流产绒毛细胞染色体分析规范流程

1 检验目的和方法

1.1 检验项目：流产绒毛细胞染色体制备及分析。

1.2 检验方法:培养瓶法，G显带

2 检验原理和检验目的

2.l 检验原理

绒毛细胞由受精卵发育分化的滋养层细胞及绒毛间质中的胚外中胚层细胞

组成,绒毛细胞和胎儿组织同源,通过绒毛检测，可客观反映胎儿情况。绒毛既

可以直接制片进行染色体观察,也可以经培养制备染色体，进行产前诊断。

2.2 检验目的

用于胚胎停止发育的染色体诊断，规范流产绒毛细胞染色体制备程序，获得足够的染色体核型进行分析，保证及时准确的发出报告。

3检验前程序

3.1 绒毛采集要求

3.1.1无菌条件子啊吸取流产绒毛组织少量放入无菌离心管内，加入适量无菌生理盐水保存样本。

3.1.2采集前核对患者姓名、性别、年龄以及离心管上的标签。

3.1.3严格执行各种操作技术常规及无菌技术，染色体标本采集、交接过程应防止污染。

3.2 拒收样本的规定

3.2.1接收标本时应注意核对装有绒毛无菌管上的患者是否一致，发现错误应及时拒收标本并与采集者取得联系。

3.2.2检查绒毛标本是否符合实验要求，所取组织是否为蜕膜等。不符合要求将标本退回，通知临床医生，并登记在《不合格标本登记本》。

3.2.3检查合格后，在产前诊断系统上记录。

3.3 让步标本的规定

3.3.1培养过程中发现的轻度污染；

3.3.2绒毛量少于5mg或未见典型绒毛组织等。

上述几种情况均视为让步条件，应先接收样本并接种，待标本处理完毕，确定是否能制备出足够多的能满足分析要求的核型再作进一步处理。若核型数量不足或质量不理想，应及时联系手术医师择期重新抽取样本并培养。

3.4 样本储存规定

3.4.1采集的样本应常温下及时运送至实验室进行接种。

3.4.2标本采集后应尽快接种培养。

3.4.3未能当天进行接种的样本应放于4℃冰箱中，保存时间不超过3天。

4 实验用品

酒精灯，烧杯，天平，离心机，CO2培养箱，载玻片，玻片盒，光学显微镜，灭菌注射器，离心管，吸管，量简，培养瓶，试剂瓶，染色缸，剪刀，镊子，手术刀，培养皿等

5 实验试剂

5.1 培养基：GBICO AmnioMAX-II COMPLETE 羊水培养基,BIO-AMF-2 羊水培养基。

0.4%柠檬酸钠，O.4%KCl 甲醇，冰乙酸，胰蛋白酶粉剂 (GBICO TRYPSIN 1∶

250)，3% Tris，磷酸缓冲液，1O% Giemsa染色液。

5.2 0.25% EDTA-胰酶。

5.3 秋水仙素:25mg秋水仙素粉加500ml生理盐水，高压灭菌，避光保存。

5.4 低渗液 O.4%KCl与O.4%柠檬酸钠按1:1比例制备

0.4%KCl:lOg KCL溶于2500ml蒸馏水，混匀，备用。

0.4%柠檬酸钠:10g柠檬酸钠溶于2500ml熬馏水，混匀，备用。

5.5 固定液：甲醇，冰乙酸以3:l混，每一份标本需40ml固定液。

5.6 PH7.4 磷酸盐缓冲盐（PBS)：(NaH2PO4 1.6g+ Na2HPO4 3.1g+蒸馏水1000ml）。

5.7 胰蛋白酶粉剂(AMRESCO TRYPSIN 1:250 1瓶放于-4℃储存)。

5.8 胰蛋白酶使用液(把10mg胰蛋白酶粉加入50ml生理盐水溶解，并加入0.5ml

3% Tris调节PH值至7.4，每次使用前制备)。

5.9 3%Tris：3g Tris粉剂,加蒸馏水100ml溶解。

5.10 10%吉姆萨染色使用液(5ml吉姆萨染色原液混合45ml PH7.4磷酸盐缓冲液，

每次使用前制备，并混匀)。

吉姆萨染色原液(2g吉姆萨染料磨碎，加60ml甘油磨成糊状，80℃烤箱放2小时，取出加60ml甲醇，混匀后放37℃培养箱备用)。

6 实验设备

37℃ CO2恒温箱，烤箱，水浴箱，离心机，光学显微镜等。

7 标准操作程序

7.l 接种

经低倍镜下鉴定为绒毛枝后，在灭菌一次性平皿中用手术刀片切成l-2mm 3小枝或小块，用20ml注射器移入25cm3培养瓶中，加入GBICO AmnioMAX-II complete 培养基5ml，使组织块泡在培养液中（共接种两瓶)，放入37℃ CO2恒温箱培养。

7.2 换液

37℃培养6-7天，观察贴壁情况，如贴壁情况好，第7天换液。换上GBICO AmnioMAX-II complete 培养基5ml或BIO-AMF-2培养基5ml，观察生长情况，若见上皮样或成纤维样细胞生长并生长良好即可收获。

7.3 收获

时间约第9-10天。每培养瓶加秋水仙素(50μg/ml)2-4滴，混匀后放回37℃CO2恒温箱培养2小时，2小时后进行处理。

倒出培养液至15ml离心管中，每瓶加1ml预温37℃的EDTA一胰酶，消化8-15分钟。

倒回培养液以中和胰酶的消化作用,吸管吹打细胞，镜下观察细胞脱落情况。如为脱落即延长消化时间,倒入离心管，离心2000转/分钟，5分钟，去上清。7.4 低渗

加入l:l的0.4% KCL:0.4% 柠檬酸钠2ml(各lml)(37℃水浴预温),低渗5分

钟(轻轻吹打细胞)。注:沉渣多可各加2ml,共4mI。

7.5 预固定和固定

加0.5ml固定液，弹匀,离心2000转/分钟,5分钟,去上清；加固定液8ml，静置10-20分钟(最好放于37℃水浴箱内)，离心20OO转/分钟,5分钟，去上清:加固

定液8ml，轻轻吹打3次后离心20OO转/分钟,5分钟。

7.6 滴片

去上清液,沉渣加入少量固定液(0.1-0.3ml)稀释，预温烤箱到80-90℃，将悬液均匀滴在冰水(三蒸水)浸泡过的玻片上，即放入烤箱烤2-3小时，（滴片完毕,将烤箱调到70-80℃),关烤箱。

7.7 显带

50ml生理盐水+10mg胰蛋白酶(3小匙+0.5m1 3%Tris调PH至7.4),水浴溶解,玻片浸入消化约5秒,用水冲干净,即放入染色液中。

7.8 染色

原液Giemsa 1 吸管+50ml PH7.0 磷酸缓冲液,染色5-10分钟(新配的染液,染色时间短些，放置较久的染液,染色时间需延长)，取出冲水用电吹风吹干。7.9 染色体分析

取制备好的坡片置光学显微镜下观察分析20个核型或更多，经显微摄像获取两个完整核型图像，上传结果及图像到产前诊断系统(GZPD)。

7.10 结果发放

经审核后发放报告。

8 方法的局限性

本检查为G显带320-400条带范围，不能排除微小染色体异常或基因突变所致的疾病。

9 注意事顼

9.l 在显微镜下鉴定绒毛枝以及严格无菌操作是培养成功的关键。

9.2 妊娠10周后平滑绒毛膜逐渐退化，仅留下叶状绒毛，逐渐发育成胎盘，故孕周稍大的流产绒毛或胚胎停止发育时间过久的标本不易于培养，有培养失败的可能。

9.3绒毛生长最适宜的PH为7.4，高于8.0和低于7.0均不适于人毛细胞生长。

9.4 对绒毛检查结果有异常应复查羊水或脐带血。

10 参考文献

10.1 《医学细胞遗传学实验室工作手册》2006.04；

10.2 《中华人民共和国卫生行业标准》2010.06.08。