士研究生。

（10）提升我国肾脏发育生物学领域的国际学术地位。

三、研究方案1、学术思路在肾脏的发育过程中，输尿管芽和后肾间充质的相互作用、间充质细胞分化为上皮细胞、肾单位的形成是肾脏发育的三个重要环节。

细胞定向分化是肾脏发育的核心。

本项目需要解决的关键科学问题是：在肾脏发育的重要环节有哪些关键调控因子影响了细胞的定向分化？这些分子的信号通路和调控机制如何？肾脏发育关键因子对先天性肾脏输尿管发育异常的分子诊断和损伤肾脏的修复再生有什么作用？为了解决这些问题，本项目结合发育与生殖研究国家重大科学研究计划2010年度重要支持方向“针对哺乳动物的一种重要组织器官，如肾脏、肝脏、造血系统等，在分子遗传水平上研究发现控制重要组织器官发育的关键因子和信号通路，揭示组织器官发育的根本机制”的要求，确定本项目的学术思路（见下图）：以肾脏发育三个重要环节为切入点，在分子遗传水平上，重点研究哺乳动物后肾发育过程中细胞定向分化的关键因子和信号通路，揭示肾脏发育的根本机制，将胚肾发育关键因子应用于肾脏输尿管发育异常和遗传性肾病的分子诊断，促进损伤肾脏的修复再生。

2、技术路线本项目用于寻找和探索新基因功能和机制，普遍使用的技术途径是：筛选候选基因----验证其表达变化----干预实验----明确其功能和机制----应用研究。

（1）应用转基因鼠和细胞特异条件性靶基因敲除鼠，结合基因组学、比较生物信息学研究技术，筛选肾脏发育关键候选基因。

（2）用分子生物学验证已有较好前期研究基础和新的候选基因在特定细胞、组织的时空表达特征。

（3）利用siRNA干预、质粒转染、转基因、基因敲除等基因修饰以及抗体中和、受（配）体拮抗等方法，进行体内、外的干预实验。

（4）明确关键候选基因和蛋白的功能和分子作用机制。

（5）将基础研究获得的肾脏发育关键因子应用于肾输尿管发育异常及遗传性肾病的分子诊断和损伤肾脏的修复再生。

3、创新点与特色（1）阐明肾脏发育重要环节关键因子在细胞定向分化过程中新的作用及分子调控机制，为培育可供移植的肾脏器官奠定基础。

（2）构建后肾发育重要环节不同部位、不同分化命运的肾脏细胞文库以及能反映后肾发育重要环节关键分子时空表达特征的分子解剖图谱。

创建胚胎肾脏、成熟肾脏、肾发育异常及遗传性肾病模型的肾脏资源库。

（3）建立肾发育异常及遗传性肾病患者的样本资源库及信息网络平台，发现并验证新的致病基因，建立我国肾发育异常及遗传性肾病的分子诊断体系。

（4）提出并验证肾损伤修复再生的过程是肾脏发育某些过程的重现的学术观点，应用新的肾脏发育关键因子的整合促进损伤肾脏的修复再生。

（5）主要特色是：针对遗传性肾脏疾病、肾输尿管发育异常及急性肾损伤多见、危害大的临床现象，将肾脏发育生物学基础研究的成果直接转化为遗传性肾病和肾发育异常的分子诊断及促进急性肾损伤的修复再生，“出口”明确，研究实用。

4. 可行性分析（1）具有坚实的理论基础本项目以肾脏发育过程中后肾间充质和输尿管芽的相互作用、帽状间充质细胞分化为上皮细胞以及肾单位的形成三个重要环节为切入点，重点研究影响细胞定向分化的关键因子和主要信号通路的调控机制，在理论上是有道理的。

因为胚肾发育需要经历这些必不可少的环节，后肾间充质细胞发育成肾单位需要细胞不断地定向分化为肾脏不同的固有细胞，细胞定向分化是肾脏发育的核心。

在肾脏发育的重要环节、围绕肾脏发育的核心问题，分别以Robo2、Cox2、Wnt、Notch、Wt1、VEGF等信号分子作为研究的重点是有依据的。

Robo2和Cox2拥有较好的前期研究基础，Wnt信号通路在后肾间充质上皮转分化（MET）中具有重要的作用，Notch信号调控肾单位的节段形成，Wt1决定足细胞的命运，VEGF是内皮细胞募集血管球形成所必需的，分别在肾脏发育的不同环节具有非常重要的调控作用。

（2）具有较好的前期研究基础本项目组有专门从事转基因动物和基因敲除动物模型研究的课题组成员和单位，主要学术骨干均在国外从事多年的分子细胞生物学基础实验研究，熟练掌握项目研究所需要的方法和技术。

包括利用细胞特异性Cre/loxP转基因鼠，进行特异性靶器官基因敲除、显微胚胎肾分离、体外胚肾组织和细胞培养的关键技术等。

积累了宝贵的研究经验，建立了一套完善的研究方法。

在急性肾小管坏死与再生修复的研究方面，在世界上首先提出骨调素及其受体CD44与肾小管坏死后上皮细胞的再生以及上皮细胞的极性形成有关，得到国际学术界的肯定，论文发表在国际肾脏病杂志（Kidney Int）和美国肾脏病杂志（Am J Nephrol）。

近年来有关急性肾小管坏死后上皮细胞再生方面的研究，连续得到国家自然科学基金的资助。

（3）拥有良好的设备和成熟的技术本项目的课题承担单位均具有很强的科研实力。

本单位开放的国家重点实验室以及各学科自身的实验室，已具备完成本项目所需要的设备和技术条件，是完成本项目的硬件保证。

（4）富有活力和团结拼搏精神的科研人才队伍本项目的研究队伍主要由长期从事肾脏及发育相关研究的学科带头人和中青年学术骨干组成，均工作在科研的第一线，主要学术骨干多有国外留学的经历，在本领域发表过有影响的SCI论文，他们有理论、有实践经验、有热情、有上进心和科研动力，富有活力和团结拼搏精神，与国外有关研究机构和研究人员保持着良好的关系，是完成本项目的人才保障。

人才队伍包括从事发育生物学、遗传学、基因工程学、再生医学、分子生物学、细胞生物学、肾脏病理学、病理生理学、肾脏病学的专职科研人员和研究生队伍。

项目和课题负责人思路清晰、作风严谨，有很强的协调能力。

尤其重要的是本项目的幕后有一批关心、支持、帮助本项目立项和实施的专家队伍，他们在精神上的鼓励、学术上的指导、技术上的点拨，是本项目成功实施的重要保障。

5、课题设计为了解决本项目的关键科学问题，结合发育与生殖研究国家重大科学研究计划2010年度重要支持方向的要求，本项目以肾脏发育过程中的三个重要环节细胞定向分化的关键因子和信号通路及其在分子诊断和修复再生中的应用为切入点，设计了四个课题：（1）肾脏发育过程后肾间充质和输尿管芽相互作用主控基因的调控研究。

（2）胚肾帽状间充质细胞分化为上皮细胞的关键因子和信号通路。

（3）肾血管球形成和足细胞发育的分子调控机制。

（4）肾脏发育关键因子在分子诊断及修复再生中的作用。

肾脏发育是连续的，重要环节的划分和课题的设计是人为的。

本项目以肾脏发育过程中的重要环节为主线设计课题。

由于肾脏发育的各个环节不是孤立的，而是相互联系的，因此课题间的研究内容也是相互联系的。

如第一课题输尿管芽和后肾间充质的相互诱导贯穿肾脏发育的全过程；第二课题帽状间充质细胞定向分化为肾脏上皮细胞和第三课题肾单位的形成均受到第一课题输尿管芽和后肾间充质相互作用的影响。

四个课题涉及的关键调控因子和信号通路也不是孤立的，如Wnt分子及信号通路可能与四个课题的研究内容都有关系。

因此一个环节科学问题（关键因子和信号通路）的解决，对另一环节的研究和认识可以提供借鉴和参考。

另外，一、二、三课题发现的肾脏发育关键因子可以应用于第四课题的肾脏发育异常的分子诊断和肾损伤的修复再生，而第四课题不仅可以应用和验证一、二、三课题的结果，其自身的研究成果对前三个课题也有帮助。

四个课题总的目标是一致的，就是发现并阐明肾脏发育重要环节中细胞定向分化的关键调控因子和主要信号通路，揭示肾脏发育的根本机制，将胚肾发育关键因子应用于肾脏输尿管发育异常和遗传性肾病的分子诊断，促进肾损伤的修复再生。

课题间的有机联系见下图：第一课题肾脏发育过程中后肾间充质和输尿管芽相互作用主控基因的调控研究研究目标1．阐明Robo2条件性敲除，通过后肾间充质和输尿管芽的相互作用导致肾输尿管发育异常的分子机制及其与主控基因GDNF/Ret的内在联系。

2．明确COX2基因敲除导致肾被膜下表浅肾单位障碍的分子机制,探讨COX2在浅表肾单位后间充质和输尿管芽相互作用的意义。

3．构建肾脏输尿管发育异常的动物模型，为深入研究肾脏输尿管发育过程提供良好的技术平台。

研究内容1．利用转基因小鼠和不同时间靶器官特异性Cre/loxP小鼠，进行靶器官细胞特异性敲除Robo2，结合基因组学技术，观察分析不同时期、特定部位（如后肾间充质和输尿管芽）基因的表达谱差异及表型变化，筛选和验证候选关键调控基因，然后进行功能和机制研究（包括与GDNF/Ret的关联），明确Robo2基因变异导致多个输尿管芽和多个肾形成、输尿管发育异常以及肾小球数目减少的机制。

2．应用Cox2绿色荧光报告鼠和条件性Cox2基因敲除鼠，观察Cox2的时空表达特征，研究Cox2对GDNF/Ret等主控基因的影响，明确Cox2对肾脏皮质肾单位（肾小球、肾小管）发育成熟的影响及其分子机制。