蛋白质纯化试题整理

名词解释

1. 截留分子量(molecular weight cut-off, MWCO)：不能通过膜的最小分子量

2. 超滤：选择合适孔径的超滤膜，在离心力或较高压力下，使水分子和其他小分子物质通过超滤膜，而目标蛋白样品分子被截留不能通过超滤膜，从而增加蛋白样品浓度，达到浓缩效果的方法

3、陶南效应：离子交换剂表面pH与溶液pH是不一致的。在阳IE表面的微环境中，H＋被吸引而OH－被排斥，交换剂表面pH比周围低1个pH单位；而阴IE表面的微环境中，H＋被排斥，交换剂表面pH比周围高1个pH单位

4、离子交换剂的有效（实际）交换容量：指在一定的实验条件下，每克干介质或每毫升湿胶吸附蛋白质的实际容量

5. 聚沉（coagulation）是指在聚沉剂的作用下，溶液中的蛋白质相互聚集为较大在聚沉物（＞1mm）的过程

•常见的聚沉剂：无机盐类（如氯化锌、氯化铁、氯化铝、硫酸锌、硫酸铝），聚合无机盐（聚合铝、聚合铁等）

•聚沉条件：-20℃以下，pH3~6，较高离子强度，高多价金属离子（Fe3+、Al3+）

6. 絮凝（flocculation）是指在絮凝剂的作用下，通过吸附、交联、网捕，把蛋白质聚结为大絮体沉降的过程

•常见的絮凝剂：淀粉、树脂、单宁、离子交换树脂及纤维素衍生物

•絮凝作用一般在聚沉作用之后使用；絮凝剂的选择应根据成本、毒性等具体情况考虑；应通过试验筛选获得最适合的絮凝剂类型、用量及作用条件

7、盐溶：蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随着盐浓度的增高而上升

8、盐析：但当盐浓度增高到一定数值时，其溶解度又逐渐下降，直至蛋白质析出

9、透析：利用小分子能通过，而大分子不能透过半透膜的原理，把不同性质的物质彼此分开的一种方法。对于蛋白质样品，透析过程中因蛋白质分子体积很大，不能透过半透膜，而溶液中的无机盐小分子则能透过半透膜进入水中，因此不断更换透析用水即可将蛋白质与无机盐小分子物质完全分开。蛋白的分离纯化过程中常用此法脱去无机盐（如硫酸铵）

10、排阻极限：指不能进入凝胶颗粒内部网孔的最小蛋白的分子量

11、凝胶颗粒的分级范围：指能进入凝胶颗粒内部网孔的最大分子和最小分子的分子量范围

12、过滤：利用多孔介质（滤纸、滤膜等）阻截大的颗粒物质，而使小于孔隙的物质通过的一种的分离方法。主要用于悬浮液的分离，最简单、最常用

13、离子交换剂的电荷密度：指IE介质颗粒单位表面积的功能基团数量，它决定着离子交换剂的总交换容量

14、离子交换剂膨胀度（吸水值）：指干态的离子交换剂在水溶液中吸水后造成的体积膨胀程度。用每克干离子交换剂吸水膨胀后的体积表示（ml/g）

15、梯度洗脱：进行梯度洗脱时，洗脱缓冲液的pH或离子强度是连续发生变化的，洗脱剂的洗脱能力也是连续增加的

16、阶段洗脱：指在一个时间段内用一固定pH或I的条件进行洗脱，而在下一个时间段内用另一固定pH或I的条件进行洗脱的分段式洗脱方式

也分为pH阶段洗脱和I阶段洗脱

17、亲和层析：利用蛋白质与其专一性配体之间的特异性生物学亲和力作用，对蛋白质进行分离纯化的层析技术。

18、等电聚焦电泳：利用不同蛋白质的等电点的不同而使其在pH梯度中相互分离的一

种电泳技术。等电聚焦过程中，蛋白质分子在一个连续而稳定的线性pH梯度中电泳，结果导致每种蛋白质分子迁移到等于其pI的pH处（此时蛋白质分子的净电荷为零），最终聚集形成一个很窄的蛋白区带。

19、双向电泳（2-dimension Electrophoresis，2-DE）是样品经第一向电泳后，再在垂直方向上进行第二向其他类型电泳的电泳方式。目前的双向电泳一般是：第一向为等电聚焦（IEF），第二向为SDS-PAGE

20、蛋白质印迹（Western Blotting）是指把从电泳或层析分离得到的蛋白质转移到固定介质上后，再利用特异性“探针”（抗体）检测固定介质上的特定蛋白质的方法。它能更有效地分析电泳结果

21、免疫电泳（immune electrophoresis）是基于以及抗原与抗体的特异性免疫沉淀反应而应用的一项电泳技术

22、毛细管电泳（CE）：是以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力的一类新型液相分离技术

简答

1. 超滤法浓缩蛋白样品的基本原理？优点？局限性？

基本原理：选择合适孔径的超滤膜，在离心力或较高压力下，使水分子和其他小分子物质通过超滤膜，而目标蛋白样品分子被截留不能通过超滤膜，从而增加蛋白样品浓度，达到浓缩效果的方法

优点：超滤浓缩技术的优点是操作简便，不需添加任何化学试剂，实验条件温和，而且不引起温度、pH的变化，因而可以防止蛋白质分子的变性、失活。在蛋白质分子的制备技术中，超滤除用于浓缩外，还可用于蛋白样品的脱盐和脱水

局限性：不能直接得到蛋白干粉制剂。对于蛋白质溶液，一般最终只能浓缩到10~50％的浓度

2. 判断已知等电点的蛋白质，在不同PH值溶液中的带电性

3. 手动加样法的具体操作

填装好的凝胶柱经平衡后，用胶头滴管吸取柱床上层部分多余洗脱液，待洗脱液下降至近床表面2-3mm时，关闭柱出口（注意不能使洗脱液全部流干）；用胶头滴管吸取一定体积的样品液后，贴柱内壁旋转缓缓加入，以防加样过快导致凝胶床面表面受损；加样完毕后，打开柱出口，让样品液缓慢渗入凝胶床内；当样品液面恰与凝胶床表面持平时，贴内壁小心加入几毫升洗脱液冲洗内部，并使洗脱液高出凝胶床表面2-3cm，即可进行恒流洗脱。

4. 手动装柱，如何检测装柱质量

a、对光检查。对光肉眼观察装填平衡好的凝胶柱，柱内凝胶应均匀、无纹路、无气泡

b、可通过加样易于观测的有色物质进行洗脱（如蓝色葡聚糖-2000、血红蛋白等），来观察洗脱过程中中色带下降均匀与否，判断装柱质量。如果色带歪曲弥散，则需重新装柱。

5、离子交换剂按功能基团类型不同可分为？

强阳离子交换剂（强酸型）弱阳离子交换剂（弱酸型）强阴离子交换剂（强碱型）弱阴离子交换剂（弱碱型）

6、疏水作用层析分离蛋白质混合物的基本原理？

疏水作用层析（HIC）是利用不同蛋白质分子表面疏水性的差别，来分离蛋白质混合物的一种层析技术

蛋白质分子表面常常暴露着一些疏水性基团，这些疏水性基团可以与疏水层析的固定相发生疏水性相互作用（疏水作用力）而结合

7、共价层析分离含半胱氨酸的蛋白或多态混合物的基本原理？