蛋白质纯化试题整理
蛋白质的提取和分离 专题训练
蛋白质的提取和分离专题训练一.选择题1.下列有关蛋白质的提取和分离的操作,其中排序正确的是()。
A.样品处理、凝胶色谱操作、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳B.样品处理、凝胶色谱操作、纯化C.样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定D.样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定2.下列对在凝胶柱上加入样品和洗脱的操作不正确的是()。
A.加样前要使柱内凝胶面上的缓冲液下降到与凝胶面平齐B.让吸管管口沿管壁环绕移动,贴壁加样至色谱柱顶端,不要破坏凝胶面C.打开下端出口,待样品完全进入凝胶层后直接连接缓冲液洗脱瓶开始洗脱3.在蛋白质的提取和分离中,下列对样品处理过程的分析正确的是()。
A.洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄糖、无机盐B.洗涤时离心速度过小,时间过短,白细胞等会沉淀,达不到分离的结果C.洗涤过程选用质量分数0.1%的NaCl溶液(生理盐水)D.透析的目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质4.下列是有关血红蛋白提取和分离的相关操作,其中正确的是()。
A.可采集猪血作为实验材料B.用蒸馏水重复洗涤红细胞C.血红蛋白释放后应低速短时间离心D.洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流出液5.蛋白质的分离与纯化技术是蛋白质研究的重要技术。
下列叙述不正确的是()。
A.根据蛋白质分子不能透过半透膜的特性,可将样品中各种不同的蛋白质分离B.根据蛋白质所带电荷性质的差异及分子大小等,可通过电泳分离蛋白质C.根据蛋白质相对分子质量的大小,可通过凝胶色谱法分离蛋白质D.根据蛋白质的分子大小、密度不同,可通过离心沉降法分离蛋白质6.凝胶色谱法分离蛋白质时使用的凝胶是交联葡聚糖凝胶(SephadexG—75),其中G、75的含义分别是()。
A.G表示凝胶的使用量,75表示加75 g水B.G表示凝胶的交联程度,75表示需加热75 ℃C.G表示凝胶的交联程度、膨胀程度及分离范围,75表示每克凝胶膨胀时吸水7.5 g D.G表示凝胶的膨胀体积,75表示每克凝胶膨胀后体积可达75 cm37.用凝胶色谱法分离蛋白质时,相对分子质量大的蛋白质()。
蛋白质工程生物技术探索考核试卷
B.真核表达系统
C.无细胞表达系统
D.电子表达系统
20.以下哪个技术主要用于蛋白质工程中的结构预测?()
A.同源建模
B.蛋白质设计
C.分子对接
D.量子化学计算
(请在此处继续答题)
二、多选题(本题共20小题,每小题1.5分,共30分,在每小题给出的四个选项中,至少有一项是符合题目要求的)
1.蛋白质工程基本步骤包括序列分析、结构预测、设计突变、表达纯化、功能测试。例如,通过在酶的活性部位引入疏水性氨基酸,可以提高其热稳定性。
2.蛋白质工程在生物制药中用于优化蛋白质药物的稳定性和减少免疫原性。例如,通过替换可能引起免疫反应的氨基酸,开发更安全的药物。
3.蛋白质折叠是功能实现的前提,影响折叠的因素包括氨基酸序列、环境条件、pH值等。
1.以下哪些是蛋白质工程中常用的设计方法?()
A.理性设计
B.随机突变
C.计算机模拟D.Fra bibliotek上都是2.蛋白质工程可以应用于以下哪些领域?()
A.医药
B.农业
C.食品工业
D.能源
3.以下哪些因素可能影响蛋白质的活性?()
A.温度
B. pH值
C.氧气浓度
D.蛋白质浓度
4.下列哪些技术可以用于蛋白质表达?()
A.氨基酸序列
B.蛋白质浓度
C.环境温度
D.上述所有因素
8.以下哪个酶在蛋白质工程中常用于DNA的切割?()
A.逆转录酶
B.限制性内切酶
C.连接酶
D.聚合酶
9.下列哪种方法通常用于蛋白质工程中的定向进化?()
A.随机突变
B.理性设计
C.模拟退火
D.计算机辅助设计
基础生化实验-蛋白质纯化
蛋白质纯化一、目的:利用金属亲和性管柱(metal affinity column)来大量纯化带有affinity tag的基因重组蛋白。
二、原理:由于六个Histidine 所组成的His Tag (metal affinity tag)可与Ni2+ bind,所以利用基因重组技术在表现的蛋白质加上His Tag,再以金属亲和性管柱(Ni-NTA) (此His- tag序列可与带二价正电的阳离子相螯和)及liquid chromatography来大量纯化蛋白质。
三、试剂与器材:1.loading(binding) buffer (10mM imidazole,0.3M NaCl,50Mm Tris-HClPh7)✧细菌回溶成为蛋白质的载体以保持活性2.wash buffer (20mM imidazole,0.3M NaCl,50Mm Tris-HCl,Ph7)3.elution buffer (20mM EDTA,0.3M NaCl,50Mm Tris-HCl,Ph7)上课补充:✧蛋白质很脆弱,需要在特殊的buffer里。
四、仪器与设备:FPLC(速液相色谱仪)五、步骤:1.将管柱架在铁架上,把亲和性胶体悬浮装填于管柱内。
2.以2~3倍CV loading buffer清洗管柱后,注入蛋白质样本。
3.以wash buffer梳洗,2到3倍column体积。
4.用wash buffer和elution buffer进行线性梳洗,并收集流出液体,以FPLC UV monitor上的OD280数据读取样品流出与否,并观察冲离液之曲线图。
上课补充:✧胞内型分泌需要用超音波破菌,因为会放热所以要放在冰中使用。
✧线性梳洗为加入elution buffer会有颜色变化会把镍离子跟imidazole冲洗掉,剩下胶体溶液。
✧其中imidazole和Histidine类似也会和镍离子结合所以会竞争,可拿来洗涤蛋白质。
蛋白质纯化试题整理
名词解释1. 截留分子量(molecular weight cut-off, MWCO):不能通过膜的最小分子量2. 超滤:选择合适孔径的超滤膜,在离心力或较高压力下,使水分子和其他小分子物质通过超滤膜,而目标蛋白样品分子被截留不能通过超滤膜,从而增加蛋白样品浓度,达到浓缩效果的方法3、陶南效应:离子交换剂表面pH与溶液pH是不一致的。
在阳IE表面的微环境中,H+被吸引而OH-被排斥,交换剂表面pH比周围低1个pH单位;而阴IE表面的微环境中,H+被排斥,交换剂表面pH比周围高1个pH单位4、离子交换剂的有效(实际)交换容量:指在一定的实验条件下,每克干介质或每毫升湿胶吸附蛋白质的实际容量5. 聚沉(coagulation)是指在聚沉剂的作用下,溶液中的蛋白质相互聚集为较大在聚沉物(>1mm)的过程•常见的聚沉剂:无机盐类(如氯化锌、氯化铁、氯化铝、硫酸锌、硫酸铝),聚合无机盐(聚合铝、聚合铁等)•聚沉条件:-20℃以下,pH3~6,较高离子强度,高多价金属离子(Fe3+、Al3+)6. 絮凝(flocculation)是指在絮凝剂的作用下,通过吸附、交联、网捕,把蛋白质聚结为大絮体沉降的过程•常见的絮凝剂:淀粉、树脂、单宁、离子交换树脂及纤维素衍生物•絮凝作用一般在聚沉作用之后使用;絮凝剂的选择应根据成本、毒性等具体情况考虑;应通过试验筛选获得最适合的絮凝剂类型、用量及作用条件7、盐溶:蛋白质在稀盐溶液中,溶解度会随着盐浓度的增高而上升8、盐析:但当盐浓度增高到一定数值时,其溶解度又逐渐下降,直至蛋白质析出9、透析:利用小分子能通过,而大分子不能透过半透膜的原理,把不同性质的物质彼此分开的一种方法。
对于蛋白质样品,透析过程中因蛋白质分子体积很大,不能透过半透膜,而溶液中的无机盐小分子则能透过半透膜进入水中,因此不断更换透析用水即可将蛋白质与无机盐小分子物质完全分开。
蛋白的分离纯化过程中常用此法脱去无机盐(如硫酸铵)10、排阻极限:指不能进入凝胶颗粒内部网孔的最小蛋白的分子量11、凝胶颗粒的分级范围:指能进入凝胶颗粒内部网孔的最大分子和最小分子的分子量范围12、过滤:利用多孔介质(滤纸、滤膜等)阻截大的颗粒物质,而使小于孔隙的物质通过的一种的分离方法。
蛋白质分离纯化练习题文稿
① 要注意pH (考虑高pH 释氨,等电点和蛋白质稳定性);
注意硫酸铵应在搅拌之下,缓缓加入,防止局部浓度过高; 注 意温度,硫酸铵的溶解度在0~30℃范围内变化很小。
思考题
② 含有硫酸铵等盐类,这类将影响以后的纯化和分析,所
以纯化前均应除去;离子交换层析的原理是使用带有固定的带
青岛大学2009年
15、Pro
Glc Ala
Vc
GSH,请设计不同实验区别他们。
川大生物化学2015年
还原糖、茚三酮、双缩脲法
16、设计柠檬酸合酶提取方案,鉴别纯度 四川大学生物化学2015年
思考题
17、
2012年宁波大学
青岛大学2009年
思考题
(3)接着将盐析所得到的CS粗制品对pH7.2的缓冲液透析, 为什么不用水透析的?目的是什么; (4)将上述处理所获得的CS粗制品进行分子排阻层析,在 280nm下检测是否有蛋白被洗出,实验者保留第一个洗脱峰 进行下一步的纯化。为什么; (5)实验者将上步得到的CS样品又选用离子交换剂进行纯 化上样平衡后, 用高pH的缓冲液洗脱为什么?
南昌大学生物化学2007年来自考题② 含有硫酸铵等盐类,这类将影响以后的纯化和分析,所
以纯化前均应除去;离子交换层析的原理是使用带有固定的带
电基团的聚合树脂或凝胶层析柱分离离子化合物的层析方法。 如果你的样品中盐过高的话,样品是挂不到柱子上的. ③ 透析、超滤或凝胶过滤层析(G-25) 处理。 3. 简要说明下列试剂在蛋白质的分离纯化和测定中的作用。 (1)、固体硫酸铵 (2)、三氯醋酸 (3)、巯基乙醇 (4)、溴酚蓝 (5)、十二烷基硫酸钠
电基团的聚合树脂或凝胶层析柱分离离子化合物的层析方法。 如果样品中盐过高的话,样品是挂不到柱子上的. ③ 透析、超滤或凝胶过滤层析(G-25) 处理。 3. 简要说明下列试剂在蛋白质的分离纯化和测定中的作用。 (1)、固体硫酸铵 (2)、三氯醋酸 (3)、巯基乙醇 (4)、溴酚蓝 (5)、十二烷基硫酸钠
蛋白纯化面试知识问答
蛋白纯化面试知识问答什么是蛋白纯化?蛋白纯化是指从复杂的混合物中分离出目标蛋白质的过程。
蛋白纯化的目的是获得高纯度的目标蛋白质,以便于进一步的研究和应用。
为什么需要蛋白纯化?蛋白质在生物学和生物技术研究中起着重要的作用,但在生物体内存在大量其它分子,如其他蛋白质、核酸、小分子等。
为了研究和利用目标蛋白质,需要将其从复杂的混合物中分离出来,获得高纯度的样品。
蛋白纯化的步骤有哪些?蛋白纯化通常包括以下步骤:1.细胞破碎:将含有目标蛋白质的细胞破碎,释放蛋白质。
2.澄清:通过离心等方法去除细胞碎片、细胞核和细胞器等杂质。
3.分离:利用不同的分离技术,如层析、电泳等,将目标蛋白质与其他蛋白质分离。
4.纯化:通过进一步的分离步骤,获得高纯度的目标蛋白质。
5.洗脱:将目标蛋白质从分离介质中洗脱。
6.浓缩:将洗脱的目标蛋白质浓缩得到较小的体积。
常用的蛋白纯化技术有哪些?常用的蛋白纯化技术包括:1.柱层析:包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。
根据目标蛋白质的性质选择不同的柱层析方法。
2.电泳技术:包括凝胶电泳、等电聚焦等。
通过蛋白质的电荷、大小和形状等特性进行分离。
3.过滤技术:包括超滤、微滤等。
根据蛋白质的大小选择合适的滤膜进行分离。
什么是亲和层析?亲和层析是一种利用目标蛋白质与特定配体之间的亲和力进行蛋白纯化的技术。
亲和层析常用于从复杂的混合物中高效选择性地纯化目标蛋白质。
亲和层析的原理是什么?亲和层析的原理是利用目标蛋白质与配体之间的特异性相互作用。
配体可以是金属离子、抗体、亲和标签等,通过与目标蛋白质结合,实现目标蛋白质的分离纯化。
亲和层析的步骤有哪些?亲和层析通常包括以下步骤:1.准备亲和树脂:将具有亲和配体的树脂填充到柱子中。
2.样品加载:将样品溶液加到亲和树脂柱上,使目标蛋白质与配体结合。
3.洗脱:通过改变洗脱缓冲液的条件,将目标蛋白质从亲和树脂上洗脱下来。
4.收集纯化的目标蛋白质溶液。
什么是凝胶过滤层析?凝胶过滤层析是一种基于蛋白质大小分离的蛋白纯化技术。
蛋白质纯化方法及问题解答
蛋白质纯化一.可溶性蛋白的纯化1. 盐析硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。
用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离,是免疫球蛋白分离的常用方法。
高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子,从而破坏蛋白质表面的水化膜,降低其溶解度,使之从溶液中沉淀出来。
各种蛋白质的溶解度不同,因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。
这种方法称之为盐析。
盐浓度通常用饱和度来表示。
硫酸铵因其溶解度大,温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。
硫酸铵分级沉淀的方法其实很简单,一般就是用浓度从低到高的硫酸铵去沉淀蛋白,可以直接在液体里加固体的硫酸铵就可以,到一定的浓度离心沉淀,上清继续加硫酸铵,再离心,上清再加硫酸铵,然后用电泳检测或者活性检测沉淀的效果。
2. 亲和纯化2.1. Ni柱纯化2.1.1.Ni柱纯化操作流程1. 蛋白质上清与Ni柱填料在4℃下进行充分旋转混合(≥60 min);也可以让上清液缓慢流经Ni柱(≥6 sec/drop)。
2. 上清与填料混合后,低速离心(≤ 500 x g),吸去大部分上清,然后将填料悬起,加入柱子中。
也可以直接上柱。
3. 上样后先用5-10 柱体积(CV)的lysis buffer冲洗不结合的杂蛋白,然后再用低浓度的咪唑洗去弱结合的杂蛋白。
在不知道清洗条件时可以进行咪唑浓度梯度洗脱(如10,20,30,40,50 mM),然后在纯度和得率之间选择最合适的咪唑浓度来进行清洗。
4. 清洗结束后,用高浓度咪唑(如200 mM)洗脱目的蛋白质。
5. 洗脱下来的目的蛋白质除电泳留样外,透析除去咪唑,并换成下一步所需的buffer。
6. 一般情况下his tag不需要切除。
当需要切除时:的蛋白质最少1)TEV:咪唑对其没有影响,可以在洗脱后直接酶切。
100 OD280的TEV切过夜,温度20或4℃(20℃的效率是4℃的三倍)。
可用1 OD2802) Thrombin:必须先除去咪唑才能进行酶切。
蛋白质分离纯化试题版
一、已知某生物中一种蛋白质的分子量约为62000,请最大限度的分离纯化这种蛋白,根据下列要求写出具体的分离纯化方法。
(1)利用溶解度差别进行分离(2)利用蛋白分子大小进行分离(3)根据不同的电荷进行分离(4)利用已制备对的抗体进行分离(5)蛋白质纯度坚定答:(1)根据溶解度不同进行分离纯化影响蛋白质溶解度的外部条件有很多,比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。
但在同一条件下,不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度,根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度,达到分离纯化蛋白质的目的。
常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。
等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法。
每种蛋白质都有自己的等电点,而且在等电点时溶解度最低;相反,有些蛋白质在一定pH值时很容易溶解。
因而可以通过调节溶液的pH值来分离纯化蛋白质。
(2)根据分子大小不同进行分离纯化蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。
根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。
透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。
透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。
超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。
这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。
它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。
(3)根据电荷不同进行分离纯化根据蛋白质的电荷即酸碱性质不同分离蛋白质的方法有电泳和离子交换层析两类。
在外电场的作用下,带电颗粒(如不处于等电点状态的蛋白质分子)将向着与其电性相反的电极移动,这种现象称为电泳。
蛋白质分离纯化
蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化是用生物工程下游技术从混合物之当中分离纯化出所需要得目的蛋白质的方法。
是当代生物产业当中的核心技术。
该技术难度、成本均高;例如一个生物药品的成本75%都花在下游蛋白质分离纯化当中。
常用技术有:1、沉淀,2、电泳:蛋白质在高于或低于其等电点的溶液中是带电的,在电场中能向电场的正极或负极移动。
根据支撑物不同,有薄膜电泳、凝胶电泳等。
3、透析:利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。
4、层析:a.离子交换层析,利用蛋白质的两性游离性质,在某一特定PH时,各蛋白质的电荷量及性质不同,故可以通过离子交换层析得以分离。
如阴离子交换层析,含负电量小的蛋白质首先被洗脱下来。
b.分子筛,又称凝胶过滤。
小分子蛋白质进入孔内,滞留时间长,大分子蛋白质不能时入孔内而径直流出。
5、超速离心:既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。
不同蛋白质其密度与形态各不相同而分开。
编辑本段蛋白质分离纯化技术蛋白质的分离纯化一、沉淀法沉淀法也称溶解度法。
其纯化生命大分子物质的基本原理是根据各种物质的结构差异性来改变溶液的某些性质,进而导致有效成分的溶解度发生变化。
1、盐析法盐析法的根据是蛋白质在稀盐溶液中,溶解度会随盐浓度的增高而上升,但当盐浓度增高到一定数值时,使水活度降低,进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和,水化膜逐渐被破坏,最终引起蛋白质分子间互相凝聚并从溶液中析出。
2、有机溶剂沉淀法有机溶剂能降低蛋白质溶解度的原因有二:其一、与盐溶液一样具有脱水作用;其二、有机溶剂的介电常数比水小,导致溶剂的极性减小。
3、蛋白质沉淀剂蛋白质沉淀剂仅对一类或一种蛋白质沉淀起作用,常见的有碱性蛋白质、凝集素和重金属等。
4、聚乙二醇沉淀作用聚乙二醇和右旋糖酐硫酸钠等水溶性非离子型聚合物可使蛋白质发生沉淀作用。
5、选择性沉淀法根据各种蛋白质在不同物理化学因子作用下稳定性不同的特点,用适当的选择性沉淀法,即可使杂蛋白变性沉淀,而欲分离的有效成分则存在于溶液中,从而达到纯化有效成分的目的。
蛋白质的理化性质和分离纯化
一、蛋白质的两性电离
蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外,
氨基酸残基侧链中某些基团,在一定的溶液pH条
件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。
* 蛋白质的等电点( isoelectric point, pI) 当蛋白质溶液处于某一pH时,蛋白质解离成 正、负离子的趋势相等,即成为兼性离子,净电 荷为零,此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。
名词解释
等电点(pI) 肽键和肽链 肽平面及二面角 二级结构 三级结构 四级结构 超二级结构 蛋白质变性与复性 分子病 肽 一级结构 结构域
三、是非题 1.构成蛋白质的20种基本氨基酸除脯氨酸外,在结 构上的共同点是与羧基相邻α-碳原子上都有一个氨 基。( ) 2.一个氨基酸在水溶液中或固体状态时是以两性离 子形式存在。( ) 3. .构型的改变必须有旧共价键的破坏和新共价键的 形成,而构象的改变则不发生此变化。( ) 4.肽的命名是从肽链的游离氨基开始的。( ) 5.蛋白质分子中肽链能自由旋转。( ) 6.所有的蛋白质都具有一、二、三、四级结构。.( )
(二)蛋白质的胶体性质
蛋白质属于生物大分子之一,分子量可自
1 万 至 100 万 之 巨 , 其 分 子 的 直 径 可 达 1 ~
100nm,为胶粒范围之内。
* 蛋白质胶体稳定的因素 颗粒表面电荷
水化膜
水化膜
+ + + + + + +
带正电荷的蛋白质 脱水作用
酸 碱 在等电点的蛋白质 脱水作用 碱
术。
(四)层析
层析(chromatography)分离蛋白质的原理 待分离蛋白质溶液(流动相)经过一个固 态物质(固定相)时,根据溶液中待分离的蛋
蛋白质工程与药物研发题目
蛋白质工程与药物研发题目1. 以下哪种物质不是蛋白质工程中常用的氨基酸替代物?A. 异亮氨酸B. 色氨酸C. 苯丙氨酸D. 丙氨酸2. 在蛋白质工程中,通过改变哪个氨基酸残基的位置和结构,可以影响蛋白质的功能?A. 肽键B. 氨基酸侧链C. 氨基酸的R基团D. 氨基酸的α-碳原子3. 蛋白质工程中,通过哪种方法可以确定目标蛋白质的三维结构?A. 核磁共振B. X射线晶体学C. 质谱D. 电泳4. 在蛋白质工程中,以下哪种方法可以用来增加蛋白质的溶解性?A. 突变氨基酸侧链B. 突变氨基酸的R基团C. 突变氨基酸的肽键D. 突变氨基酸的α-碳原子5. 以下哪种方法不是蛋白质工程中常用的蛋白质纯化方法?A. 凝胶过滤B. 离子交换C. 亲和层析D. 显微镜观察6. 以下哪种蛋白质工程方法可以用于研究蛋白质的构象变化?A. 定点突变B. 基因融合C. 分子动力学模拟D. 蛋白质阵列7. 以下哪种蛋白质工程方法可以用于提高蛋白质的稳定性和溶解性?A. 定点突变B. 基因融合C. 分子动力学模拟D. 蛋白质阵列8. 以下哪种氨基酸残基不是常见的蛋白质工程目标?A. 组氨酸B. 酪氨酸C. 精氨酸D. 半胱氨酸9. 以下哪种蛋白质工程方法可以用于研究蛋白质与配体的结合?A. 定点突变B. 基因融合C. 分子动力学模拟D. 蛋白质阵列10. 以下哪种蛋白质工程方法可以用于提高蛋白质的酶活性?A. 定点突变B. 基因融合C. 分子动力学模拟D. 蛋白质阵列11. 以下哪种蛋白质工程方法可以用于研究蛋白质的折叠过程?A. 定点突变B. 基因融合C. 分子动力学模拟D. 蛋白质阵列12. 以下哪种氨基酸残基不是常见的蛋白质工程目标?A. 组氨酸B. 酪氨酸C. 精氨酸D. 半胱氨酸13. 以下哪种蛋白质工程方法可以用于提高蛋白质的稳定性和溶解性?A. 定点突变B. 基因融合C. 分子动力学模拟D. 蛋白质阵列14. 以下哪种方法不是蛋白质工程中常用的蛋白质纯化方法?A. 凝胶过滤B. 离子交换C. 亲和层析D. 显微镜观察15. 以下哪种蛋白质工程方法可以用于研究蛋白质与配体的结合?A. 定点突变B. 基因融合C. 分子动力学模拟D. 蛋白质阵列16. 以下哪种蛋白质工程方法可以用于提高蛋白质的酶活性?A. 定点突变B. 基因融合C. 分子动力学模拟D. 蛋白质阵列17. 以下哪种蛋白质工程方法可以用于研究蛋白质的折叠过程?A. 定点突变B. 基因融合C. 分子动力学模拟D. 蛋白质阵列18. 以下哪种氨基酸残基不是常见的蛋白质工程目标?A. 组氨酸B. 酪氨酸C. 精氨酸D. 半胱氨酸19. 以下哪种蛋白质工程方法可以用于提高蛋白质的稳定性和溶解性?A. 定点突变B. 基因融合C. 分子动力学模拟D. 蛋白质阵列20. 以下哪种方法不是蛋白质工程中常用的蛋白质纯化方法?A. 凝胶过滤B. 离子交换C. 亲和层析D. 显微镜观察21. 以下哪种蛋白质工程方法可以用于研究蛋白质与配体的结合?A. 定点突变B. 基因融合C. 分子动力学模拟D. 蛋白质阵列22. 以下哪种蛋白质工程方法可以用于提高蛋白质的酶活性?A. 定点突变B. 基因融合C. 分子动力学模拟D. 蛋白质阵列23. 以下哪种蛋白质工程方法可以用于研究蛋白质的折叠过程?A. 定点突变B. 基因融合C. 分子动力学模拟D. 蛋白质阵列24. 以下哪种氨基酸残基不是常见的蛋白质工程目标?A. 组氨酸B. 酪氨酸C. 精氨酸D. 半胱氨酸25. 以下哪种蛋白质工程方法可以用于提高蛋白质的稳定性和溶解性?A. 定点突变B. 基因融合C. 分子动力学模拟D. 蛋白质阵列26. 以下哪种方法不是蛋白质工程中常用的蛋白质纯化方法?A. 凝胶过滤B. 离子交换C. 亲和层析D. 显微镜观察27. 以下哪种蛋白质工程方法可以用于研究蛋白质与配体的结合?A. 定点突变B. 基因融合C. 分子动力学模拟D. 蛋白质阵列28. 以下哪种蛋白质工程方法可以用于提高蛋白质的酶活性?A. 定点突变B. 基因融合C. 分子动力学模拟D. 蛋白质阵列29. 以下哪种蛋白质工程方法可以用于研究蛋白质的折叠过程?A. 定点突变B. 基因融合C. 分子动力学模拟D. 蛋白质阵列30. 以下哪种氨基酸残基不是常见的蛋白质工程目标?A. 组氨酸B. 酪氨酸C. 精氨酸D. 半胱氨酸31. 以下哪种蛋白质工程方法可以用于提高蛋白质的稳定性和溶解性?A. 定点突变B. 基因融合C. 分子动力学模拟D. 蛋白质阵列32. 以下哪种方法不是蛋白质工程中常用的蛋白质纯化方法?A. 凝胶过滤B. 离子交换C. 亲和层析D. 显微镜观察33. 以下哪种蛋白质工程方法可以用于研究蛋白质与配体的结合?A. 定点突变B. 基因融合C. 分子动力学模拟D. 蛋白质阵列34. 以下哪种蛋白质工程方法可以用于提高蛋白质的酶活性?A. 定点突变B. 基因融合C. 分子动力学模拟D. 蛋白质阵列35. 以下哪种蛋白质工程方法可以用于研究蛋白质的折叠过程?A. 定点突变B. 基因融合C. 分子动力学模拟D. 蛋白质阵列36. 以下哪种氨基酸残基不是常见的蛋白质工程目标?A. 组氨酸B. 酪氨酸C. 精氨酸D. 半胱氨酸37. 以下哪种蛋白质工程方法可以用于提高蛋白质的稳定性和溶解性?A. 定点突变B. 基因融合C. 分子动力学模拟D. 蛋白质阵列38. 以下哪种方法不是蛋白质工程中常用的蛋白质纯化方法?A. 凝胶过滤B. 离子交换C. 亲和层析D. 显微镜观察39. 以下哪种蛋白质工程方法可以用于研究蛋白质与配体的结合?A. 定点突变B. 基因融合C. 分子动力学模拟D. 蛋白质阵列40. 以下哪种蛋白质工程方法可以用于提高蛋白质的酶活性?A. 定点突变B. 基因融合C. 分子动力学模拟D. 蛋白质阵列41. 以下哪种蛋白质工程方法可以用于研究蛋白质的折叠过程?A. 定点突变B. 基因融合C. 分子动力学模拟D. 蛋白质阵列42. 以下哪种氨基酸残基不是常见的蛋白质工程目标?A. 组氨酸B. 酪氨酸C. 精氨酸D. 半胱氨酸43. 以下哪种蛋白质工程方法可以用于提高蛋白质的稳定性和溶解性?A. 定点突变B. 基因融合C. 分子动力学模拟D. 蛋白质阵列44. 以下哪种方法不是蛋白质工程中常用的蛋白质纯化方法?A. 凝胶过滤B. 离子交换C. 亲和层析D. 显微镜观察45. 以下哪种蛋白质工程方法可以用于研究蛋白质与配体的结合?A. 定点突变B. 基因融合C. 分子动力学模拟D. 蛋白质阵列46. 以下哪种蛋白质工程方法可以用于提高蛋白质的酶活性?A. 定点突变B. 基因融合C. 分子动力学模拟D. 蛋白质阵列47. 以下哪种蛋白质工程方法可以用于研究蛋白质的折叠过程?A. 定点突变B. 基因融合C. 分子动力学模拟D. 蛋白质阵列48. 以下哪种氨基酸残基不是常见的蛋白质工程目标?A. 组氨酸B. 酪氨酸C. 精氨酸D. 半胱氨酸49. 以下哪种蛋白质工程方法可以用于提高蛋白质的稳定性和溶解性?A. 定点突变B. 基因融合C. 分子动力学模拟D. 蛋白质阵列50. 以下哪种方法不是蛋白质工程中常用的蛋白质纯化方法?A. 凝胶过滤B. 离子交换C. 亲和层析D. 显微镜观察。
生物化学蛋白质测试题
单元测试一:蛋白质化学班级:姓名:分数:一.填空题(每空1.5分,共30分)1.当溶液pH等于某种氨基酸的等电点时,其带_ 零 _电荷;当溶液pH大于某种氨基酸的等电点时,其带_ 负 _电;溶液pH小于某种氨基酸的等电点时,其带_ 正电。
2.盐浓度低时,盐的加入使蛋白质的溶解度_ 增大 _,称为_ 盐溶__现象。
当盐浓度高时,盐的加入使蛋白质的溶解度降低,称为盐析现象。
3.由甘氨酸、赖氨酸、谷氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬氨酸6种氨基酸残基组成的肽链有 5 个肽平面,有 3 个游离羧基。
4.蛋白质分子结构包括一级结构和二级结构。
蛋白质的一级结构是由氨基酸通过肽键连接而成的多肽链。
6.蛋白质分子的基本组成单位是氨基酸。
蛋白质的一级结构维持作用力是肽键。
蛋白质的分子结构决定蛋白质的性质和功能。
7.蛋白质二级结构主要有 a螺旋和B折叠形状,维持其稳定结构的化学键是氢键。
判断题1.用凝胶过滤(Sephadex G-100)柱层析分离蛋白质时,总是分子量大的先被洗脱下来,分子量小的后下来。
对2.变性后,蛋白质的溶解度增加(减小),这是因为电荷被中和(空间结构被破坏),以及水化膜破坏所引起的。
错3.变性后(物理变性不可逆,化学变性可逆,可复性)的蛋白质在一定条件下,有些还能复性,恢复其生物学功能。
对4.有机溶剂沉淀法分离纯化蛋白质的优点是有机溶剂容易蒸发除去,且不会使蛋白质变性。
错5.蛋白质分子的种类和差别,是由其空间结构决定的。
错(一级结构)6.蛋白质主要是由C、H、O、N四种元素组成。
对7.氨基酸通过肽键连接而成的化合物称为肽。
对8.天然蛋白质的基本组成单位主要是L-α-氨基酸。
对9.肽键(-CO-NH-)中的C-N键可自由旋转,使多肽链出现多种构象。
错(不可旋转)10.维持蛋白质二级结构的化学键是氢键及范德华力(不是)。
错11.蛋白质一级结构对空间结构起决定作用,空间结构的改变会引起功能的改变。
对12.维持蛋白质二级结构稳定的主要作用力是氢键。
蛋白质的提取和分离练习题
蛋白质的提取和分离练习题【基础达标】1.选用猪、牛、羊成熟的红细胞作分离蛋白质的实验材料,下列是其优点的是()A.血红蛋白是无色蛋白B.红细胞有细胞核C.红细胞蛋白质含量高D.红细胞DNA含量高【答案】C【解析】哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核,核物质也消失,所以红细胞内几乎没有DNA;血红蛋白是有色蛋白,红细胞蛋白质含量高。
故选C。
2.血红蛋白释放时,红细胞破裂的原因不包括()A.红细胞吸水膨胀B.磁力搅拌器的充分搅拌C.血红蛋白变性D.甲苯对细胞膜的溶解【答案】C【解析】血红蛋白释放时,红细胞破裂的原因是红细胞吸水膨胀、甲苯对细胞膜的溶解、磁力搅拌器的充分搅拌等,血红蛋白不会变性。
故选C。
3.蛋白质分离和提取的步骤可分为()A.样品处理、凝胶色谱操作、SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳B.样品处理、凝胶色谱操作、纯化C.样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定D.样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定【答案】C【解析】蛋白质的提取和分离分为样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定四步。
故选C。
4.将搅拌好的混合液离心来分离血红蛋白溶液时,第2层是()A.甲苯B.血红蛋白水溶液C.脂溶性物质的沉淀层D.其他杂质的沉淀【答案】C【解析】A项错误:甲苯层位于第1层;B项错误:血红蛋白水溶液位于第3层;C项正确:第2层是脂溶性物质的沉淀层;D项错误:其他杂质的沉淀物位于第4层。
5.下列有关提取和分离血红蛋白的程序叙述错误的是()A.样品处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液B.通过透析可以去除样品中分子质量较大的杂质,此为样品的粗提取C.可通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去,即样品的纯化D.可通过SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度【答案】BA项正确:样品处理是洗涤红细胞,使血红蛋白释放出来,通过离心法得到血红蛋白溶液; B项错误:透析的原理是透析袋能使小分子物质自由进出,而袋内的大分子物质留在袋内即可除去样品中相对分子质量较小的杂质; C项正确:凝胶色谱法中的凝胶内部通道只允许相对分子质量较小的蛋白质通过,而相对分子质量较大的蛋白质则被排阻在凝胶颗粒之外,即达到样品纯化的目的;D项正确:判断纯化的蛋白质是否达到要求,通常用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳法对蛋白质的纯度进行鉴定。
蛋白质考题及答案解析
蛋白质考题及答案解析蛋白质结构与功能试题一、问答题:1.影响蛋白质二级结构改变的因素有哪些?参考答案:温度;pH;邻近氨基酸残基的二级结构倾向;肽链中远程肽段的影响;肽段是处于分子表面还是被包埋在分子内部2.如下图所示。
多聚谷氨酸poly (Glu) 是由多个L-Glu聚合形成的多肽链,在pH为3的溶液中能形成a-螺旋构象,当pH升高到7时,则由a-螺旋变为无规卷曲,旋光率陡然下降。
同样,多聚赖氨酸poly (Lys) 在pH为10的溶液中具有a-螺旋结构,当pH降低至7时,旋光率也发生陡然下降,由a-螺旋结构变为无规卷曲。
请解释pH对poly (Glu) 和poly (Lys) 构象变化的影响。
答案要点:pH=3接近Glu g-COOH的p K R (4.07),侧链基团为质子化不带电荷状态,可形成a-螺旋结构。
其余情况按此思路分析。
Lys e-NH2 p K R 为10.54。
3.胶原蛋白的结构特点(原胶原分子的一级结构和高级结构)1)在体内,胶原蛋白以胶原纤维的形式存在,胶原纤维的基本结构单位是原胶原分子2)每个原胶原分子由三条左手螺旋的a链(a-肽链)组成右手超螺旋结构,每条a链约含1000个氨基酸残基3)a链间靠H-键和范得华力维系,胶原纤维可以通过分子内和分子间的进一步交联增强稳定性4)a链一级结构序列96%遵守(Gly-X-Y)n。
x多为脯氨酸Pro;y 多为羟基脯氨酸Hyp或羟基赖氨酸Hly5)胶原蛋白是糖蛋白,少量糖与5-羟赖氨酸(Hyl)残基的碳羟基共价连接6)具有较好的弹性和抗张强度4.形成结构域的意义是什么?参考答案:1)各结构域分别折叠,其动力学上更有利2)结构域自身紧密装配,结构域之间的柔性连接使每个结构域间可以作较大幅度的相对运动3)多个结构域形成的间隙部位往往是蛋白质的功能部位,结构域的相互作用有利于蛋白质分子产生别构效应5.简述三种浓缩蛋白质溶液的方法及原理1)超滤法:将蛋白质样品装入适当的超滤管中,经一定时间离心,溶剂穿过超滤管滤膜流出而使蛋白质溶液得以浓缩2)硫酸铵沉淀法:通过盐析作用使蛋白质在高浓度中性盐中析出而浓缩。
生物药品的分离纯化技术及其应用考核试卷
2.离子交换层析中,蛋白质的吸附能力随着溶液pH值的增加而增强。()
3.亲和层析的洗脱通常可以通过改变pH值来实现。()
4.冷冻干燥是生物药品储存的最佳方法,因为它可以完全避免蛋白质的变性。()
5.生物药品的毒理学评价只需要检测急性毒性。()
10.在蛋白质的等电点沉淀中,以下哪种情况会导致蛋白质沉淀?()
A.溶液pH值低于蛋白质等电点
B.溶液pH值高于蛋白质等电点
C.溶液pH值等于蛋白质等电点
D.溶液pH值远离蛋白质等电点
11.下列哪种方法适用于蛋白质的变性?()
A.加入盐类
B.加入有机溶剂
C.调节pH值
D.降低温度
12.以下哪种层析技术是基于蛋白质分子大小进行分离的?()
4.影响生物药品稳定性的因素包括温度、pH值、离子强度、氧化等。通过冷冻干燥、冷藏、调节pH值和使用抗氧化剂等方法可以保持药品稳定性。
4.生物药品的稳定性对其质量和疗效至关重要。请列举影响生物药品稳定性的因素,并讨论在储存和应用过程中如何保持生物药品的稳定性。
标准答案
一、单项选择题
1. A
2. C
3. A
4. C
5. A
6. C
7. B
8. A
9. D
10. C
11. B
12. C
13. D
14. C
15. C
16. D
17. C
A.离子交换层析
B.亲和层析
C.凝胶过滤层析
D.吸附层析
13.在生物药品纯化过程中,下列哪种方法通常用于去除核酸杂质?()
A.蛋白酶处理
“生物大分子分离纯化及检测”试题
2005级硕士研究生“生物大分子分离纯化及检测”试题一、简述或解释(70分)1、电渗?逆回效应?肽图?电泳迁移率?(8分)电渗即电解质在电场中的相对位移。
原因:固体支持物与溶液中会形成双电层,在电场作用下会是电解质进行相对位移,我们称之为电渗。
电渗与固体支持物本身的性质有关。
在对流免疫电泳中利用电渗效应,而在其他电泳中尽量消除电渗作用。
逆回效应:分析样品为血清蛋白时,虽电泳时间的不同,可得到不同的电泳图谱,在20个小时的电泳过程中,分离区带的顺序也会发生变化,称逆回效应。
原因:样品中含有电解质,在电泳过程中,由于电解质的存在,样品各成分所带的实际电荷发生改变,从而造成某种成分移动方向的改变,而表现出逆回效应。
如果将血清样品先对所用电泳缓冲液进行透析,就不会出现逆回效应,各条区带的移动与时间呈线性关系。
电泳迁移率:在一定电场下,带电质点的迁移速度。
U=Q/6hrpai.2、测定蛋白质等电点方法的基本原理?(6分)在等电聚焦电泳中,由于载体两性电解质在电场作用下形成PH梯度,加入样品蛋白质以后,由于蛋白质所带电荷的性质及程度不同,在电泳过程中就会向不同的方向(与其带相反电荷的方向)移动,当蛋白质移动到与其等电点相等的PH区域时,由于蛋白质本身所带净电荷为0,故停止移动,因此在电泳结束后蛋白质所在位点的环境PH就是蛋白质的等电点。
3、狭义亲和层析的基本原理?(5分)狭义亲和层析基本原理:生物大分子之间有一种特异的相互作用,比如:抗原-抗体、酶-底物、配体-受体等等。
将其任何一方固定来分离纯化另一方(通过特异相互作用结合,改变环境条件使分离纯化成分解离)。
4、离子交换层析的洗脱方法及方式?(6分)离子交换层析的洗脱方法:⑴、改变起始缓冲液的PH,是牢固吸附状态的组份变为有限吸附状态或完全解吸状态。
⑵、增加起始缓冲液的离子强度(加中性盐、缓冲盐等),以增加洗脱液的洗脱能力。
⑶、改变起始缓冲液PH的同时,增加其离子强度,以增加洗脱液的洗脱能力。
蛋白质的性质和纯化
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8.变性蛋白质的主要特点是: A.粘度下降 B.溶解度增加 C.不易被蛋 白酶水解 D.生物学活性丧失 E.容易被盐析出现沉 淀
9.若用重金属沉淀pI为8的蛋白质时,该溶液 的pH值应为: A.8 B.>8 C.<8 D.≤8 E.≥8
10.蛋白质分子组成中不含有下列哪种氨基酸? A.半胱氨酸 B.蛋氨酸 C.胱氨酸 D.丝氨酸 E.瓜氨酸
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●等电聚焦电泳
Isoelectric focusing
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双向电泳
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➢离子交换
Ion-exchange Chromatography
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6.3.4 利用配体的生物学亲和力
➢亲和层析
Affinity Chromatography
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➢蛋白质的性质与分离纯化
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6.1.2 胶体性质
蛋白质属于生物大分子,分子量可自1万至100 万,其分子直径可达1-100nm,为胶粒范围之内。
蛋白质稳定的因素:
✓水化膜: ✓颗粒表面电荷:
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6.1.3 变性作用(denaturation)
➢ 概念:在某些物理或化学因素作用下, 使 蛋白质分子原有的特定的空间结构被破坏,从 而导致蛋白质性质的改变以及生物活性的丧失 的现象。
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4.关于蛋白质分子三级结构的描述,其中错误的是: A.天然蛋白质分子均有的这种结构 B.具有三级结构的多肽链都具有生物学活性 C.三级结构的稳定性主要是次级键维系 D.亲水基团聚集在三级结构的表面 E.决定盘曲折叠的因素是氨基酸残基
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名词解释1. 截留分子量(molecular weight cut-off, MWCO):不能通过膜的最小分子量2. 超滤:选择合适孔径的超滤膜,在离心力或较高压力下,使水分子和其他小分子物质通过超滤膜,而目标蛋白样品分子被截留不能通过超滤膜,从而增加蛋白样品浓度,达到浓缩效果的方法3、陶南效应:离子交换剂表面pH与溶液pH是不一致的。
在阳IE表面的微环境中,H+被吸引而OH-被排斥,交换剂表面pH比周围低1个pH单位;而阴IE表面的微环境中,H+被排斥,交换剂表面pH比周围高1个pH单位4、离子交换剂的有效(实际)交换容量:指在一定的实验条件下,每克干介质或每毫升湿胶吸附蛋白质的实际容量5. 聚沉(coagulation)是指在聚沉剂的作用下,溶液中的蛋白质相互聚集为较大在聚沉物(>1mm)的过程•常见的聚沉剂:无机盐类(如氯化锌、氯化铁、氯化铝、硫酸锌、硫酸铝),聚合无机盐(聚合铝、聚合铁等)•聚沉条件:-20℃以下,pH3~6,较高离子强度,高多价金属离子(Fe3+、Al3+)6. 絮凝(flocculation)是指在絮凝剂的作用下,通过吸附、交联、网捕,把蛋白质聚结为大絮体沉降的过程•常见的絮凝剂:淀粉、树脂、单宁、离子交换树脂及纤维素衍生物•絮凝作用一般在聚沉作用之后使用;絮凝剂的选择应根据成本、毒性等具体情况考虑;应通过试验筛选获得最适合的絮凝剂类型、用量及作用条件7、盐溶:蛋白质在稀盐溶液中,溶解度会随着盐浓度的增高而上升8、盐析:但当盐浓度增高到一定数值时,其溶解度又逐渐下降,直至蛋白质析出9、透析:利用小分子能通过,而大分子不能透过半透膜的原理,把不同性质的物质彼此分开的一种方法。
对于蛋白质样品,透析过程中因蛋白质分子体积很大,不能透过半透膜,而溶液中的无机盐小分子则能透过半透膜进入水中,因此不断更换透析用水即可将蛋白质与无机盐小分子物质完全分开。
蛋白的分离纯化过程中常用此法脱去无机盐(如硫酸铵)10、排阻极限:指不能进入凝胶颗粒内部网孔的最小蛋白的分子量11、凝胶颗粒的分级范围:指能进入凝胶颗粒内部网孔的最大分子和最小分子的分子量范围12、过滤:利用多孔介质(滤纸、滤膜等)阻截大的颗粒物质,而使小于孔隙的物质通过的一种的分离方法。
主要用于悬浮液的分离,最简单、最常用13、离子交换剂的电荷密度:指IE介质颗粒单位表面积的功能基团数量,它决定着离子交换剂的总交换容量14、离子交换剂膨胀度(吸水值):指干态的离子交换剂在水溶液中吸水后造成的体积膨胀程度。
用每克干离子交换剂吸水膨胀后的体积表示(ml/g)15、梯度洗脱:进行梯度洗脱时,洗脱缓冲液的pH或离子强度是连续发生变化的,洗脱剂的洗脱能力也是连续增加的16、阶段洗脱:指在一个时间段内用一固定pH或I的条件进行洗脱,而在下一个时间段内用另一固定pH或I的条件进行洗脱的分段式洗脱方式也分为pH阶段洗脱和I阶段洗脱17、亲和层析:利用蛋白质与其专一性配体之间的特异性生物学亲和力作用,对蛋白质进行分离纯化的层析技术。
18、等电聚焦电泳:利用不同蛋白质的等电点的不同而使其在pH梯度中相互分离的一种电泳技术。
等电聚焦过程中,蛋白质分子在一个连续而稳定的线性pH梯度中电泳,结果导致每种蛋白质分子迁移到等于其pI的pH处(此时蛋白质分子的净电荷为零),最终聚集形成一个很窄的蛋白区带。
19、双向电泳(2-dimension Electrophoresis,2-DE)是样品经第一向电泳后,再在垂直方向上进行第二向其他类型电泳的电泳方式。
目前的双向电泳一般是:第一向为等电聚焦(IEF),第二向为SDS-PAGE20、蛋白质印迹(Western Blotting)是指把从电泳或层析分离得到的蛋白质转移到固定介质上后,再利用特异性“探针”(抗体)检测固定介质上的特定蛋白质的方法。
它能更有效地分析电泳结果21、免疫电泳(immune electrophoresis)是基于以及抗原与抗体的特异性免疫沉淀反应而应用的一项电泳技术22、毛细管电泳(CE):是以毛细管为分离通道,以高压直流电场为驱动力的一类新型液相分离技术简答1. 超滤法浓缩蛋白样品的基本原理?优点?局限性?基本原理:选择合适孔径的超滤膜,在离心力或较高压力下,使水分子和其他小分子物质通过超滤膜,而目标蛋白样品分子被截留不能通过超滤膜,从而增加蛋白样品浓度,达到浓缩效果的方法优点:超滤浓缩技术的优点是操作简便,不需添加任何化学试剂,实验条件温和,而且不引起温度、pH的变化,因而可以防止蛋白质分子的变性、失活。
在蛋白质分子的制备技术中,超滤除用于浓缩外,还可用于蛋白样品的脱盐和脱水局限性:不能直接得到蛋白干粉制剂。
对于蛋白质溶液,一般最终只能浓缩到10~50%的浓度2. 判断已知等电点的蛋白质,在不同PH值溶液中的带电性3. 手动加样法的具体操作填装好的凝胶柱经平衡后,用胶头滴管吸取柱床上层部分多余洗脱液,待洗脱液下降至近床表面2-3mm时,关闭柱出口(注意不能使洗脱液全部流干);用胶头滴管吸取一定体积的样品液后,贴柱内壁旋转缓缓加入,以防加样过快导致凝胶床面表面受损;加样完毕后,打开柱出口,让样品液缓慢渗入凝胶床内;当样品液面恰与凝胶床表面持平时,贴内壁小心加入几毫升洗脱液冲洗内部,并使洗脱液高出凝胶床表面2-3cm,即可进行恒流洗脱。
4. 手动装柱,如何检测装柱质量a、对光检查。
对光肉眼观察装填平衡好的凝胶柱,柱内凝胶应均匀、无纹路、无气泡b、可通过加样易于观测的有色物质进行洗脱(如蓝色葡聚糖-2000、血红蛋白等),来观察洗脱过程中中色带下降均匀与否,判断装柱质量。
如果色带歪曲弥散,则需重新装柱。
5、离子交换剂按功能基团类型不同可分为?强阳离子交换剂(强酸型)弱阳离子交换剂(弱酸型)强阴离子交换剂(强碱型)弱阴离子交换剂(弱碱型)6、疏水作用层析分离蛋白质混合物的基本原理?疏水作用层析(HIC)是利用不同蛋白质分子表面疏水性的差别,来分离蛋白质混合物的一种层析技术蛋白质分子表面常常暴露着一些疏水性基团,这些疏水性基团可以与疏水层析的固定相发生疏水性相互作用(疏水作用力)而结合7、共价层析分离含半胱氨酸的蛋白或多态混合物的基本原理?共价层析是利用固定相与目标蛋白分子之间共价键的先形成、后断裂过程来实现目标蛋白从混合样品中分离的层析方法。
要求在温和的条件下,既能与固定相形成稳定的共价键,又能在释放蛋白时不破坏蛋白的活性,蛋白质分子中通常只有巯基基团能满足这一要求因此,共价层析主要用于分离和纯化含巯基(即含半胱氨酸)的蛋白质或多肽8、离子交换层析分离效果用分辨率(RS)来描述,分辨率的定义?决定因素?RS定义为两个洗脱峰峰顶对应的洗脱体积(VR或Ve)之差比上两峰在基线上峰宽之和的平均值。
一个IEC系统能够达到的RS取决于该系统的三个层析参数:容量因子、柱效率和选择性。
k′——容量因子(保留因子)N——柱效率(即理论塔板数)——选择性9、凝胶过滤层析特点?用途?特点:(1)介质不带电荷,不溶于水,亲水性好,具化学惰性,不与被分离蛋白发生化学反应,分离条件温和,不会使蛋白变性失活(2)分离效率高,回收率较高(3)广泛应用于蛋白质混合物的分离纯化,脱盐等(4)一般采用细长柱(5)经过凝胶过滤层析分离后样品将被稀释,因此上样前需对样品进行浓缩用途:(1)蛋白质样品的脱盐及缓冲液更换蛋白质与盐的分子量差异较大,选用交联度高的介质(如Sephadex G-25),使蛋白质不能进入凝胶颗粒内部网孔,先流出层析柱,而盐分子能进入,后流出层析柱层析过程的洗脱中可使用需更换的缓冲液,从而在脱盐的同时达到将样品的缓冲液也进行更换的目的(2)蛋白质的分级分离应用不同蛋白分子量的差异进行分离,凝胶介质和蛋白质之间不发生任何作用,所以层析过程能不改变蛋白的生物学活性。
凝胶过滤层析通常用在离子交换层析或亲和层析之后,用以进一步分离纯化目的蛋白(3)蛋白质分子量的测定10、描述聚丙烯酰胺的电泳(PAGE)中考马斯亮蓝染色法以及银染法原理?考马斯亮蓝染色法原理:在酸性条件下,蛋白质与考马斯亮兰R-250结合形成蓝色复合物(595nm处最大吸收峰),蓝色的深浅与蛋白质浓度成正比关系银染法原理:银染时蛋白条带上的AgNO3被还原成金属Ag,沉积在蛋白条带上而显色显色方法分为化学显色和光显色11、常规PAGE和SDS-PAGE使用试剂最主要的差别是?后者加入去垢剂SDS烷基硫酸钠和强还原剂β-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)12、SDS-PAGE分离蛋白质混合物的原理?去垢剂SDS十二烷基硫酸钠,CH3(CH2)11OSO3Na,破坏蛋白质分子的氢键和疏水键,并与之结合形成SDS-蛋白质复合物;强还原剂β-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT),破坏蛋白分子二硫键结果导致:SDS-蛋白复合物带上大量负电荷,且不同蛋白质有着相同的荷质比(SDS与多数蛋白质的结合比为1.4g SDS/1g 蛋白质)蛋白分子变成椭圆棒状,不同的蛋白分子无形状差别,棒的长度与其分子量成正比因此,对于SDS-PAGE,蛋白质的迁移率仅与分子量有关。
电泳过程中蛋白质天然构象被破坏,生物学活性丧失问答题1、蛋白质的沉淀法:优点?局限性?常用的沉淀法有哪几种?优点:所需设备简单,操作方便,在蛋白质纯化的初期,可以加速减少样品体积,起到浓缩的作用,便于后续的纯化降低纯化成本;还可以尽快将目的蛋白与杂质分开提高目的蛋白的稳定性;通过该方法,目的蛋白的回收率提高局限性:由于沉淀法对提高蛋白质纯度的幅度比较有限,该法常只用于蛋白质的初步纯化常用方法:有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、结晶等电点聚乙二醇沉淀法选择沉淀方法时,需要考虑沉淀剂对目的蛋白质的蛋白质稳定性的影响,沉淀剂的成本及操作的难易程度、沉淀剂的去除及残留、目的蛋白的纯度要求及收率。
2、蛋白质样品的浓缩方法?基本原理分别是?•沉淀:蛋白质在水中的溶解度受蛋白质分子表面疏水性和亲水性带电基团分布的影响,这些基团与水溶液的离子相互作用,通过改变pH和离子强度,加入有机溶剂或多聚物,可以促进蛋白质分子聚集,形成蛋白质沉淀,通过离心或过滤可以获得沉淀物,然后利用合适的缓冲液清洗,溶解沉淀物,在经过透析或凝胶过滤,除去残留溶剂成分•吸附:吸收水和小分子,当凝胶完全膨胀后,用过滤或离心方法除去凝胶,分离出蛋白质样品,适用于稳定性较差的蛋白质。
•超过滤:在离心力和较高压力下,选择适应孔径的半透膜,从而使水和其他小分子透过半透膜,而所需的蛋白质不能透过膜。
•双水相分离法:利用两种多聚物或多聚物与盐在水中的不相容性,可以从细胞破碎后的细胞碎片中直接分离纯化蛋白质,同时起到浓缩作用。