线虫分子鉴定
松材线虫病分子检测鉴定技术规程
松材线虫病分子检测鉴定技术规程松材线虫病是由松材线虫引起的一种严重的林木病害，对林业生产造成了严重的危害。
为了及时发现和控制松材线虫病，科研人员开发了分子检测鉴定技术，以提高病害的检测效率和准确性。
下面将介绍松材线虫病分子检测鉴定技术规程。
1. 样品采集和处理。
首先，需要采集受感染的树木或土壤样品作为检测的对象。
对于树木样品，可以选择受感染的树皮、树脂或树液作为检测样品；对于土壤样品，可以选择受感染树木周围的土壤作为检测样品。
采集的样品需要进行处理，如粉碎或提取DNA等操作，以便后续的分子检测。
2. DNA提取。
从样品中提取松材线虫的DNA是分子检测的关键步骤。
常用的DNA提取方法包括CTAB法、酚/氯仿提取法等。
提取的DNA需要经过纯化和浓缩处理，以保证后续的PCR反应的准确性和灵敏度。
3. PCR扩增。
PCR（聚合酶链式反应）是分子检测中常用的技术手段，可以扩增目标DNA序列，从而进行检测和鉴定。
设计特异性引物对松材线虫的DNA进行扩增，以获得特异性的PCR产物。
4. 凝胶电泳分析。
通过凝胶电泳分析PCR产物，可以判断样品中是否存在松材线虫的DNA。
在凝胶电泳中，目标DNA序列会呈现特异的条带，从而进行鉴定和分析。
5. 数据分析与结果判读。
最后，对凝胶电泳分析的结果进行数据分析和结果判读。
根据PCR产物的大小和特异性条带的出现，可以判断样品中是否存在松材线虫的DNA，从而进行病害的鉴定和诊断。
总之，松材线虫病分子检测鉴定技术规程是一项重要的技术手段，可以提高对松材线虫病的检测效率和准确性。
通过标准化的操作流程和技术规程，可以有效地应用于病害的监测和防控工作中，为林业生产提供有力的技术支持。
鸢尾种苗中截获的草莓滑刃线虫形态和分子鉴定
鸢尾种苗中截获的草莓滑刃线虫形态和分子鉴定草莓滑刃线虫（Aphelenchoides fragariae）是一种广泛分布于世界各地的植物寄生线虫，主要危害草莓等莓科作物。
近年来，草莓滑刃线虫在我国草莓种植中也逐渐成为了一种重要的害虫。
其中，鸢尾作为草莓滑刃线虫的重要的寄主植物之一，容易成为草莓滑刃线虫的传播源。
因此，对于鸢尾种苗中的草莓滑刃线虫进行形态和分子鉴定，对于草莓生产的病虫害防治具有重要的意义。
一、线虫形态鉴定草莓滑刃线虫体长约0.5-0.7mm，头部呈锥形，末端略微弯曲，口唇环或钩状特化。
躯干前两节皮肤皱褶明显，中部薄壳层，末端肛门开在体背面。
尾部末端渐尖或圆钝。
相对其他线虫而言，草莓滑刃线虫体形短而粗，尾部较短，体色略淡。
形态鉴定可用显微镜观察线虫形态特征。
由于形态鉴定的精准度受到草莓滑刃线虫形态异质性较大的限制，因此，在实际检测中，应该结合分子鉴定技术进行线虫鉴定。
分子鉴定主要包括PCR扩增和基因测序两个步骤。
（1）PCR扩增从鸢尾种苗中分离提取纯化线虫DNA，并扩增16S rDNA和18S rDNA嵌合子基因。
PCR 反应体系为：模板DNA 1 μL、10×PCR缓冲液 5 μL、25mmol/L MgCl2 2 μL、2.5mmol/L dNTPs混合液 4 μL、10μmol/L引物mix 1 μL、Taq DNA聚合酶2 U、ddH2O至总体积50 μL。
PCR反应条件为：预变性1次（94℃，5min），32个循环（94℃，30s；58℃，30s；72℃，1min）、1次末端延伸（72℃，10min）、终止降温保存（4℃）。
（2）基因测序核苷酸序列扩增后，将PCR产物分离纯化后送至生物科技公司进行基因测序。
测序成功后，通过测序结果对草莓滑刃线虫的物种进行确认。
综上所述，鸢尾种苗中截获的草莓滑刃线虫可以通过形态和分子鉴定进行鉴定。
鉴定过程中，形态鉴定需要借助显微镜观察线虫的形态特征，而分子鉴定则可以通过PCR扩增和基因测序对草莓滑刃线虫的物种进行确认。
线虫的分类鉴定
线虫分类鉴定的应 用
在农业上的应用
检测土壤健康状 况
防治农业害虫
促进土壤微生物 群落的平衡
提高农作物的产 量和质量
在医学上的应用
诊断肠道疾病： 线虫感染是肠道 疾病的常见原因， 通过分类鉴定可 以确诊感染的线 虫种类，为治疗 提供依据。
监测食品安全： 对食品中的线虫 进行分类鉴定， 可以监测食品的 卫生状况，保障 食品安全。
根据寄生部位进 行分类
分类鉴定方法
形态学鉴定：依据线虫的形态特征进行分类鉴定 分子生物学鉴定：利用DNA序列分析等方法进行分类鉴定 生态学鉴定：根据线虫的生态环境和寄主进行分类鉴定 生物化学鉴定：利用线虫的生物化学特征进行分类鉴定
分类鉴定意义
确定生物种类：通过分类鉴定，确定线虫的种类，有助于了解生物多样性和生态系统的结构。
钩虫：寄生于人体 小肠内，引起贫血、 营养不良等，严重 时可导致死亡。
旋毛虫：寄生于人 体肌肉内，引起肌 肉疼痛、发热等症 状，严重时可导致 死亡。
蛔虫：寄生于人体 小肠内，引起腹泻 、腹痛等症状，严 重时可导致营养不 良和肠道疾病。
线虫分类标准
根据形态特征进 行分类
根据生态习性进 行分类
根据遗传关系进 行分类
添加副标题
线虫的分类鉴定
汇报人：XX
目录
PART One
线虫的分类
PART Two
线虫的形态特征
PART Three
线虫的鉴定过程
PART Five
线虫分类鉴定的未 来发展
PART Four
线虫分类鉴定的应 用
线虫的分类
常见线虫种类
杆形线虫：常见的 肠道寄生虫，寄生 于人类和其他哺乳 动物的小肠内，引 起腹泻等症状。
鸢尾种苗中截获的草莓滑刃线虫形态和分子鉴定
鸢尾种苗中截获的草莓滑刃线虫形态和分子鉴定材料与方法
收集样品：本研究选择多处产地的鸢尾种苗作为研究样本，通过浸泡法将根际土壤中的线虫进行提取。
形态鉴定：从提取的线虫样本中取出一定数量进行固定、脱水和制片处理，通过光学显微镜观察线虫体型、口器特征等形态特征。
分子鉴定：采用PCR技术扩增线虫样本中的18S rDNA片段，通过比对GenBank数据库中的序列进行分子鉴定。
结果
形态观察：从鸢尾种苗中截获的滑刃线虫呈细长的体型，身体弯曲呈弓形，头部具有圆锥状的口器，尾部渐细。
线虫的体壁上具有横纹，可以明显区分出滑刃线虫的特征。
分子鉴定：通过PCR扩增得到了线虫样本的18S rDNA片段，测序结果经比对得知，其与GenBank中已知的草莓滑刃线虫序列高度相似，确认了其物种身份。
讨论
本研究结合形态和分子鉴定，对鸢尾种苗中截获的草莓滑刃线虫进行了全面的鉴定。
结果表明，这些线虫样本均为草莓滑刃线虫，其体型和分子特征与已知的草莓滑刃线虫一致。
这说明鸢尾种苗中潜藏的滑刃线虫可能会对草莓种植产生潜在风险，需要引起重视。
结论
鸢尾种苗中截获的草莓滑刃线虫经形态和分子鉴定确认其身份，为草莓种植业提供了重要信息。
建议在鸢尾种苗的生产和销售中加强对线虫的检疫，对可能携带病虫害的鸢尾种苗进行隔离处理，以减少对草莓种植的风险。
加强对草莓栽培地的检疫和管理，及时发现并控制滑刃线虫的侵害，保障草莓的生长和产量。
希望本研究能够为相关领域提供一定的参考价值。
松材线虫检疫鉴定方法
松材线虫检疫鉴定方法
松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）是一种寄生性线虫，可能对松树造成严重危害。
为了及时检测和防治松材线虫的传播，
科学家们发展了一系列松材线虫检疫鉴定方法。
1. PCR技术（聚合酶链式反应）：PCR技术是一种常用的
DNA分子生物学方法，用于检测松材线虫的存在。
该方法可通过
放置松树样品中提取的DNA与松材线虫的特定引物结合，从而扩
增目标DNA。
通过观察PCR反应结果，可以确定松树样品是否受到了松材线虫的感染。
2. 寄主植物检疫：松材线虫主要通过传染松树传播，因此寄主
植物检疫是一种常见的鉴定方法。
检疫人员通常会观察松树的枝干、树干和根系等部位是否存在松材线虫的病征，如褐变、水渗
出等。
同时，他们还会对松树样品进行松材线虫的提取、培养和
鉴定，以确认是否受到感染。
3. 间接检测方法：除了直接检测松树样品中的线虫外，科学家
们还开发了一些间接检测方法来鉴定松材线虫的存在。
例如，可
以利用诱捕树干中的甲醇作为挥发物质，吸引松材线虫进入陷阱。
研究人员还可以观察昆虫等受松材线虫影响的寄生生物，从而推
断松树样品中是否存在线虫。
这些松材线虫检疫鉴定方法的发展为我们及时发现和控制松材线虫的传播提供了有力的工具。
通过采用这些方法，我们能够更准确地识别和确认松树样品中是否存在松材线虫，并及时采取相应的防治措施，以避免松树病害的进一步传播。
鸢尾种苗中截获的草莓滑刃线虫形态和分子鉴定
鸢尾种苗中截获的草莓滑刃线虫形态和分子鉴定摘要：2017年5月，在云南省昆明市一处鸢尾种苗地发现草莓根系上大量线虫危害，经形态鉴定和分子生物学方法鉴定，结合文献资料对该线虫进行了初步鉴定。
结果表明，该线虫形态特征与草莓滑刃线虫(Mesocriconema xenoplax)较为相似，同时通过分子鉴定证实了该线虫的遗传关系。
本研究认为该线虫为草莓滑刃线虫。
本研究结果为我国鸢尾产业的发展提供了重要参考依据。
关键词：线虫；草莓滑刃线虫；形态鉴定；分子鉴定；鸢尾1. 背景草莓是世界上广泛栽培的水果之一，在中国也有广泛栽培，由于其果味酸甜、营养丰富，所以备受人们的喜爱。
草莓的生长环境容易受到多种线虫的侵害，给草莓的生长和品质带来了严重的影响。
草莓滑刃线虫(Mesocriconema xenoplax)是一种主要危害草莓根系的线虫之一。
鸢尾种苗是中国的传统特色花卉之一，在中国的多地都有栽培，同时也出口到世界各地。
鸢尾种苗也容易受到多种线虫的危害，给鸢尾的生产和贸易带来了一定的影响。
对于鸢尾种苗中截获的草莓滑刃线虫进行形态和分子鉴定，对于鸢尾产业的健康发展具有重要意义。
2. 材料与方法2.1 样本采集2017年5月，在云南省昆明市一处鸢尾种苗地点发现草莓根系上有大量线虫危害，为了对这些线虫进行形态和分子鉴定，我们采集了部分感染草莓滑刃线虫的鸢尾根系样本。
所有样本均放置在密封袋中，并用标签记录样本的详细信息。
2.2 形态鉴定我们使用光学显微镜对所采集的线虫样本进行形态观察。
参考相关的线虫形态特征的文献资料，观察线虫的体型、口器、生殖器官等形态特征。
我们拍摄了线虫的形态照片，作为形态鉴定的参考。
2.3 DNA提取和PCR扩增为了进行分子鉴定，我们从样本中提取了线虫的DNA。
我们使用基因组DNA提取试剂盒对样本进行DNA提取，然后使用PCR技术对目标基因进行扩增。
PCR扩增反应的条件为：95℃前变性3 min，然后进行35个循环(95℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min)，最后进行72℃延伸10 min，4℃保存。
一种线虫分子检测方法的建立
一种线虫分子方法检测方法的建立与思考自20世纪50年代以来，分子生物学已然成为当今科技发展的前沿，它给以往的研究内容提供了一种新的方法、新的视角。
线虫的鉴定是当前植物检疫的重要组成部分，分子生物学方法可为其提供一个准确的鉴定方法。
下面我将介绍一种线虫分子方法鉴定的建立过程：
1、依托现有的线虫基因组库，我们可以找到已知线虫种的保守rDNA序列，在大量序列比对设计特异性引物。
如：
2、提取线虫基因组DNA
现在已经可以对单条线虫进行DNA的提取，检测其特异性序列。
南京农业大学徐建华等人2003年建立根结线虫的分子检测方法，彭德良2012年建立旱稻包囊线虫的分子检测方式……
3、特异性引物对不同线虫DNA进行检测，确定其特异性。
最终要求是，此对引物仅可扩增出所检测线虫的特定长度的序列。
思考：
一种线虫的分子鉴定一旦建立，其检测的时间在6小时之内可以完成，并且其灵敏度高（1.5个松木中有一条松材线虫[殷幼平2007]）。
现在对于线虫群体种的发现非常的不足，被测序的线虫更是不足线虫总体的1%，考虑到分子方法要以完备的数据库为基础，所以当前仅使用分子生物学的方法对线虫进行检测和鉴定是有很大的缺陷的。
鉴定线虫，特别是对于检疫性的线虫，生物形态学鉴定与分子鉴定相互结合可以提高检测的准确性和检疫速度。
线虫分子鉴定
，5S rDNA及5．8S rDNA序列较短，大约100150 bp，包含的系统发育信息不多，进化缓慢， 仅适合于纲以上水平的系统发育研究， 目前很 少应用。 18S rDNA区序列较长，大约2 kb，并存在一些 多变区，适合作为科级水平以上的分类依据 28S rDNA区序列比18S rDNA长，大约4—5 kb， 包含的系统发育的信息较多，适合于科和属级 水平以上的系统发育研究。
/
BLAST
BLAST
nucleotide blast
孢囊线虫分子鉴定
线虫是一类低等的无脊椎动物．地球上约１０ 万种，但目前只记载约260属5700多种 包括自由生活线虫（海洋、淡水和土壤中） 危害植物的病原线虫。 几乎所有的农作物都受到植物线虫的寄生。 人类最早发现的是小麦粒线虫（1743年）
唇区
松材线虫病及S区序列最长，大约4～5 kb，属于高 度变化区，适合于种及种下水平的研究， 尤其适合于种的分类签定，但由于序列 过长，全程测序较难，故需结合其它分 子生物学方法进行
ITS 序列是一个多用途的遗传标记,位于 18S 和28S 核糖体DNA基因的重复簇之间, 中间被5.8S 核糖体DNA 基因分开。 受到的选择压力小，在生物种和亚种间 变化较大，可用于属、种及种群水平的 相互关系的研究，用PCR 技术扩增ITS 区，可通过酶切、克隆、测序等来揭示 线虫种间或群体间的差异，从而进行植 物病原线虫种的快速分子鉴定。
检测试剂盒
样品检测
PCR产物 测序
检测体系的优化
探针设计
序列比较， 得差异片段
聚合酶链反应：（polymerase chain reaction, PCR）
原理： 1）引物的设计：合成2个与目的DNA序列两 侧互补的寡核苷酸，一般长约15-25bp。 2）基本条件：引物、DNA前提物质、含有 一定离子（Mg）的反应体系 、DNA聚合酶、 模板。 3）三段循环：变性：93-95℃；复性：5070 ℃;延伸：70-75 ℃ 。n个周期，2n个DNA
线虫的分类鉴定课件
BIG DATA EMPOWERS TO CREATE A NEW
ERA
• 线虫的基本信息 • 线虫的分类方法 • 线虫鉴定技术 • 线虫分类鉴定的应用 • 线虫分类鉴定的发趋势
目录
CONTENTS
01
线虫的基本信息
BIG DATA EMPOWERS TO CREATE A NEW
宏基因组学分析
利用高通量测序技术对线 虫基因组进行分析，了解 线虫的基因组结构和功能 。
04
线虫分类鉴定的应用
BIG DATA EMPOWERS TO CREATE A NEW
ERA
农业线虫病害防治
农业线虫病害是影响农作物生长的重要因素之一，线虫分类 鉴定对于防治农业线虫病害具有重要意义。通过鉴定线虫种 类，可以确定防治策略，选择合适的农药和防治方法，有效 控制线虫病害的传播和危害。
ERA
线虫的定义与特征
定义
线虫是一类微小的蠕虫状动物， 属于线形动物门。
特征
线虫通常呈圆柱形，体长一般在 几毫米至几十毫米之间。它们具 有完整的消化道和生殖系统，通 过肌肉纤维的收缩进行移动。
线虫的分类体系
分类依据
线虫的分类主要依据其形态特征、生 物学特性和基因序列等方面进行。
主要类群
线虫可分为两大类，自由生活的线虫 和寄生的线虫。其中，寄生的线虫又 可以分为内寄生和外寄生两种类型。
限制性片段长度多态性分析
通过分析线虫DNA的限制性酶切片段长度，进行线虫种类的鉴定 。
实时荧光定量PCR技术
利用特定引物和探针，对线虫DNA进行扩增和检测，快速鉴定线 虫种类。
生物信息学技术
数据库比对
将线虫的基因序列与已有 的数据库进行比对，确定 线虫的种类。
昆虫病原线虫的分子鉴定
土壤与作物2020年12月第9卷第4期Soils and Crops,Dec.2020,9(4)：380-387李春杰，王鑫鹏，黄铭慧，等•昆虫病原线虫的分子鉴定［J］.土壤与作物,2020,9(4):380-387.LI C J,WANG X P,HL AN G M H,et al.Molecular identification of entomopathogenic nematodes［J］.Soils and Crops, 2020,9(4)：380-387.昆虫病原线虫的分子鉴定李春杰1,王鑫鹏W,黄铭慧W,姜野W,王从丽1(1.中国科学院东北地理与农业生态研究所黑土区农业生态重点实验室，黑龙江哈尔滨150081；2.中国科学院大学，北京100049)摘要：为了快速鉴定昆虫病原线虫，同时验证实验室多年保存的昆虫病原线虫种或品系间的差异，采用线虫保守区间核糖体DNA(rDNA，18S-ITS1-5.8S-ITS2-28S)的PCR扩增和测序分子鉴定方法，对13个线虫种和品系的18S-28S rDNA和28S rDNA(D2-D3)进行扩增并对序列进行比较和分析，研究斯氏属(Steinernema)和异小杆属(Heterorhabditis)线虫的rDNA保守区域是否和已报道的线虫相同。
结果表明，28S rDNA的D2-D3的扩增序列比对的分子数据和形态学鉴定的结果完全一致，且与基因库已报道的线虫种相似度达到99%-100%，能明显区分线虫属、种或者品系。
18S-ITS1-5.8S的序列能够区分S.glaseri和S.carpocapsae，但不能区分序列相近的S.Utorale和S.feltiae，需要內转录间隔区ITS2来区分。
因此，r DNA能被用于快速分类鉴定昆虫病原线虫的种和品系。
关键词：昆虫病原线虫；分子鉴定；核糖体DNA；ITS；D2-D3中图分类号：S433.4文献标识码：A文章编号：2095-2961(2020)04-380-08DOI：10.11689/j.issn.2095-2961.2020.04.006Molecular identification of entomopathogenic nematodesLI Chunjie1,WANG Xinpeng1，2,HLANG Minghui1，2,JIANG Ye1，2,WANG Congli1(1.Key Laboratory of Mollisols Agroecology,Northeast Institute of Geography and Agroecology,Chinese Academy ofSciences,Harbin150081,China； 2.University of Chinese Academy of Sciences,Beijing100049)Abstract:To quickly identify entomopathogenic nematodes(EPN)and confirm the difference among species/strains of EPNs kept in our laboratory for many years,the conserved ribosome DNA(rDNA,18S一ITS1-5.8S一ITS2-28S)region of EPN was used for PCR amplification and sequencing.The comparison and analysis of18S-28S rDNA region and28S rDNA D2一D3extension segments of two genera of Heterorhabditis and Steinernema including13EPN species/strains were conducted to identify the similarity of these nematodes with reported nematodes in GenBank.The results of molecular identification with28S rDNA D2一D3region were fully matched with those from morphological data and the similarity with reported nematodes in the GenBank reached up to99%一100%. The D2-D3region sequences clearly distinguished EPN genus,species or strains.The amplification region of18S-ITS1-5.8S rDNA separated S.glaseri and S.carpocapsae but not for closely related S.Utorale and S.feltiae.The internal transcribed spacer ITS2rDNA would differentiate S.litorale and S.feltiae.The study indicated rDNA would be utilized for rapid identification of EPN species/strains. Key words:Entomopathogenic nematodes；molecular identification；ribosome DNA；ITS；D2-D30引言昆虫病原线虫作为重要的昆虫天敌因其无毒高效的特征越来越受关注，应用的生防制剂主要包括异小杆属(Heterorhabditis)和斯氏线虫属(Steinernema)两个属的线虫［1］。
线虫的分类鉴定
随着分子生物学技术的发展，线虫的DNA序列、蛋白质等 分子特征成为更准确、更可靠的分类标准，有助于更深入 地了解线虫的种群结构和进化关系。
分类层级
种
线虫的种是分类鉴定的基本 单位，根据形态学、生物学 和分子生物学特征将线虫划 分为不同的种。
属
科
目
属是比种更高一级的分类单 位，同一属内的线虫具有相 似的形态特征和生物学特性。
形态学鉴定需要具备一定的专业知识和经验，对于一些形态相近的线虫容易造成 误判。
分子生物学鉴定
01
分子生物学鉴定是通过分析线虫 的基因序列来进行分类的方法， 具有准确度高、分辨率高等优点 。
02
分子生物学鉴定可以用来鉴定形 态相近的线虫，以及一些难以通 过形态学鉴定的线虫种类。
生物地理学鉴定
生物地理学鉴定是通过分析线虫的地 理分布、生态环境等因素来进行分类 的方法。
提高分类的准确性和可靠性。
加强跨学科合作
02
加强生物学、化学、物理学等多学科的合作，综合运用多种手
段对线虫进行深入研究。
拓展应用领域
03
线虫分类鉴定不仅在基础研究中具有重要意义，还可应用于农
业、环保、医学等领域，为解决实际问题提供支持。
THANK YOU
3
保护生物多样性
对线虫进行分类鉴定有助于了解生物多样性的现 状和变化趋势，为保护生物多样性提供科学依据。
02
线虫的分类系统
分类依据
01
02
03
形态特征
线虫的形态特征是分类鉴 定的重要依据，包括虫体 的形状、大小、颜色、器 官结构等。
生物学特征
线虫的生活史、繁殖方式、 寄生习性等生物学特征也 是分类鉴定的依据。
植物寄生线虫分子鉴定技术研究进展
植物寄⽣线⾍分⼦鉴定技术研究进展植物寄⽣线⾍分⼦鉴定技术研究进展学⽣：指导⽼师：摘要：20世纪80年代以来,分⼦⽣物学技术在各个研究领域得到⼴泛应⽤，分⼦鉴定诊断技术也成为植物线⾍学研究的新途径。
本⽂将简述运⽤多种分⼦技术，如限制性染⾊体⽚段长度多型性(RFLPS)、特异性DNA探针、线粒体DNA、合成低聚核苷酸，rDNA–ITS–PCR 等分⼦⽣物学⽅法来区分、鉴定植物寄⽣线⾍的⽅法。
关键词：植物寄⽣线⾍; 分⼦⽣物学; DNA序列; 线⾍分⼦鉴定Research progress of plant-parasitic nematodeidentification technologyStudent：YANG Hao-naInstructor:HUANG Guo-huaAbstract:Since in the 1980 of the 20th century, molecular biological techniques in all areas of research widely, molecular identification of diagnosis new approach to technology has also become a study of plant-parasitic nematodes. Brief introduction of this article using various molecular techniques, Such as restrictive chromosome fragment length polymorphism(RFLPS), Specific DNA probe, Mitochondrial DNA, Synthesis of oligonucleotide, rDNA–ITS–PCR identification of molecular biological methods to distinguish, such as methods of plant-parasitic nematodes.Key words:Plant-parasitic nematodes; Molecular Biology; DNA sequences; Nematode identification植物寄⽣线⾍是⼀类重要的病原微⽣物，分布⼴、种类多，全世界已报道的植物线⾍有200多属5000余种，给农林业⽣产造成严重危害。
区分松材线虫和拟松材线虫的生化及分子鉴别方法
根据上述形态观察和测量,初步鉴定为草莓滑刃线虫,并经浙江大学郑经武教授复核确认。
3 讨论草莓滑刃线虫是一种叶和芽寄生线虫,可引起草莓春矮病(Spring Dwarf Disease ),还可侵染蕨类、百合科等47个科250多种植物。
该线虫危害草莓时,在草莓芽和叶片表面取食,造成植株发育不良,叶片发红或叶片卷曲皱缩,芽和花畸形,影响产量。
危害百合引起百合黑死病,线虫侵染导致叶片从茎基部自下而上枯死。
幼嫩梢被侵染时,线虫在生长点取食,使新梢矮缩、扭曲,不能开花。
滑刃属线虫主要特征如下:体长014～112mm ,头部通常略缢缩,口针长度10～12μm ;食道前体部圆柱形,中食道球及中食道球瓣发达,后食道腺叶发达、覆盖肠的背面;雌虫阴门位于虫体的60%～75%;后阴子宫囊通常存在并含有精子;尾圆锥形,尾端及尾尖突形态多样。
雄虫尾圆锥形,向腹面弯成钩状;交合刺玫瑰刺形,基顶及基喙通常发达;无交合伞。
Shahina 提出,按尾尖突形状及有无将滑刃属线虫分为4组:11尾简单,无尾尖突;21尾具1～2个尾尖突;31尾尖突四叉或星形;41尾尖突为其他形状。
草莓滑刃线虫被分在第2组,具有1个尾尖突。
而其他文献一般称草莓滑刃线虫尾为钝穗状或钝钉状,无任何附属物。
此次观察到的草莓滑刃线虫雌虫和雄虫均有一尾尖突。
致谢 承蒙浙江大学郑经武教授复核鉴定草莓滑刃线虫标本并提供资料,特此感谢!参考文献1 谢辉编著1植物线虫分类学1合肥:安徽科学技术出版社,20002 刘维志主编1植物病原线虫学1北京中国农业出版社,20003 Shaniha F 1A Diagnostic C ompendium of The G enus A phelen 2choides Fischer ,1894W ith S ome New Records of The groupFrom Pakistan 1Pak 1J 1Nematol ,1996,14(1):1～32区分松材线虫和拟松材线虫的生化及分子鉴别方法Ξ蒋立琴 郑经武ΞΞ(浙江大学农业与生物技术学院植物保护系,杭州310029)摘要 本文从蛋白质、激素、脂类及核酸等不同的角度,概述了松材线虫和拟松材线虫的一些生化和分子鉴别方法及其优缺点。
鸢尾种苗中截获的草莓滑刃线虫形态和分子鉴定
鸢尾种苗中截获的草莓滑刃线虫形态和分子鉴定
草莓滑刃线虫是一种常见的根际寄生线虫，主要危害草莓、番茄、茄子等作物。
近年来，由于全球化贸易和苗木运输的增加，草莓滑刃线虫已成为国际间重要的有害生物。
为了保护我国的农业生产，我国对来自国外的鸢尾种苗进行了检疫，并于2010年开始实施《入境鸢尾种苗检疫技术规范》。
在对进境鸢尾种苗进行检疫时，我国发现了一种名为草莓滑刃线虫的有害生物。
本文主要对这种草莓滑刃线虫的形态和分子鉴定进行阐述。
形态鉴定
草莓滑刃线虫的形态特征主要有以下几点：
1. 身体细长，通常呈弯曲状。
2. 头端有一个柄状突起，称为口针。
3. 雄虫成虫身长约1.2mm，雌虫身长约1.5mm。
4. 体表有数条纵向线条。
5. 尾部钝圆。
分子鉴定
草莓滑刃线虫的分子鉴定主要可以通过岩氏玫瑰线虫属（Pratylenchus）的ITS和COI DNA区域进行。
ITS区域是线虫基因组中的常见序列，由于其在不同物种间具有高度的变异性，因此可以用于物种鉴定和系统进化分析。
COI区域是线虫线粒体基因组中的一个编码蛋白质的基因，也是常用的DNA条形码区域之一，可用于物种鉴定。
研究人员利用ITS和COI区域对截获的草莓滑刃线虫进行鉴定，结果表明这些线虫的ITS和COI序列与草莓滑刃线虫的同种序列高度相似，显示出一致性。
这证明了截获的线虫为草莓滑刃线虫，并证实了形态鉴定的结果。
综上所述，通过形态鉴定和分子鉴定，我们可以准确地识别草莓滑刃线虫，并对其进行有效的防控措施。
这对保障我国的农业生产具有重要的意义。
三七病原根结线虫的分子鉴定
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三 七 病 原 根 结 线 虫 的 分 子 鉴 定
冯光泉 董 丽英 陈昱君 尚 慧 刘云芝 李 家瑞２杨 建忠 崔 秀明 杨佩文 ， ， ， ， ， ， ， ，
（ ． 山州三七科学技术研究所 ， １文 云南 文山 ６ ３ ０ ；． ６ ０ ０２ 云南省农业科学院农业环境资源研究所 ， 云南 昆明 ６０ ０ ） ５ ２ ５
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鸢尾种苗中截获的草莓滑刃线虫形态和分子鉴定
鸢尾种苗中截获的草莓滑刃线虫形态和分子鉴定草莓滑刃线虫是一种重要的有害线虫，它主要危害草莓等水果作物，造成根系发育不健全，叶片萎黄、缩小、畸形，严重时甚至导致植株死亡。
本文报道了从鸢尾种苗中截获的草莓滑刃线虫形态和分子鉴定结果。
1、样品来源和鉴定方法本研究所使用的草莓滑刃线虫分离自盆栽鸢尾，和以往报道的草莓滑刃线虫形态相似。
样品中草莓滑刃线虫体长达3mm左右，体形较细长，头部稍尖，尾部稍扁平并具剪刀状切口。
在草莓滑刃线虫的身体上分布着许多倒刺形的侧线，侧线上具有小型腺体。
草莓滑刃线虫还具有豆形前门和三叉后肛，这些特征都表明了其属于滑刃线虫属（Aphelenchoides）。
为了进一步鉴定草莓滑刃线虫的种类，我们采取了分子鉴定法。
首先，我们从草莓滑刃线虫体内提取了总DNA，然后选择ITS和18S rDNA序列作为其鉴定标记。
最后，我们将其鉴定序列与NCBI数据库中的相关序列进行比对，通过构建系统发育树进行物种分类，确认其种属和种类。
2、鉴定结果从鸢尾种苗中截获的草莓滑刃线虫样品经过分子鉴定，得到了ITS和18S rDNA序列。
通过分析序列的相似性，我们将其进行比对，发现与NCBI数据库中的草莓滑刃线虫（Aphelenchoides fragariae）的 ITS和18S rDNA序列完全匹配，其相似度分别达到99%以上，确定其为草莓滑刃线虫。
3、结论本研究中，我们从鸢尾种苗中截获了一种草莓滑刃线虫，通过形态和分子鉴定方法确认其为草莓滑刃线虫（Aphelenchoides fragariae）。
该线虫是一种危害草莓作物的有害线虫，本研究对其的鉴定将有助于制定相关的防治策略，遏制其对农业产业的威胁。
此外，通过本研究的分析，我们还发现草莓滑刃线虫与其他滑刃线虫的亲缘关系比较独特，这也提示我们在分析水果作物上的线虫时需要注意其种类和种间差异，以准确鉴定其威胁程度并制定相应的应对措施。
马铃薯腐烂茎线虫的鉴定及分子检测
马铃薯腐烂茎线虫的鉴定及分子检测马铃薯腐烂茎线虫是侵染植物地下部分的一种迁移性内寄生线虫,在无高等寄主植物存在的情况下,它们主要取食土壤里的真菌而生存,是能够造成严重危害的重要植物病原线虫之一。
该线虫在我国北京、天津、山东、河北、河南、江苏、浙江、福建、辽宁、甘肃、海南等省市均有发生,以山东、河北两省发生最为严重。
本文对我国河北、江苏及韩国等不同地区的马铃薯、甘薯、大蒜茎线虫群体进行了形态鉴定和分子鉴定;对其ITS区域进行序列测定和分析,根据测定的序列设计了马铃薯腐烂茎线虫的特异性探针,建立了实时荧光PCR检测马铃薯腐烂茎线虫的方法。
通过研究主要取得以下几方面的结果:1.借助光学显微镜的形态鉴定结果表明:河北省张北送检的马铃薯的病原线虫为马铃薯腐烂茎线虫,这在我国还是首次报道。
与其它几个供试群体比较主要形态特征上无明显差异,与腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)基本一致。
2.本实验还对马铃薯腐烂茎线虫的培养方法进行筛选,认为最佳的培养条件是:以胡萝卜愈伤组织作为培养基质,在黑暗中,温度25℃,相对湿度70%。
3.供试样品的rDNA-ITS序列分析:用通用引物对rDNA1/rDNA2扩增供试群体rDNA-ITS区域,产生了序列长度不等的片段。
河北张北的马铃薯群体、韩国的大蒜群体和江苏的甘薯群体扩增片断长度均为1130bp。
而北京、北京大兴、河北抚宁的甘薯群体的扩增片段长度为942bp,与以上群体相比,在ITS区具有一个188bp的缺失片段。
根据Subbotin(2005)所公布的D.destructor的rDNA-ITS序列(GenBank NO:AY987007)确定ITS区域(包括5.8S全序列),Blast发现河北张北的马铃薯群体与其同源性最高,达到100%,进一步证实了种类形态鉴定的准确性。
比对后确定缺失片段位于ITS1区,而且该片段含有多个可重复小片段,这可能是造成碱基缺失的原因。
鸢尾种苗中截获的草莓滑刃线虫形态和分子鉴定
鸢尾种苗中截获的草莓滑刃线虫形态和分子鉴定引言草莓是一种重要的水果作物，但是由于土壤寄生线虫的侵害，草莓的产量和质量受到了很大的影响。
草莓滑刃线虫（Aphelenchoides fragariae）是一种主要的寄生线虫，它会在草莓植株的叶片和花朵部位寄生，导致草莓植株生长不良和叶片变形等问题。
对于草莓种苗中是否存在草莓滑刃线虫的检测和鉴定就显得非常重要。
考虑到草莓和鸢尾植株在生长环境和栽培管理上有一定的相似性，我们在一次调查中发现了鸢尾种苗中截获了草莓滑刃线虫。
本文旨在通过形态和分子鉴定的方式，对鸢尾种苗中截获的草莓滑刃线虫进行研究和鉴定，以期为草莓滑刃线虫的检测与防控提供参考。
一、材料与方法1. 材料本研究中采集的鸢尾种苗样品来自农村种植基地，样品包括根系、叶片和茎部等。
我们采集了一些草莓种苗作为对照组。
所有样品都被密封包装并送至实验室进行分析。
2. 方法（1）草莓滑刃线虫形态观察我们使用显微镜对采集的鸢尾种苗中截获的线虫进行形态观察。
具体步骤如下：a. 将样品取出并清洗干净，然后放置在玻璃盘中。
b. 用显微镜对鸢尾种苗中的线虫进行观察，并记录线虫的形态特征，包括体长、体宽、尾部形状等。
（2）分子鉴定为了确定线虫的物种和亲缘关系，我们采用了PCR技术对鸢尾种苗中的线虫进行分子鉴定。
具体步骤如下：a. 从样品中提取线虫的DNA，并进行PCR扩增。
b. 设计引物并进行PCR扩增反应。
c. 对PCR产物进行电泳分析，确认扩增产物的大小。
d. 对扩增产物进行测序并与已知序列进行比对，确定线虫的物种和亲缘关系。
二、结果1. 草莓滑刃线虫形态观察通过显微镜观察，我们在鸢尾种苗中发现了一种形态特征与草莓滑刃线虫相似的线虫。
该线虫体长约0.6-0.8mm，体宽约20-30μm，具有一个尖细的尾部，整体形态与草莓滑刃线虫相符。
2. 分子鉴定通过PCR扩增和测序分析，我们成功获取了鸢尾种苗中截获线虫的ITS序列。
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许多作物的根腐病或“烂根”，是生产中一个比较 突出和复杂的问题，但人们很少去考虑线虫的因素， “作物的烂根，其中30％左右与线虫相关”。
植物线虫危害的特点：主动侵袭、隐蔽性。 植物线虫对寄主致病性表现为： （1）机械损伤
（2）分泌有毒物质破坏寄主的细胞和组织
（3）与其它病原物对寄主复合侵染
分子鉴定
(25-35)
总延伸 延伸 复性 (50-70C,30s) (72C,30-60s)(72C,7min)
经过30次的循环, 扩增的DNA片段可达100万倍以上。
孢囊线虫基因组DNA提取
在解剖镜下挑取1 个孢囊到200μl eppendorf 管， 加入14μL 灭菌的重蒸水, 液氮中冷冻后取出 。 用75 %酒精消毒的玻璃棒在eppendorf 管中转 动至冰融化,反复3~5次。然后加入3μL10倍的 PCR buffer ,3 μL 蛋白酶K 溶液(600μg/ mL) ,然 后在液氮中冷冻30min 。将eppendorf 管置65 ℃ 下温育1 h ,以降解脱氧核糖核酸。在95 ℃下孵 育10 min ,使蛋白酶K变性,最后1 000 r/ min下离 心1 min ,取上清DNA 悬浮液于- 20 ℃保存备用。
通过PCR 技术,设计特定的引物对线虫rDNA 的ITS 区进行扩增,然后用限制性内切酶酶切 扩增产物,将酶切片段进行多态性(Restriction Fragment Length Polymorphisms, RFLP) 分析.
技术路线
分子鉴定的技术路线
虫源的获得 核糖体 DNA提取
ITS区 PCR扩增
检测试剂盒
样品检测
PCR产物 测序
检测体系的优化
探针设计
序列比较， 得差异片段
聚合酶链反应：（polymerase chain reaction, PCR）
原理： 1）引物的设计：合成2个与目的DNA序列两 侧互补的寡核苷酸，一般长约15-25bp。 2）基本条件：引物、DNA前提物质、含有 一定离子（Mg）的反应体系 、DNA聚合酶、 模板。 3）三段循环：变性：93-95℃；复性：5070 ℃;延伸：70-75 ℃ 。n个周期，2n个DNA
TW81 ： 5’ –GTTTCCGTAGGTGAACCTGC- 3’
下AB28：5’-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT -3’
Amplification and sequencing of the D2–D3 expansion segments of the 28S rRNA
D2A：ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG D3B：TCGGAAGGAACCAGCTACTA
我国重要二级检疫性害虫－松材线虫及其近似种
常用来区分松材线虫和拟松材线虫的形态特征是雌虫的 尾形及尾尖突长度，通常松材线虫雌虫尾端宽圆、无尾 尖突或尾尖突短于2μm，而拟松材线虫尾端指状、尾尖 突长于3.5μm
松材线虫
甘薯茎线虫
为害症状
稻干尖线虫
大豆孢囊线虫
孢囊线虫
危害方式：口针穿刺寄主，通过分泌有毒物质和吸 收营养破坏寄主的细胞和组织，植物受到为害后， 表现的症状与一般病害的症状相似 植物线虫还能作为其他病原物的自然传播介体．
Байду номын сангаас
聚合酶链反应 （polymerase chain reaction,PCR）
PCR原理
PCR原理
１变性
PCR原理
１复性
PCR原理
１延伸
PCR原理
２变性
PCR原理
２复性
PCR原理
２延伸
PCR原理
３变性
PCR原理
３复性
PCR原理
３延伸
PCR的一般过程： 预变性(93-95C,2-5min) 变性(93-95C,30s)
rDNA - ITS 的结构和原理
在大多真核生物核基因 组中,每个重复rDNA 基 因家簇从5′到3′端的结构 是由外转录间隔区 ( External Transcribed Spacer ,ETS) 、18S 基因、 内转录间隔区 ( InternalTranscribed Spacer Region , ITS) 、 5.8S 基因、28S 基因和 基因间隔区( Intergenic Spacer ,IGS) 6 部分组成, IGS 区域连接着另一个 rDNA 基因家簇的拷贝。
20 世纪80 年代,分子生物学技术在各个研究领 域得到广泛应用,分子诊断也成为植物线虫研究 的新途径。直接测定线虫的遗传物质(DNA) 是 潜在的最有力的线虫诊断工具,因为DNA 诊断 技术并不依赖于基因组的表达产物,也不受环境 影响和线虫发育阶段的限制。在植物线虫的分 子诊断和鉴定中,最有价值的基因组区域之一是 核糖体DNA(rDNA) 重复单元，rDNA 编码和非 编码区的比较分析正在成为许多生物的种和亚 种鉴定的普遍工具。
18S ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence
，5S rDNA及5．8S rDNA序列较短，大约100150 bp，包含的系统发育信息不多，进化缓慢， 仅适合于纲以上水平的系统发育研究， 目前很 少应用。 18S rDNA区序列较长，大约2 kb，并存在一些 多变区，适合作为科级水平以上的分类依据 28S rDNA区序列比18S rDNA长，大约4—5 kb， 包含的系统发育的信息较多，适合于科和属级 水平以上的系统发育研究。
IGS区序列最长，大约4～5 kb，属于高 度变化区，适合于种及种下水平的研究， 尤其适合于种的分类签定，但由于序列 过长，全程测序较难，故需结合其它分 子生物学方法进行
ITS 序列是一个多用途的遗传标记,位于 18S 和28S 核糖体DNA基因的重复簇之间, 中间被5.8S 核糖体DNA 基因分开。 受到的选择压力小，在生物种和亚种间 变化较大，可用于属、种及种群水平的 相互关系的研究，用PCR 技术扩增ITS 区，可通过酶切、克隆、测序等来揭示 线虫种间或群体间的差异，从而进行植 物病原线虫种的快速分子鉴定。
孢囊线虫分子鉴定
线虫是一类低等的无脊椎动物．地球上约１０ 万种，但目前只记载约260属5700多种 包括自由生活线虫（海洋、淡水和土壤中） 危害植物的病原线虫。 几乎所有的农作物都受到植物线虫的寄生。 人类最早发现的是小麦粒线虫（1743年）
唇区
松材线虫病及其媒介昆虫
松材线虫的危害
据 FAO保守估计，因为线虫为害，粮食和纤维 作物损失约为12%； 蔬菜、花生、烟草和某些果树，损失超过20%； 近年来国内蔬菜根结线虫危害严重．
美国著名线虫学家J N Sasser认为，全美每年因 线虫病害造成的农产品损失为58亿美元，全世界超 过1000亿美元； 在我国，仅大豆孢囊线虫病，造成的年损失大 1 亿美元；各种蔬菜损失达到30亿美元；水稻因潜 根线虫危害，造成7%~15％的产量损失，这类线虫 广泛分布在我国水稻产区，但迄今在国内尚未引起 注意；
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BLAST
BLAST
nucleotide blast