叶绿、类胡萝卜素测定
植物叶绿素类胡萝卜素测定方法
叶绿素、类胡萝卜素含量的测定一、原理根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收,利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度,即可用公式计算出提取液中各色素的含量;根据朗伯—比尔定律,某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C 和液层厚度L成正比,即A＝αCL式中：α比例常数;当溶液浓度以百分浓度为单位,液层厚度为1cm 时,α为该物质的吸光系数;各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得;如果溶液中有数种吸光物质,则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和;这就是吸光度的加和性;今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量,只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A,并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度;在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰,所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰;二、材料、仪器设备及试剂一材料：新鲜或烘干的植物叶片;二仪器设备：1分光光度计；2电子顶载天平感量；3研钵；4棕色容量瓶； 5小漏斗；6定量滤纸；7吸水纸； 8擦境纸；9滴管;三试剂：195%乙醇或80%丙酮v丙酮：v乙醇=2：1的95%水溶液；2石英砂；3碳酸钙粉; 暗中2h,,25ml三、实验步骤1取新鲜植物叶片或其它绿色组织或干材料,擦净组织表面污物,剪碎去掉中脉,混匀;2将取好的样品放入25ml容量瓶中,加混合浸提液无水乙醇:丙酮=5:520ml,放在黑暗条件下,浸泡至叶片发白,用浸提试剂定容至25ml,摇匀备用;3把叶绿体色素提取液倒入1cm光径的比色皿内,以浸提试剂为空白测定吸光度;选择波长663 646 和470nm;四、实验结果计算叶绿素a 的浓度 = OD 633 – OD 646叶绿素b 的浓度 = OD 646– OD 663类胡萝卜素浓度=÷229 单位 mg/L Cmg/L 提取液总量ml叶绿体色素含量mg/g= ____________________________ 烟叶重量g1000注意事项：操作避光研磨时间短些。
叶绿体色素的提取与分离、理化性质及含量测定 3
叶绿体色素提取分离与理化性质及含量测定▪（一）实验目的及意义▪（二）实验原理▪（三）实验步骤▪（四）实验报告实验目的和意义▪绿色植物的光合作用是在叶绿体中的叶绿体色素中进行的，了解叶绿体色素的组成、性质及测定对于理解光合作用的本质很有帮助。
▪因此，测定叶绿素含量便成为研究光合作用与氮代谢必不可少的手段，在作物育种、科学施肥、看叶诊断中有着广泛的应用叶绿体在细胞中运动视频叶绿体在细胞中的分布与结构类囊体膜的结构及功能实验原理植物叶绿体色素是吸收太阳光能，进行光合作用的重要物质。
它一般由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。
这些色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。
实验原理▪色素分离的方法有多种，纸层析是最简便的一种。
当溶剂（有机推动剂）不断从纸上流过时，由于混合物（叶绿素提取液）中各种成分在固定相（滤纸纤维素所吸附的水分）和流动相（有机推动剂）间具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后，可将各种色素分开。
▪叶绿素是一种二羧酸——叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成醇（甲醇和叶绿醇）和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开。
实验原理▪叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，表现出一定的吸收光谱，可用分光光度计精确测定。
叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。
叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。
▪叶绿素中的镁可以被氢离子所取代而成褐色的去镁叶绿素。
去镁叶绿素遇铜则成为铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。
实验步骤(1)▪根据朗伯一比尔定律，某有色溶液的吸光度D与其中溶液浓度C和液层厚度L成正比，即：▪D＝KCL▪D：吸光度，即吸收光的量，C：溶液浓度, K：为比吸收系数（吸光系数），L：液层厚度，通常为1cm.▪如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和，这就是吸光度的加和性。
化学科技活动一则—分光光度法测定叶片叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量
化学科技活动一则—分光光度法测定叶片叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量44化学教学2002年,第8期化学科技活动一则分光光度法测定叶片叶绿素a,叶绿素b和类胡萝卜素含量杨敏文(浙江台州卫生学校,浙江临海317000)摘要:本文介绍了一则综合化学和生物知识的学生科技活动,通过测定植物叶片中叶绿素和类胡萝素含量,分析它们与植物生长状况的关系,培养学生科学素养.关键词:叶绿素;类胡萝卜素;含量测定;分光光度法文章编号:1005—6629(2002)08—0044—02中图分类号:G633.8文献标识码:C光合作用是植物所特有的生理功能,是地球上最大规模地将太阳能转换为化学能,并利用它把c0'和H20等无机物合成为有机物同时放出0的过程,是"地球上最重要的化学反应".光合作用为人类,动植物及微生物的生命活动提供了有机物,()'和能量.太阳能是通过光合色素来吸收的,光合色素存在于叶绿体中.高等植物叶绿体中所含的光合色素包括叶绿素(主要有叶绿素a和叶绿素b)和类胡萝卜素(包括胡萝卜素和叶黄素).叶绿素由卟啉环和叶醇组成,卟啉环的中央有一个镁原子,叶绿素a的分子式为c55H.7205N4Mg,叶绿素b的分子式为C55HTo06N4Mg.胡萝卜素是一种不饱和碳氢化合物,分子式为c柏,叶黄素是胡萝卜素含氧的衍生物,分子式为c柏H5602.各种植物叶片中叶绿素和类胡萝卜素都可溶于丙酮,乙醇,石油醚,四氯化碳等溶剂.叶绿素是植物吸收光能的主要色素,类胡萝卜素在光合作用中的作用是辅助性质的,它们吸收的光能只有传递给叶绿素之后才能在光合作用中发挥作用.叶片中光合色素含量不同,会影响植物光合效率,还引起叶片颜色的变化.叶绿素a呈蓝绿色,叶绿素b是黄绿色,一般情况下类胡萝卜素的颜色被叶绿素所掩盖,在秋天叶绿素分解时才呈现出来,由于叶片所含叶绿素和类胡萝卜素的比例不同,所以秋季是植物叶片颜色多样的季节. 在学生科技活动中进行植物活体叶片叶绿素和类胡萝卜素含量的测定,可以激发他们探索大自然奥秘的兴趣,培养综合利用多学科知识分析问题和解决问题的能力,增强学习的积极性,主动性和实际动手能力,体现素质教育的特点.1原理叶绿素和类胡萝卜素在90%丙酮提取液中的最大吸收峰波长不同,可以用分光光度法在提取液中分别测出叶绿素a(最大吸收波长为662nm),叶绿素b(最大吸收波长为644nm)和类胡萝卜素(最大吸收波长为44oI硼)的吸光度值A.利用下式进行浓度计算…:叶绿素a浓度(mg/L):C=9.78×A662—0.99×A644(1)叶绿素b浓度(mg/L):Cb=21.43×A644—4.65×A662(2)叶绿素总浓度(mg/L):C+b=C+Cb=5.13xA662—2O.44xA644(3)类胡萝卜素浓度(mg/L):Ck=4.7×A440一o.27×C+b=4.7×A440一(1.38×A662+5.48×A644)(4)2材料和方法在9月中旬取5组叶片(每组5—7片叶片),分别为樟树(Cinnmomumcamphora)嫩叶(淡绿色),樟树功能叶(深绿色),樟树老叶(红色),珊瑚树(Viburnumodoratissimum)功能叶和七子花(Heptacodi. ummiconioide5)功能叶(也可选取其它植物的叶片), 各组叶片用不锈钢剪刀剪成4左右的碎片,混匀,用分析天平准确称取0.5g左右,分别放入50mL锥形瓶中,加20mL蒸馏水,少量CaCO3粉末(防止脱镁), 用高速电动匀浆机制成匀浆,定容至25mL,准确量取2.5mL,加入到50mL的试剂瓶中,再加入22.5mL无水丙酮,加塞,暗中提取光合色素30min,滤纸过滤,取滤液,即为90%丙酮光合色素提取液.90%丙酮提取液中叶绿素a,叶绿素b和类胡萝卜素浓度的测定:用90%丙酮作空白,用7200可见分光光度计测定提取液在440nm,644nm和662nm处的吸光度值(A),代人公式(1)～(4)计算提取液中叶绿素a,叶绿素b和类胡萝卜素的浓度.叶片中光合色素含量的计算:以下式分别计算叶片中叶绿素a,叶绿素b和类胡萝卜素的含量(mg/g鲜重).X=25×10一×C×100.25×C式中:一叶片中某种光合色素含量(mg/g)c一提取液中某种光合色素浓度(me/1)(5)2002年,第8期科技活动45一分析样品的鲜重(g)3结果与讨论测得各种叶片中叶绿素a,叶绿素b,总叶绿素和类胡萝卜素的含量,结果见表1.从中可以看出, 樟树不同叶龄叶片光合色素含量不同,功能叶类胡萝卜素含量较高,嫩叶和老叶类胡萝卜素含量较低. 嫩叶叶绿素含量低,颜色浅(淡绿色),功能叶叶绿素含量较高,颜色较深(深绿色),而老叶叶绿素大量分解,含量很低,含量相对较高(与叶绿素相比)的类胡萝卜素使得叶片变红.叶片中叶绿素稳定性比类胡萝卜素差,容易受环境条件和植物本身生理状况的影响而发生变化.同是功能叶的光合色素含量,在不同树种中是不同的,这是由植物的遗传特性所决定,还与植物生存的环境有关.光合色素的功能是吸收光能,为植物的光合作用提供能量.植物叶片叶绿素含量与光合速率,营养状况等密切相关,实践上常测定叶绿素含量以表征植物生长状况,也往往把叶色变化作为看苗诊断和肥水管理的重要指标. 表1不同类型叶片光合色素含量光合色素含量(mg/g鲜重)叶片类型叶绿素a叶绿素b总叶绿素类胡萝索樟树嫩叶O.55O.370.92O.2O樟树功能叶O.830.401.23O.3l樟树老叶O.O9O.13O.22O.22珊瑚树功能叶1.O50.471.520.46七子花功能叶O.65O.290.940.23参考文献:[1]x.H.波钦诺克.植物生物化学分析方法.北京:科学出版社,1981.255～258.用淀粉厂的废酸液制取乳酸的研究樊正林(保定师专化学系,河北保定071051)文章编号:1005—6629(2002)08—0045一O1中图分类号:X78文献标识码:B 乳酸的生产,传统的方法是采用淀粉,牛乳等为原料,用乳酸菌发酵而制取.本文的生产方法是利用淀粉厂的废酸液制取.具体的实验方法介绍如下:1实验原理淀粉厂用以沉淀分离淀粉的酸浆液,是用淀粉质原料经戴氏乳酸杆菌在一定的条件下发酵而成的.C6HO2cCHOHCOOH葡萄话'乳酸淀粉生产中,将制取的乳酸液加入淀粉乳中沉淀淀粉时,乳酸溶液被稀释,酸度降低.然而,在沉淀过程中,乳酸继续因发酵而生成,酸度逐渐升高,随之淀粉被沉淀.当本批淀粉沉淀完毕,少量酸液被用于下一批淀粉沉淀之用,而大量的乳酸液被排放.本文制取乳酸的工艺途径,就是取用这些被排放的乳酸液,经加入碳酸钙,使之生成乳酸钙,然后将乳酸钙酸化,制成乳酸.2实验步骤及操作2.1乳酸钙的制取量取废酸液1000毫升,过滤去掉杂质.在溶液中加入10克湿淀粉,充分搅拌,在45～50℃恒温,继续发酵.当溶液pH=4时,加入粉末碳酸钙.多次搅拌,继续在45～50%恒温,使陆续生成的乳酸跟碳酸钙逐渐反应生成乳酸钙.2CH3CHOHCOOH+CaC03——(cn3CHOHCOO)zCa+H20+COz反应约进行24小时,过滤得乳酸钙溶液.2.2净化处理在乳酸钙溶液中滴加10%的氢氧化钙溶液,调节溶液的pH=8～10,煮沸,加入活性炭O.5克,滤去杂质.2.3结晶把净化后的乳酸钙溶液加热浓缩,当有晶体析出时,停止加热,水浴冷却,即有大量晶体析出.用布氏漏斗抽滤,收取晶体,母液重新去浓缩.2.4酸化在乳酸钙中加入4mol硫酸3O毫升,搅拌,使晶体完全溶解,再向溶液中滴加10%氢氧化钡,直至无白色沉淀出现为止.滤去沉淀.2.5蒸馏将滤液蒸馏,收集120～123%馏分即得乳酸,为无色稠厚液体,称重为l1.8克,经测定纯度为98.6%. 3问题与讨论(1)本文中恒温45～50%,是戴氏(下转41页)。
植物生理学实验-叶绿体色素的定量测定
植物生理学实验
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2、测定光密度
以96%乙醇为空白，比色测定3份样品的光密度；
波长665nm、649nm和470nm
B126室：分光光度计 型号：22PC
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分光光度计的使用：？
功能键
显示屏
样品室
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波长调节旋钮
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测定溶液加到 比色杯的2/3初
空白对准光路
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植物生理学实验
叶绿体色素在不同溶剂中的吸收光 谱有差异。在使用不同溶剂提取色素时， 计算公式有所不同。
本实验以 96％乙醇为例。
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96％乙醇提取
已知叶绿素a、b的96%乙醇提取液在红光 区的最大吸收峰：a＝665nm；b＝649nm
根据有色物质的加和性，建立方程组： D665=Kaλ665 Ca+ Kbλ665 Cb D649=Kaλ649 Ca+ Kbλ649 Cb
Ka645＝ 16.75 Kb645＝ 45.60
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植物生理学实验
根据加和性原则列出以下关系式： D663 = 82.04Ca+9.27Cb D645 = 16.75Ca+45.60Cb
解方程组得：
Ca (mg/L)= 12.72D663 – 2.59D645 Cb (mg/L)= 22.88D645 – 4.67D663 Ca与Cb相加即得叶绿素总量（CT）： CT (mg/L)= Ca + C整b理课=件20.29D645 + 8.05D663
Enter 输入键，接受当前的状 态或进行测定；
Mode 功能键，按该键显示不 同的功能菜单；
2、测定
叶绿体色素的提取、分离及定量测定
叶绿体色素的提取、分离及定量测定一、实验结果1、 滤纸带纸层析：2、 圆形滤纸层析：3、 叶绿素a 、b 含量的测定Ca=12.7A663—2.69A645 Cb=22.9A645—4.68A663推动剂边缘 胡萝卜素 叶黄素叶绿素a （蓝绿色）叶绿素b （黄绿色） 叶绿素b （黄绿色）叶绿素a （蓝绿色）叶黄素胡萝卜素推动剂边缘次数组数Ca=31.35（稀释后数据计算）Cb=15.04（稀释后数据计算）二、问题思考1、大部分植物依靠光合作用合成自身生长繁殖所需的有机物。
光合作用所需色素主要有类胡萝卜素和叶绿素。
其中直接参与光合的是叶绿素a，中心色素，其余为天线色素。
2、叶绿素为双羧酸的酯，一个羧基被甲醇酯化，另一个羧基被叶绿醇酯化。
不溶于水而溶于有机溶剂如酒精、丙酮、石油醚。
叶绿素a为蓝绿色，叶绿素b为黄绿色。
结构的基本特点为拥有一个卟啉环头部及一条叶醇链尾部。
其卟啉环头部由四个甲烯基和四个吡咯环连接而成，大环中央有一个镁原子和四个氮原子结合。
镁原子带正电荷，相连的氮原子偏于带负电荷，因此卟啉环呈极性亲水，可以与蛋白质结合。
尾部叶醇基具有疏水性，为脂溶性物质。
叶绿素a、b结构基本相同，以-CHO代替CH3即为叶绿素b。
叶绿素吸收光谱3、纸层析可行原因：a、色素可提取b、色素可以溶解于某些溶剂中c、不同类型色素在同一溶剂中溶解度不同d、色素分子不会吸附滤纸纤维上e、色素分子可以在体外条件下稳定存在4、本次实验叶绿素a、b含量比值偏低，说明实验有误差。
而由于叶绿素a含有醛基，易于被氧化，亦可导致a的含量下降。
同时由于实验在11月末进行，植物中叶绿素含量下降，a，b的比值可能会受影响。
5、实验注意事项：a、叶片要选取绿色较深的部位，去除叶脉；b、尽量先剪碎，便于之后的研磨；c、研磨前加入二氧化硅和碳酸钠，注意用量。
量少研磨不充分，叶绿素会被液泡中的有机酸破坏；量大不易过滤完全且会使色素层析时颜色变淡；d、过滤时所用棉花不可过多，否则滤液完全被棉花吸收。
叶绿体色素的提取、分离、定量及理化性质的鉴定
实验日期：2011.9.28叶绿体色素的提取、分离、定量及理化性质的鉴定1、实验原理叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要由叶绿素a 、叶绿素b 、胡萝卜素和叶黄素组成。
它们与类囊体膜相结合成为色素蛋白复合体。
1. 叶绿体色素的结构与分离叶绿素a为蓝黑色固体，在乙醇溶液中呈蓝绿色；叶绿素b为暗绿色，其乙醇溶液呈黄绿色。
Chla与Chlb是吡咯衍生物与镁的络合物，它们很相似，不同之处仅在于Chla第二个吡咯环上的一个甲基(-CH3)被醛基(-CHO)所取代即Chlb。
Chla与Chlb 是植物进行光合作用必需的催化剂，易溶于石油醚等非极性溶剂中。
通常植物中叶绿素a的含量是叶绿素b的三倍。
其结构式如下：类胡萝卜素是一种橙色的天然色素，属于四萜，为一长链共轭多烯，有α、β、γ三种异构体，其中β异构体含量最多。
β-胡萝卜素(R=H)和叶黄素(R=OH)叶黄素是一种黄色色素，与叶绿素同存在于植物体内，是胡萝卜素的羟基衍生物，较易溶于乙醇，在石油醚中溶解度较小。
秋天，高等植物的叶绿素被破坏后，叶黄素的颜色就显示出来。
叶绿素与类胡萝卜素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。
提取液可用色谱分析的原理加以分离。
因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各种成分在两相（固定相和流动相）间具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后，可将各种色素分开。
2. 叶绿体色素的物理性质叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，表现出一定的吸收光谱，可用分光光度计精确测定。
叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它从第一单线态返回基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。
因为分子吸收的光能有一部分消耗于分子内部的振动上，发射的荧光的波长总是比被吸收光的波长要长。
3. 叶绿体色素的化学性质叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。
类胡萝卜素检测
类胡萝卜素是广泛分布在生物中的一种光辅助合成类色素，属于脂溶性化合物，种类繁多，
迄今为止已确定结构的就有600多种，如虾青素、玉米黄素、番茄红素、β-胡萝卜素、叶黄
素等都是重要类胡萝卜素。
类胡萝卜素的提取方法：
（1）有机溶剂提取法：利用丙酮、乙醇、甲醇等有机溶剂提取，常用于科学研究中生物样
本类胡萝卜素的提取，目前乙醇是最安全的提取溶剂。
（2）植物油提取法：能较好的保持生物中类胡萝卜素的天然性，常用于海洋生物中类胡萝
卜素的提取。
（3）超临界二氧化碳提取法：能保持类胡萝卜素天然性的同时提取率能达到99%以上，是
一种新的提取技术，能解决有机溶剂提取的局限性。
注：类胡萝卜素遇光和氧容易分解，建议整个实验过程在黄色弱光中进行。
类胡萝卜素检测方法
类胡萝卜素检测方法有紫外分光光度法、薄层色谱法、超临界流体色谱法、高效液相色谱法（HPLC）和液质联用法（LC-MS）。
这些方法各有特点，紫外分光光度法对仪器要求不高，成本较低，但由于干扰因素多，无法准确对类胡萝卜素进行定性定量。
薄层色谱法虽然对仪
器要求也不高，但精密度差、检测时间长。
超临界流体色谱法由于对设备要求高，无法普及。
迪信泰检测平台基于高效液相色谱（HPLC）和液质联用（LC-MS）两种设备，建立了一套
完善的类胡萝卜素检测体系，本方法简单高效、适用范围广、准确性高，能快速检测不同样
本中多种类胡萝卜素含量。
注：类胡萝卜素标准溶液HPLC色谱图
迪信泰生物检测【biotech-pack-analytical】。
叶绿体色素定量测定及性质实验报告-叶绿素的定量测定
.取两支试管，向一支试管中加入 5mL 叶绿体色素提取液，然后将其 存在的问题，改进栽培方式，提高产量，这对于农业生产有很大的现实意
一部分倒入另一支试管中，作为对比。向试管里加入 1~2 滴 0.5mol/L HCl 义；在水体治理中，通过测定叶绿素含量，了解水中植物的光合能力，借
后摇匀。
此查找治理方案。总之，测定植物叶片叶绿素含量对于我们生产实践具有
光物质〔稀溶液〕时，其吸光值与吸光物质的浓度 C 及汲取层厚度 d 成正
式中，C、Cb 和 Cx·c 分别为叶绿素、b 和类胡萝卜素的浓度。
比，及=KCd。
2、叶绿素理化性质鉴定
假如溶液中含有数种吸光物质，则混合液在某一波长下的总吸光值等
叶绿素是一种双羧酸，其中一个羧基被甲醇所酯化，另一个被叶醇所
于各组分在此波长下吸光值的总和。如欲测定叶绿素混合提取液中叶绿素、 酯化。故可与碱起皂化反应而生成醇〔甲醇和叶绿醇〕和叶绿素的盐。皂
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叶绿体色素定量测定及性质实验报告:叶绿素的定量 测定
应选择叶绿素在红光区的最大汲取峰。 已知叶绿素、b 分别 663nm 和 645nm〔80％丙酮提取〕有最大汲取值；
同时已知在波长 663nm 下，叶绿素、b 汲取系数分别为 82.04 和 9.27；在
4、在分管光度计上，分别测定 663nm，645nm 和 470nm 处的吸光值，
夹，酒精灯。
以 80％丙酮为空白对比。
2、试验试剂：80％丙酮，纯丙酮，碳酸钙，20％KOH 甲醇溶液，苯，
5、结果计算
0.5molmol/L?HCl，醋酸铜粉末。
按原理中的公式分别计算叶绿素、b 和类胡萝卜素的浓度〔mg/L〕，
叶绿体色素相关实验
叶绿体色素相关实验陈欣宇2018030034 同组成员：付仁奎一、叶绿体色素的提取与分离1.实验目的提取出绿叶叶绿体中的色素并分离检验其中不同种类的色素。
2.实验原理I.叶绿体色素分绿色素（叶绿素a、b）和黄色素（胡萝卜素、叶黄素）两大类，均不溶于水、易溶于有机溶剂（乙醇、丙酮等）。
II.将一定比例的有机溶剂配成展开剂，不同种类的色素在展开剂中的溶解度存在差异；选取适宜材料做固体吸附剂，吸附剂对不同色素的吸附力存在差异。
两方面作用使色素随展开剂在吸附剂制成的层析装置中扩散时移动速度不同，从而分离得到不同的可识别的色谱带。
3.实验材料和用品1）实验材料：菠菜叶2）仪器、用具：剪刀、研钵、漏斗、滤纸、玻璃棒、三角瓶、试管、薄层色谱硅胶预制板、点样毛细管、层析缸、铅笔、刻度尺3）试剂：95%乙醇，碳酸钙粉、展开剂（体积比石油醚：丙酮：苯=7:5:1）4.实验步骤I.提取：1）剪碎若干片新鲜菠菜叶入研钵中，加入适量碳酸钙粉与95%乙醇，快速研磨至糊状。
2）安装好滤纸、漏斗、三角瓶，将滤纸用95%乙醇润湿，将研钵中的糊状物倒入漏斗中，反复向滤渣中加入95%乙醇，直至滤渣绿色完全褪去，三角瓶中得到叶绿体色素提取液。
II.分离：1）在薄层色谱硅胶预制板的一端靠边缘适当距离上用铅笔画一条直线（距离至少应大于层析缸中展开液的深度）。
用毛细吸管吸取色素提取液延细线点样，点样要尽量细且直。
待点样自然风干后重复5次左右。
2）待点样风干（乙醇挥发尽）后将薄层色谱硅胶预制板迅速插入层析缸中的展开剂中，随后盖上缸盖，观察到色素随展开液在预制板上向上扩散并逐渐分开。
3）待展开剂前沿接近预制板顶端时将其拿出，立即用铅笔描出展开剂前沿和各色素带的位置，测量每条色素带扩散的距离，并计算相对比移值（Rf=色素扩散的距离/展开剂扩散的距离），通过色素带的颜色特征和相对比移值识别各条色素带色素的种类。
（对同一展开剂，每种色素拥有一特定的相对比移值，可作为识别色素的特征值）5.实验结果展开剂前沿 胡萝卜素 去镁叶绿素a叶绿素b 叶绿素a 新黄质 紫黄质 叶黄素 1）在展开剂前沿扩散到接近预制板的顶端时，预制板上各色素已经分离、形成7条可见的色素带，其情况如下图。
《植物生理学实验》实验03 叶绿素含量的测定
类胡萝卜素→吸收兰紫 光，不吸收红光等长波 长的光 叶绿素→吸收红光、兰 紫光
645nm
在测定叶绿素a、叶绿素 b时，为了排除类胡萝卜 素的干扰，所用单色光 的波长选择叶绿素在红 光区的最大吸收峰。
• 如果我们在645nm或663处用分光光度计检测得到溶液OD值（测量 数据，已知数据），根据吸光度的加和性，我们可得到 OD663= OD663叶绿素a + OD663叶绿素b OD645= OD645叶绿素a + OD645叶绿素b
• 代入公式OD = K × L × C OD663= K663叶绿素a × L×C叶绿素a + K663叶绿素b × L × C叶绿素b OD645= K645叶绿素a × L×C叶绿素a + K645叶绿素b × L × C叶绿素b
叶绿素a和叶绿素b的
波长 （nm）
80%丙酮溶液，当浓度在
663
色素的提取
取新鲜叶片，剪去粗大的叶脉并剪成碎块→ →称取0.5g放入研钵中→ →加纯 丙酮5mL，少许碳酸钙和石英砂，研磨成匀浆→ →再加80％丙酮5mL → →将 匀浆转入离心管→ →用适量80%丙酮洗涤研钵，一并转入离心管→ →离心后 弃沉淀→ →上清液用80％丙酮定容至20mL
测定吸光值
• 代入K值， 1g/L时，比吸收系数k值
645
叶绿素a 82.04 16.75
OD663= 82.04 × L×C叶绿素a + 9.27× L × C叶绿素b OD645= 16.75× L×C叶绿素a + 45.6× L × C叶绿素b
K值 叶绿素b 9.27 45.60
• 代入L值，比色杯的厚度为1cm OD663= 82.04×C叶绿素a + 9.27 × C叶绿素b OD645= 16.75×C叶绿素a + 45.6 × C叶绿素b
高效液相色谱法同时测定叶绿素和类胡萝卜素
高效液相色谱法同时测定叶绿素和类胡萝卜素一、实验目的1、了解高效液相色谱在叶绿体色素全分析的应用。
2、掌握生物样品的高效液相色谱实验技术。
3、初步掌握梯度洗脱实验技术。
二、测定意义植物光合色素的分析方法有许多种,经典的方法有纸层析和薄层层析,薄层层析又根据吸附剂不同而分成几种类型。
吸附剂的类型有:硅胶、硅藻土、糖类、纤维素和聚酰胺等。
层析后的各个色素斑点剪下并用相应的溶剂溶解后测定其吸收光谱,对照文献资料再确定色素的种类。
上述方法较简便,但准确性不高。
近几年随着高效液相色谱技术的发展,有人已将它应用于植物色素的分析中。
从植物提取液分离出来的叶绿素和胡萝卜素已发现有多种异构体，而且常常是同时存在的。
因此对叶绿素和胡萝卜素的深入研究较为困难。
高效液相色谱既能对单一组分进行定量，又能对混合物中的多组分在分离的基础上进行定量。
既能用于主要成分的含量测定，又能用于微量和痕量组分的测定。
高效液相色谱是一种准确度好和精密度高的分析技术。
因此，尽管难以得到所有的植物色素标准品，但高效液相色谱技术仍被认为是研究叶绿素和胡萝卜素的一种最有效手段。
三、基本原理叶绿体色素提取液可以采用正相或反相高效液相色谱法分析，实验表明，反相高效液相色谱法更加方便。
但由于色素提取液各组分的极性差别较大，等度洗脱可能使某些组分的分离不够完全。
因此，对植物色素提取液的全分析应采用梯度洗脱方式以改善分离和缩短分析时间。
本实验采用高效液相色谱法可对绿色植物叶片提取液中的色素进行较全面的分离，并直接测定叶绿素a、叶绿素b和β-胡萝卜素的含量。
四、仪器与试剂1. 岛津LC-20 高效液相色谱仪，色谱工作站，微量进样器（100 μl），Hypersil BDS C18( 4.0mm×200 mm，5μm)。
2. 叶绿素a、叶绿素b和β-胡萝卜素纯品为Sigma公司产品，甲醇、二氯甲烷和乙腈为液相色谱淋洗剂，实验用水为二次去离子水（娃哈哈纯净水），经玻璃系统重蒸馏。
叶绿体色素的提取实验报告
叶绿体色素的提取、分离、定量及理化性质的鉴定生命科学学院09生科基朱文杰实验目的：掌握提取和分离叶绿体色素的方法；掌握测定叶绿体色素含量的方法；熟悉叶绿体色素的理化性质及吸光特性；了解植物叶绿体色素组成及其与生境的相关性。
实验原理：叶绿体色素是吸收光能的重要物质，包括叶绿素和类胡萝卜。
利用不同色素的极性不同可以用色谱分离法将其分离。
不同的色素对光的吸收范围不同，因此我们也可以测量不同色素在不同波长光下的吸光值，即可用公式计算出其中各色素的含量。
光对叶绿体色素有破坏作用，将叶绿体色素暴露于强光下，可以发现叶绿素被破坏，溶液颜色变化。
叶绿体色素分子吸收光后变为激发态，如能量不被光合作用利用，激发态变回到基态，放出波长较长的红光。
叶绿素分子中卟啉环上的Mg处于不稳定的状态，可被H、Cu、Zn离子取代。
叶绿素不溶于水，能溶于有机溶剂，且各色素的脂溶性不同，故可利用乙醇或丙酮提取，用不同的有机溶剂萃取或用色谱法进行分离。
实验步骤：分别选取2g左右新鲜菠菜和0.2g左右玉米幼株的叶片剪碎放入研钵中。
在研钵中加入5ml丙酮以及少量的石英砂和氯化钙，充分研磨至无纤维装组织。
过滤并转移动至量筒中，再用3ml丙酮冲洗研钵，最后加入丙酮定容至10ml 作为备用提取液。
实验一：吸光值测定：取0.1 ml色素提取液，用80％丙酮稀释到3 ml ，测定663、645 nm 处的吸光值，根据公式计算叶绿素a、叶绿素b的含量。
Chla（μg /ml）=12.7 OD663－2.69OD645，Chlb（μg /ml）=22.9 OD645－4.68 OD663。
实验二：光破坏：取少量色素提取液并稀释3到5倍，分为2份，一份至于暗处，一份正对观察透射光，反身观察反射光，最后放在培养箱中的强光下放置2H。
实验三：铜带反应：取少量色素提取液少许于试管中，一滴一滴加浓盐酸，直至溶液颜色出现褐绿色。
然后加醋酸铜晶体少许，慢慢用水浴加热溶液，则又产生鲜亮的绿色。
叶绿体色素的提取和理化性质的鉴定 实验报告
实验报告实验名称：叶绿体色素的提取、分离及其理化性质日期：2011年11月2日小组成员：——（2010******）——（2010******）专业：生物科学生物科学与生物技术班级：************摘要本实验对叶绿体中的色素进行了提取、分离和理化性质的鉴定。
实验采用纸层析法进行分离，并从叶绿体色素的荧光现象、皂化作用、Mg2+的取代以及色素光谱对其理化性质进行了鉴定。
一、实验目的1.以植物叶片组织为材料,提取叶绿体色素;2.以纸层析法分离其成分;3.鉴定叶绿体色素的理化性质。
二、实验原理1.提取: 叶绿体中含有叶绿素(叶绿素a与b)和类胡萝卜素(胡萝卜素和叶黄素)，这两类色素均不溶于水，而溶于有机溶剂，故常用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。
2.分离: 当溶剂沿支持物不断向前推进时，由于叶绿体中不同色素分子结构不同，在两相(流动相与固定相)间具有不同的分配系数，因此它们移动速率不同。
对叶绿体色素进行层析可将不同色素分离。
3.理化性质的观察: 叶绿素是一种二羧酸酯，在碱作用下，发生皂化反应；在弱酸作用下，叶绿素中镁可被氢原子取代而成为褐色的去镁叶绿素，后者遇铜则成为绿色的铜代叶绿素，叶绿素具有荧光，故从与入射光相垂直的方向观察叶绿素溶液呈血红色。
叶绿素的化学性质不稳定，易受强光氧化，特别是当叶绿素与蛋白质分离后，破坏更快。
三、实验材料及用具1.材料：菠菜；2.用具：天平、研钵、三角漏斗、滤纸、层析缸、毛细管、分光镜、量筒、烧杯、试管等；3.试剂：丙酮、碳酸钙、层析液（石油醚：丙酮=25：3），20%KOH-甲醇、乙醚、1%HCl、醋酸铜。
四、实验步骤1.叶绿体色素的提取1)取新鲜菠菜叶片2克,擦干,去中脉,剪碎放入研钵；2)加入少许石英砂和CaCO3，再加入无水丙酮10ml，研磨成匀浆，再加丙酮15ml；3)用漏斗滤去残渣,得叶绿体色素提取液(置于暗处)。
2.纸层析分离叶绿体色素1)层析样纸制备：将优质滤纸剪成3cm×9cm的长条，将一端剪成中央留约1cm×0.5cm的窄条；2)点样：用细玻璃棒蘸取叶绿体色素提取液点于层析纸的窄条上端中央部，晾干后在原处重复点样7-8次；3)展层：在层析缸中加入3-5ml层析推动液，然后将已点样的层析纸插入缸的側壁槽内，调节纸条使窄条1/2部分浸入推动液中，盖好盖子，于阴暗处展层约10min，即可在层析纸上分辨出4种不同的清楚色层。
烟叶中叶绿素和类胡萝卜素的测定
存在特点和测定意义一 、叶绿素种类：比例种类颜色丙酮溶液中长波吸收峰叶绿素a蓝绿色663nm3黄绿色645nm1叶绿素b二、类胡萝卜素种类： 类胡萝卜素包括：胡萝卜素和叶黄素，二者之比是2：1。
（ß-胡萝卜素的乙醚溶液在451处有吸收峰）三、测定意义： 1、高水分，叶绿素含量高，愈近成熟，叶绿素降低。
2、低生物碱品系，叶绿素含量高，不易烤 高生物碱品系，叶绿素含量低，易烤 3、叶绿素含量影响烟叶成熟落黄河烘烤特性叶绿素和类胡萝卜素测定一、叶绿素测定 1、原理：用有机溶剂将叶绿素提取出来，制成待测液，根据提取液对某一波长的光有选择吸收，吸光度符合朗莫-比尔定律，计算出待测液中叶绿素含量： E＝lgI0/I＝KCL 如果比色皿厚度一定，则上式简化为： E＝KC K：吸光系数 C：浓度 如果待测液中含有2种以上有色物质，其吸光度也符合朗莫-比尔定律 溶液中含有2种有色物质时，有下式成立： Eλ1=Ka1 Ca+Kb1 Cb (1) Eλ2=Ka2 Ca+Kb2 Cb (2) 在叶绿素的待测液中含叶绿素a和b ，则有： E663＝82.04Ca＋9.27Cb (1)E645＝16.75Ca＋45.6Cb (2) E663＝82.04Ca＋9.27Cb (1)E645＝16.75Ca＋45.6Cb (2) 解联立方程式（1）和（2）得到： Ca=0.0127 E663-0.00259 E645 Cb=0.0229 E645-0.00467 E663 Ca+b=0.00805E663+0.0203E6452、测定步骤 ①待测液制备：0.5-2g样品于乳钵（研钵）内，加4倍体积的丙酮和约10mL 80%的丙酮，乳棒研磨。
用吸管仔细吸取抽出液转移到50mL容量瓶内，重向乳钵内加入10mL 80%的丙酮，继续研磨，合并抽出液，如此反复，直至研磨看不出有色素浸出为止，最后用80%丙酮定容到50mL，充分混匀，放冷暗处，使瓶内溶液澄清。
叶绿素提取
水研磨匀浆（光破坏对照）：
取2g剪碎的新鲜叶片，放入少量石英砂（不 加碳酸钙粉），用水研磨。
先加2ml蒸馏水，研至糊状，再加蒸馏水20ml， 搅均，不过滤。
（二）叶绿体色素的理化性质
1.光对叶绿素的破坏作用
叶绿素（a，b）的化学性质很不稳定，容 易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分 离以后（有机溶剂提取液），破坏更快，而类 胡萝卜素则较稳定。 （提取出叶绿素后先做这一步）
提取的作步骤：
（1）取菠菜叶片洗净、擦干、剪碎、混匀， 称2.5g，放入研钵中。 （2）加入少量石英砂及碳酸钙粉（目的？）， 加2～3滴管95%乙醇，研磨至糊状;（3）再加 15ml 95%乙醇，提取约3 min，过滤于三角瓶 中; （4）残渣用5-10ml 95%乙醇冲洗，一同过滤 于三角瓶中。
因吸附剂本试验为滤纸对不同物质的吸附力不同当用适当的溶剂推动时混合物中各成分在两相流动相和固定相间具有不同的分配系数所以它们的移动速度不同经过一定时间层析后便将混合色素分离
叶绿体色素的提取、分
离和理化性质
实验目的
绿色植物的光合作用是在叶绿体中进行的，其中 吸收光能的是叶绿体色素。了解叶绿体色素的组成、 性质对于理解光合作用的本质很有帮助。
光破坏实验，稀释倍数视提取液的浓度确定，浓度不 要过大，否则在短时间之内效果不明显。
阴天和晚上上课的同学取滤纸一张，将两种液 体分别涂抹在滤纸上，带回去，放在光下处理。
水研磨匀浆液 乙醇提取液 光下10分钟 剪开 暗处
折叠
光下破坏的时间不要过长，否则看不到效果。 阴天可以适当延长，时刻观察效果。
2. 乙醇提取液中叶绿素各成分分离： 用色层分析的原理加以分离
• 大部分硝酸根沿木质部向上运输，先运输到叶柄， 后到达叶片； • 叶片是光合作用和呼吸作用的主要场所，所产生 的硝酸根还原所需的供氢体NADPH含量高； • 叶片更易接受光照，而作为诱导酶的硝酸还原酶 在被底物诱导产生的过程中需要光； • 叶片中叶绿体含量高，其中还原型铁氧还蛋白将 NADP+还原为NADPH，同时可以将亚硝酸还原 为氢。
叶绿素含量的测定
植物叶绿体色素的提取、分离、及含量测定（一）叶绿体色素的提取一、实验目的1．掌握有机溶剂提取叶绿体色素等天然化合物的原理和实验方法。
2．了解皂化-萃取提取β−胡萝卜素原理。
3. 了解1,4-二氧六环沉淀法提取叶绿素原理。
二、实验原理植物光合作用是自然界最重要的现象，它是人类所利用能量的主要来源。
在把光能转化为化学能的光合作用过程中，叶绿体色素起着重要的作用。
高等植物体内的叶绿体色素有叶绿素和类胡萝卜素两类，主要包括叶绿素a、叶绿素b、β−胡萝卜素和叶黄素四种。
它们所呈现的颜色和在叶绿体中含量大约比例见表12.1。
叶绿素(chlorophylls)是叶绿酸的酯，它在植物进行光合作用中吸收可见光，并将光能转变为化学能。
叶绿素是植物进行光合作用所必需的催化剂。
在绿色植物中叶绿素主要以叶绿素a（C55H72O5N4Mg）和叶绿素b（C55H70O6N4Mg）两种结构相似的形式存在，其差别仅是叶绿素a中一个甲基被叶绿素b中的甲酰基所取代。
叶绿素的基本结构见图47.1。
在叶绿素分子结构中含有四个吡咯环，它们由四个甲烯基联结成卟啉环，在卟啉环中央有一个镁原子，它以两个共价键和两个配位键与四个吡咯环的氮原子结合成内配盐，形成镁卟啉。
在叶绿素分子中还有两个羧基，其中一个与甲醇酯化成COOCH3，另一个与叶绿醇酯化成COOC20H39长链。
类胡萝卜素(carotenoids)是一类不饱和的四萜类碳氢化合物（例如胡萝卜素，carotenes)，或它们的氧化衍生物（例如叶黄素类，xanthophylls)。
所有的类胡萝卜素均源于非环状的C40H56结构。
类胡萝卜素在强光下可防止叶绿素的光氧化；在弱光下，可作为辅助色素吸收光能并传递给叶绿素分子。
胡萝卜素有三种异构体，即α−、β−和γ−胡萝卜素，其中β−胡萝卜素含量最多，也最为重要。
β−胡萝卜素还具有维生素A的生理活性，其结构是由两分子维生素A 在端链失去两分子水结合而成。