细胞培养污染及排除42页PPT
细胞培养污染简介ppt课件
3，支原体污染
3.1，支原体污染是目前实验室中最为常见的污染细胞的原核生物。 因支原体属于直径介于0.2左右的最小原核生物，形态易变，故极
易通过滤膜而逃过培养液的过滤除菌步骤。在细胞培养液中，支原体 可达到107-108CFU/mL （CFU=Colony Forming Unit，支原体浓度测量 单位）而不使培养液混浊及影响细胞生长。多种支原体对细胞不产生 任何病变效应，使得细胞污染不易被察觉。据报道，目前世界上有3050%的细胞株已受支原体污染。但是支原体对干细胞培养的影响甚大， 胚胎干细胞受支原体污染形态、生长速度等均出现改变。
超过400种细胞系已被鉴定为错认的细胞系
防止细胞交叉污染
（1）在进行多种细胞培养操作时，所用器具要严格区分， 最好做上标记便于辨别。并严格按顺序进行操作，避免一 起进行操作时易发生混乱。
（2）在进行换液或传代操作时，注射器和滴管不要触及细 胞培养瓶瓶口，以免把细胞带到培养液中污染其他细胞。
（3）所有细胞一旦购置，或从别处引入，或自己建立，均 应及早留种冻存，一旦发生污染可弃之，重新复苏留种细 胞进行培养。
4，内毒素污染
4.1， 细菌内毒素对培养物的危害： 实验证明，细菌内毒素对培养细胞（尤其是ES细胞）的生长及活性 具有明显的抑制作用,且该作用具有一定的时间、剂量依赖性。
4.2，细胞培养中内毒素的来源： 细胞培养基中的主要天然成份---牛血清包括胎牛血清和新生牛血 清是内毒素的潜在来源。我国2000年版《中国生物制品主要原辅料 质控标准》中对牛血清提出比较严格的标准要求。包括蛋白质含量， 细菌、真菌、支原体、牛病毒、大肠杆菌噬菌体、细菌内毒素，支 持细胞增殖检查等等。对于胚胎干细胞培养，LIF和bFGF是细菌内 毒素的另一个潜在来源。
细胞培养技术培训ppt课件版
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
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见的是贴附于平面支持物细胞。在一般光镜下 生存中的细胞是均质而透明的，结构不明显。
细胞在生长期常有1-2个核仁，在细胞机能 状态不良时，细胞轮廓会增强，反差增大。
若胞质中时而出现颗粒、脱滴和腔泡等， 表明细胞代谢不良。
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倒 置 显 微 镜
back
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液 氮 罐
back
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第三章细胞污染的检测与排除ppt课件
３．支原体污染
支原体是细胞培养中最常见、不易被察觉和干扰实验结果的 一种污染。
支原体一般过滤除菌无法去除，开始不易发现，能在偏碱条 件(pH7.6～8.0)下生存，对青霉素有抗药性。多吸附于细胞表 面或散在于细胞之间。培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞 可见。
细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细 胞污染后无明显变化，或略有变化，
细胞污染:
凡混入培养环境中对细胞生存有害的成分和造 成细胞不纯的异物，都应视为污染。
污染
微生物的污染 化学物质污染
Байду номын сангаас
细菌 霉菌 支原体 病毒
不同细胞类型的交叉污染
污染途径：
１．空气:
培养设施不宜置于通风场所； 定期清理净化工作台的过滤层，防止阻塞； 操作中应减少空气流动；带口罩； 夏季潮湿季节空气中含菌数量多，每立方米内含菌数不应超过1～ 5个。
５．组织
初代培养组织常有污染；有的是在手术中污染，有的本身可 能是被污染的组织(如已经发生溃烂的肿瘤组织)；手术用碘酒消 毒后，擦拭不净可能混入碘污染
污染对细胞的影响
在细胞受有害物污染时间短、污染程度轻、并能及 时排除污染物的情况下，细胞有可能恢复。
当污染物持续存在于培养环境中时，轻者细胞增殖 生长缓慢、分裂相减少、细胞变得粗糙、细胞轮廓增 强，重者细胞停止增殖，分裂相消失，细胞质中出现 大量堆积物，细胞变圆或崩溃从瓶壁脱落。
1．细菌污染：
细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使在细胞培养液中 加入了抗菌素(一般为预防剂量)，也可能因为操作不慎而引起污染。
细菌污染后大多能改变培养液pH使培养液变混浊，毒性大的细 菌很快导致细胞崩解死亡。
加用抗生素的培养用液一般可预防和排除个别少量细菌的污染。
细胞培养污染及排除)
(c) Mold
Monilia (念珠菌污染 )
Burkholderia cepacia （洋葱佰克霍尔德菌）
pituitary tumor, fungus(垂体瘤原代培养真菌污染 )
（三）支原体污染
• 支原体是一种介于细菌和病毒之间、能独 立生活的最小微生物，无细胞壁，形态呈 多形形，最小0.2um，可以通过过滤器。
(d) Mycoplasma
e&f Scanning electron micrograph of mycoplasma growing on the Surface of cultured cells
（四）细胞交叉污染
• 细胞间交叉污染能使细胞的生长特性、形 态特征等发生变化，有些变化较轻、不易 察觉，有些可能由于污染的细胞具有生长 优势最终压过原来细胞而导致细胞的生长 抑制，最终死亡。
• 购买的各种血清中常含有支原体。 • 支原体是细胞培养中最常见的、干扰试验
结果的一种污染。
支原体污染的判定方法
• 细胞污染支原体后，并不发生死亡，支原 体可以与细胞长期共存，培养基一般不发 生浑浊，细胞无明显变化，外观正常。所 以单从细胞形态上判定不易。
• 判定支原体污染，通常是在细胞生长总体 状态不佳，且排除了其他污染的情况下， 进行怀疑判定。
• 主要包括：
❖ 超净台内放置的所有培养瓶瓶口不能与风向相 逆
❖ 不允许用手触及器皿的无菌部分 ❖ 在安装吸管冒、开启或封闭瓶口操作时要经过
酒精灯烧灼，并在火焰附近工作 ❖ 吸取培养液、细胞悬液等液体时，应专管专用
❖ 使用培养液前，不宜较早开启瓶口，开瓶后的 培养瓶应保持斜位，避免直立
❖ 不再使用的液体应立即封口 ❖ 培养的细胞在处理之前不要过早的暴露空气中 ❖ 操作时不要交谈、咳嗽，以防唾沫和呼出气流
CELL-污染与排除
3.操作过程中的预防 3.操作过程中的预防
不宜过早开瓶；开瓶后瓶口不能与风向相逆，保持斜立， ① 不宜过早开瓶；开瓶后瓶口不能与风向相逆，保持斜立， 不再使用的培养液应立即封闭瓶口, 不再使用的培养液应立即封闭瓶口,不允许触及器皿的 无菌部分（瓶口及瓶塞内侧）； 无菌部分（瓶口及瓶塞内侧）； ② 开启及关闭瓶口时注意火焰烧灼及火焰附近工作； 开启及关闭瓶口时注意火焰烧灼及火焰附近工作； 应专管专用； ③ 应专管专用； 培养的细胞勿过早暴露于空气中； ④ 培养的细胞勿过早暴露于空气中； 操作时不准交谈、咳嗽； ⑤ 操作时不准交谈、咳嗽； 操作完毕应整理好工作台面，并消毒擦拭工作面， ⑥ 操作完毕应整理好工作台面，并消毒擦拭工作面，关闭超 净工作台。 净工作台。
三.操作 器材和溶液使用前未仔细检查是否污染过 ； 吸管、刀、剪沾染微生物； 瓶口封不严； 培养两种以上细胞，使用同一吸管或营养液。 四.血清 被支原体和病毒污染。
五. 组织
手术中污染； 组织本身带菌； 用碘酒后擦拭不净造成碘污染。
第二节 污染对细胞的影缓慢、分裂相减少、粗糙、轮廓增强。 停止增殖，分裂相消失， 停止增殖，分裂相消失，胞质中出现大量堆 积物，变圆或崩溃从瓶壁脱落。 积物，变圆或崩溃从瓶壁脱落。 污染物不同，对细胞的影响不同。 污染物不同，对细胞的影响不同。
真菌污染
（二）细菌污染
培养液变黄，混浊； 以内很明显; 培养液变黄，混浊；48h以内很明显 细胞很快 以内很明显 崩解死亡。 崩解死亡。 镜下可见菌体。 镜下可见菌体。 污染后细胞发生病理改变， 胞内颗粒增多、 污染后细胞发生病理改变 ， 胞内颗粒增多 、 增 最后变圆脱落死亡， 粗 ， 最后变圆脱落死亡 ， 造成试验失败和细胞 株(系)丢失。 系 丢失。 丢失
细胞培养污染及控制PPT课件
支原体
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5．培养检测
• （1）将2.5×109/L细胞悬液5mL加入45mL支原体肉汤培养基（Sigma或北京生物制品 所生产的均可），培养14天后观察肉汤培养有无雾状沉淀。
• （2）然后取0.5ml加入已冷却到50℃的培养基中，再用琼脂培养基做分离培养。 • （3）37℃培养3天观察有无“荷包蛋”菌落出现。
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1．使用抗生素
• 抗生素对杀灭细菌较有效。联合用药比单独用药效果好。预防用药比污染后再用 药效果好。预防用药一般用双抗生素(青霉素100u/mL加链霉素100μg/mL)，污染 后清除用药需采用大于常用量5～10倍的冲洗法，于加药后作用24～48小时，再换 常规培养液。
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• 细胞培养中污染来源主要有以下五条途 径：不洁的动物组织标本、空气、清洗消毒、操作、血
清
• 1、不洁的动物组织标本
• 很多动物组织本该是无菌的(直接与外界相通的呼吸道和消化道、泌尿系统除外)，但 由于取材时不小心也会有污染的机会。组织本身含有细菌，如取材时不用浓的抗生素 洗液洗涤浸泡，也会带菌，造成细胞污染。
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3．荧光染色法观察
• （1）用支持物盖片培养法将细胞接种在盖片上， 在细胞汇合前（即未长满前）取出玻片，于碟皿中。
• （2）用不含酚红的Hanks液漂洗，1:3醋酸甲醇固 定10min
• （3）用生理盐水漂洗后置于50μg/mL的Hoechst 33258 (生理盐水配制)中染色10min。
3.过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式； 4.细胞流通间缺乏物品管理，造成实验室间的相互污染； 5.研究或操作人员忽略污染问题； 6.已受污染的细胞； 7.已受污染的培养基、血清。
细胞培养常见污染
整理总结：细胞培养中的第一大害——————————污染★★★lwf991229(金币+3,VIP+0):不错,很详细,不过有的图片打不开~~污染是细胞培养第一大害！预防和避免污染是细胞培养成功的关键之一。
小木虫还没有相关帖子，故而整理和虫子们分享，让我们一起来繁荣小木虫，虫子们觉得好请顺手回个贴！本页图片太多，个别打不开请刷新一下就好了。
细胞污染的类型一、细菌污染细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染。
一开始就要十分重视，防止污染，否则会前功尽弃，不仅浪费时间，而且浪费人力、物力，甚至造成无法弥补的损失。
即使在细胞培养液中加入了抗菌素(一般为预防剂量)，也可能因为操作不慎而引起污染。
最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。
培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变而呈现黄色。
也有的培养液肉眼观察无多少改变，只能在镜下发现菌体才知污染。
所以，每天应仔细观察。
污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡，造成试验失败和细胞株(系)丢失。
一般细菌污染进程很快，大约污染一两天后肉眼就能显著观察到。
二、真菌污染真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，尤其在霉雨季节进行细胞培养更易污染。
最常见的真菌有烟曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。
培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在生长，培养液一般不发生混浊；倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。
念珠菌和酵母菌呈卵圆形散在细胞周边和细胞之间（发生卵圆形物体污染的几率很大）。
个体细小，有增多趋势。
镜下看时，要将培养瓶用酒精棉球擦干净，以防止与瓶外尤其瓶底外面生长的菌丝相混淆。
真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。
三、支原体污染支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物，最小直径0.2μm，一般过滤除菌无法去除它，光镜下难以看清它的形态结构。
细胞污染的检测与去除
第二章 动物细胞培养第四节 细胞污染的检测与去除细胞培养最怕的就是细胞污染。
一旦细胞发生污染，轻的，导致实验无法正常进行，严重的，可能会导致细胞株的丢失。
细胞污染：是指细胞培养物中混入培养环境中的对细胞生存有害的成分或造成细胞不纯的异物。
细胞污染的主要途径有：1）空气因素：空气是微生物传播的最主要途径。
在超净工作台、细胞培养室工作时，不戴口罩，不带头套，面对操作间大声讲话、咳嗽等均可能造成细胞污染。
2）器材因素：主要是细胞培养用器材清洗消毒不彻底，致使污染物残留；培养箱没有定期消毒，易使细菌、霉菌孽生，形成污染。
3）操作因素：实验操作者无菌观念不强、操作不规范、甚至使用污染的器具等。
培养两种以上细胞时，交叉使用吸管或培养液瓶等导致细胞交叉污染。
4）血清或培养基：有些血清生产时已被支原体或病毒等污染，有的在培养基配制过程中已经污染，或者在培养基的存放过程中导致了污染。
5）组织样本：尤其在进行原代培养时，组织样本可能带菌，导致污染。
细胞污染的主要类型有（图1）：图1 细胞污染的主要类型第一，细菌污染：细菌是细胞培养中最常见的污染。
细菌种类繁多，形态多样，可呈球状、杆状和螺旋状。
因为细菌的繁殖速度快，被污染后，往往一天内即可通过肉眼观察发现，pH值也会突然降低，培养基的颜色也会很快变化，培养液会变浑浊。
轻微细菌污染的去除: 可使用5-10倍常用抗生素剂量的冲击法，加抗生素作用24-28 h，再换成常规培养液，有时可排除污染，但大部分细胞培养的细菌污染发现时就已经很严重了，无法挽救，最好直接丢弃，防止污染的扩大。
细胞培养细菌污染的主要检测方法有：肉眼观察法；培养检查法；显微镜观察法；PCR检测法等。
1）肉眼观察法：（图2），如图，这是正常生长细胞在不同时间的培养基的颜色，污染细胞培养基会变得浑浊，培养基会快速变黄（因大量细菌繁殖会导致pH 快速下降）。
刚传代细细胞培养中需要传代的细图2 正常生长细胞培养基的颜2）培养检查法：就是用细胞培养上清在无菌琼脂糖培养基平板上划线培养，37℃培养箱中培养过夜，看是否有细菌菌落长出（图3）。
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细胞培养污染及排除4、守业的最好办法就是不断的发展。 5、当爱不能完美，我宁愿选择无悔，不管来生多么美丽，我不愿失 去今生对你的记忆，我不求天长地久的美景，我只要生生世世的轮 回里有你。
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29、勇猛、大胆和坚定的决心能够抵得上武器的精良。——达·芬奇
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30、意志是一个强壮的盲人，倚靠在明眼的跛子肩上。——叔本华
谢谢！
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