细胞培养

一、复苏

1.把冻存管从液氮中取出来，立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动。液体都融化后(大概1-1.5分钟)，拿出来喷点酒精放到超净工作台里。

2.把上述细胞悬液吸到装10ml培养基的15ml的离心管中(用培养基把冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来)，1000转离心5分钟。

3.把上清液倒掉，加1ml培养基把细胞悬浮起来。吸到装有10ml培养基的10cm培养皿中前后左右轻轻摇动，使培养皿中的细胞均匀分布。

培养箱中培

4.标好细胞种类和日期、培养人名字等，放到37℃的5%CO

2

养，细胞贴壁后换培养基。

5.根据细胞增长速度2-3天换一次培养基。

二、传代

1.培养皿中的细胞覆盖率达到80%-90%时要传代。

2.把原有培养基吸掉。（倒掉后用PBS洗两到三次）

3.加适当的胰蛋白酶(能覆盖细胞就行)，消化1-2分钟。

4.细胞都变圆后加入等体积的含血清的培养基终止消化。

5.用移液枪吹打细胞，让细胞悬浮起来。

6.把细胞吸到10ml或15ml的离心管中，1000转离心5分钟。

7.倒掉上清液，加1-2ml培养基，把细胞都吹起来。

8.根据细胞种类把细胞传到几个培养皿中。一般，癌细胞分5个，正常细胞传3个。继续培养。

三、冻存

把细胞消化下来并离心(同上)。用配好的冻存液把细胞悬浮起来，分装到灭菌的冻存管中，静止几分钟，写明细胞种类，冻存日期。4℃30min，-

20℃30min，-80℃过夜，然后放到液氮灌中保存。

冻存液的配制：70%的完全培养基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加，边滴边摇。

注意事项：

1，把要用的所有东西放入超净台，喷酒精，紫外杀菌至少30min.

2，关紫外，通风，开灯，点燃酒精灯。

3，每一次进入超净台和培养箱都要喷酒精

4，传代时消化要加胰蛋白酶1mL左右。未消化的培养瓶是毛的，消化结束培养瓶是透明的。

5，打开瓶子和关上瓶子都要过酒精灯外焰，滴管也要。

6，消化终止后可倒掉一大部分，加入5mL培养基，继续培养，即完成传代。

7，贴壁的细胞长满后呈三角状？

培养基的配制：NBCS/DMEW(高糖培养基，培养肿瘤细胞)=15%~20%