壳聚糖作用过程关键节点之作用

Fig. (a) SEM image of an unmodified H2O2/NO/pH electrochemical sensing microbundle tip. (b) Photograph showing the working scenario of the electrochemicalmicrobundle
壳聚糖是一种生物激励剂，只有被细胞吸收并到达作为靶点才能发生效应，这一过程可
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以进行同位素标记示踪，如 3H- chitosan，方法：细胞悬浮培养，加入 3H- chitosan，在一定 作用时间间隔收获细胞，洗涤表面粘附的放射性，用液闪测定吸收率；进一步可以分离细胞 器，如叶绿体，细胞核等，分析 3H- chitosan 的结合比率及时间动态过程，也可以利用组织 切片，进行光学自显影或电镜自显影成像观察。也可使用特异的壳聚糖荧光探针，进行成像 观察。作用模型：聚焦壳聚糖带正电的氨基与质膜上带负电磷脂的作用。 研究线路
via lipid raft mediated endocytosis (Kale et al., 2010) as part of the pathogens’ virulence mechanism and trigger effector-triggered immunity (ETI).
名词解释 PAMPs，病原体分子相关模型 ；PAMP- triggered immunity (PTI)，模式触发免疫；Pattern
Figure . An overview of representative plant pattern recognition receptors (PRRs) and their involvement in eliciting plant defense. Surface PRRs may be RLKs, RLPs or extracellular PAMP-binding proteins. During pathogen attack, these PRRs recognize PAMPs and pathogen derived extracellular effectors and trigger PAMP-triggered immunity (PTI). Intracellular receptors include nucleotide-binding site leucin-rich repeats (NB-LRR) class of resistance (R) proteins. NB-LRR proteins possess a nucleotide-binding site (NBS), LRR domains and either a coiled-coil (CC) domain or a Toll and IL-1 receptor (TIR) domain. NB-LRR proteins recognize cytoplasmic effectors that are translocated to cytoplasm via the bacterial type III secretion system (TTSS) or
研究线路
受体定位 分布，性质测定：受体－配体分析，亲和分离受体定位，结合蛋白鉴定 ：
主要参考 1.Identification of chitosan oligosaccharides binding proteins from the Plasma membrane of wheat leaf cell 2.Isolation and Characterization of a Novel Chitosan-Binding Protein from Non-Heading Chinese Cabbage Leaves 3. Chitosan permeabilizes the plasma membrane and kills cells of Neurospora crassa in an energy dependent manner 3)信号传导
结构：DP，DA，PA测定：核磁，质谱，....效应：....
主要参考 1. Determination of the degree of N-acetylation for chitin and chitosan by various NMR spectroscopy techniques: A review 2. Chitosan Analysis by Enzymatic/Mass Spectrometric Fingerprinting and in Silico Predictive Modeling 3.Quantitative Mass-Spectrometric Sequencing of Chitosan Oligomers Revealing Cleavage Sites of Chitosan Hydrolases 组织层次
recognition receptor (PRR) ，模式识别受体；receptor-like kinases（RLKs）类受体激酶，receptor like proteins (RLPs)，类受体蛋白；effector- triggered immunity (ETI)，效应触发免疫；R proteins， 抗性蛋白；lysine motif(LysM)，赖氨酸基序；(LysM) receptor-like kinases (LYKs) ，类赖氨酸基 序受体激酶；chitin elicitor binding protein (CEBiP),几丁质诱导子结合蛋白；mitogen-activated protein kinase (MAPK or MPK) pathway ，丝裂原活化蛋白激酶（MAPK 或 MPK）途径；RLK genes ， 类受体蛋白激酶基因；
壳聚糖细胞层面作用过程模式见下图
Fig. . Model of chitosan responses at the cellular level. Chitosan binds to the plant cell membrane initiating a secondary messenger signal to the cell and generating hydrogenperoxide (H2O2) via the octadecanoid pathway and nitric oxide (NO) in the chloroplast. H2O2triggers both the reactive oxygen species scavenging system and the abscisicacid (ABA) synthesis pathway, while NO regulates phosphatidic acid (PA) synthesis via the phospholipase C (PLC) and diacylglycerol kinase (DGK) (PLC/DGK) pathways. PAenhances the ABA action by inhibiting ABI1 (the negative regulator of ABA). Then, ABA induces stomatal closure and other abiotic stress responses. H2O2coordinates theactivity with jasminic acid (JA), synthesized via the octadecanoid pathway, regulating the expression of biotic stress responsive genes (e.g., chitinase (CHI) or glucanase (GLU)). 主要参考 1. Biostimulant activity of chitosan in horticulture 2. Multiple effects of chitosan on plant systems: Solid science or hype 1) 吸收传导
在农业应用研究中，各种效应，如产量、防病和抗逆性效应均有农艺过程有关，因此壳 聚糖施用后的吸收、输运和定位以及代谢是研究的节点之一。研究方法可借鉴标记肥料示踪 研究。标记可考虑放射性同位素氚标，采用气爆法进行标记，但实验中有防护问题，须在许 可的同位素实验室进行；也可利用稳定性 13C 标记，用培养法或化学合成法标记，需要了解 有无现成的商业制剂；另外可考虑采用标签法标记，如 125I、18F 等，用以研究分子整体输运
过程，放射性标记可以进行组织成像观察。 研究线路
输运性质吸收，运输，定位示踪：３Ｈ，１３ Ｃ，１８ Ｆ－标记 效应：抗逆，抗病，农艺
主要参考 1.Detection of chlorine-labelled chitosan in Scots pine by energy-dispersive X-ray spectroscopy 细胞层次
壳聚糖作用过程关键节点之作用、效应和研究方法 齐孟文
中国农业大学 壳聚糖结构
壳聚糖效应取决于其结构，其基本结构特征有：
因糖骨架上的肿胺基在弱酸性介质带正电，可以与带负电的大分子直接相互作用，其效 应相关主要结构参数包括：单体聚合度 DP、乙酰化程度 DA 和乙酰化模式 PA。结构测定的 经典方法是核磁共振法，如乙酰化程度 DA 的测定，最新进展是利用酶解和质谱指纹组合技 术进行分析，并可采用同位素内标法进行定量。 研究线路
壳聚糖作为重要的生物刺激剂，主要通过次级信号分子一氧化氮（NO）、过氧化氢 （H2O2），单独或共同介导植物对生物和非生物应力进行响应，进而产生各种抗逆性反应， 如抗性相关基因转录、抗性酶激活和气孔调节等。为了进行作用效应机制研究，须对植物信 号分子一氧化氮（NO）、过氧化氢（H2O2）进行测量，由于信号分子的生存半衰期短，不 稳定，如一氧化氮在生物体内生产后很快就会被氧化，所以发展和选择适合的探测方法是一 个关键的问题。现在比较成熟实时监测方法有荧光检测法，该方法是将能够渗透的荧光分子 预先渗透到检测细胞中，然后利用其与检测物质反应产生的荧光进行检查，其荧光指示染料 分别为，4,5-二氨基荧光素二醋酸酯（4,5-diaminofluorescein diacetate ，DAF-2DA)和 2,7氨基胍二醋酸酯(2,7-dichloroluorescindiacetate ，H2DC-DA)。但是这也只是一种间接测量 法，目前尚缺少直接的、活体的、特异和灵敏的检测方法，随着探测界面接口的改进和质谱 的小型化发展，基于质谱的测量将是一个发展方向。
目的：细胞吸收，定位方法：放射性示踪，免疫检测，荧光探针结果：吸收，分布
主要参考 1.Localization of Fungal Components in the Pea-Fusarium Interaction Detected Immunochemically with Anti-chitosan and Anti-fungal Cell Wall Antisera 2）作用模式
壳聚糖作为作为病原物相关分子模式（MAMPs），必然通过细胞表面模式识别受体结合， 进而引发后续的免疫应答反应，受体的位点和性质，如受体的密度、亲和力等可以用放射性 受体-配体分析法进行分析，除此而外在细胞表面的结合情况也可以用荧光标记的壳聚糖， 如 2-氨基吖啶酮标记进行荧光共聚焦显微观察，结合蛋白可用壳聚糖亲和色谱钓出来，如 COS-Agarose-4FF 柱层析，收集物进一步常用的蛋白质组学的方法进行鉴定。 植物模式识别受体及其防御反应模型