线虫分子鉴定

，5S rDNA及5．8S rDNA序列较短，大约100150 bp，包含的系统发育信息不多，进化缓慢， 仅适合于纲以上水平的系统发育研究， 目前很 少应用。 18S rDNA区序列较长，大约2 kb，并存在一些 多变区，适合作为科级水平以上的分类依据 28S rDNA区序列比18S rDNA长，大约4—5 kb， 包含的系统发育的信息较多，适合于科和属级 水平以上的系统发育研究。
我国重要二级检疫性害虫－松材线虫及其近似种
常用来区分松材线虫和拟松材线虫的形态特征是雌虫的 尾形及尾尖突长度，通常松材线虫雌虫尾端宽圆、无尾 尖突或尾尖突短于2μm，而拟松材线虫尾端指状、尾尖 突长于3.5μm
松材线虫
甘薯茎线虫
为害症状
稻干尖线虫
大豆孢囊线虫
孢囊线虫
危害方式：口针穿刺寄主，通过分泌有毒物质和吸 收营养破坏寄主的细胞和组织，植物受到为害后， 表现的症状与一般病害的症状相似 植物线虫还能作为其他病原物的自然传播介体．

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
BLAST
BLAST
nucleotide blast
18S ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence

20 世纪80 年代,分子生物学技术在各个研究领 域得到广泛应用,分子诊断也成为植物线虫研究 的新途径。直接测定线虫的遗传物质(DNA) 是 潜在的最有力的线虫诊断工具,因为DNA 诊断 技术并不依赖于基因组的表达产物,也不受环境 影响和线虫发育阶段的限制。在植物线虫的分 子诊断和鉴定中,最有价值的基因组区域之一是 核糖体DNA(rDNA) 重复单元，rDNA 编码和非 编码区的比较分析正在成为许多生物的种和亚 种鉴定的普遍工具。
rDNA - ITS 的结构和原理
在大多真核生物核基因 组中,每个重复rDNA 基 因家簇从5′到3′端的结构 是由外转录间隔区 ( External Transcribed Spacer ,ETS) 、18S 基因、 内转录间隔区 ( InternalTranscribed Spacer Region , ITS) 、 5.8S 基因、28S 基因和 基因间隔区( Intergenic Spacer ,IGS) 6 部分组成, IGS 区域连接着另一个 rDNA 基因家簇的拷贝。
孢囊线虫分子鉴定
线虫是一类低等的无脊椎动物．地球上约１０ 万种，但目前只记载约260属5700多种 包括自由生活线虫（海洋、淡水和土壤中） 危害植物的病原线虫。 几乎所有的农作物都受到植物线虫的寄生。 人类最早发现的是小麦粒线虫（1743年）

唇区
松材线虫病及其媒介昆虫
松材线虫的危害

许多作物的根腐病或“烂根”，是生产中一个比较 突出和复杂的问题，但人们很少去考虑线虫的因素， “作物的烂根，其中30％左右与线虫相关”。
植物线虫危害的特点：主动侵袭、隐蔽性。 植物线虫对寄主致病性表现为： （1）机械损伤
（2）分泌有毒物质破坏寄主的细胞和组织
（3）与其它病原物对寄主复合侵染
分子鉴定
检测试剂盒
样品检测
PCR产物 测序
检测体系的优化
探针设计
序列比较， 得差异片段
聚合酶链反应：（polymerase chain reaction, PCR）
原理： 1）引物的设计：合成2个与目的DNA序列两 侧互补的寡核苷酸，一般长约15-25bp。 2）基本条件：引物、DNA前提物质、含有 一定离子（Mg）的反应体系 、DNA聚合酶、 模板。 3）三段循环：变性：93-95℃；复性：5070 ℃;延伸：70-75 ℃ 。n个周期，2n个DNA
聚合酶链反应 （polymerase chain reaction,PCR）
PCR原理
PCR原理
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PCR原理
１复性
PCR原理
１延伸
PCR原理
２变性
PCR原理
２复性
PCR原理
２延伸
PCR原理
３变性
PCR原理
３复性
PCR原理
３延伸
PCR的一般过程： 预变性(93-95C,2-5min) 变性(93-95C,30s)
(25-35)
总延伸 延伸 复性 (50-70C,30s) (72C,30-60s)(72C,7min)
经过30次的循环, 扩增的DNA片段可达100万倍以上。
孢囊线虫基因组DNA提取

在解剖镜下挑取1 个孢囊到200μl eppendorf 管， 加入14μL 灭菌的重蒸水, 液氮中冷冻后取出 。 用75 %酒精消毒的玻璃棒在eppendorf 管中转 动至冰融化,反复3~5次。然后加入3μL10倍的 PCR buffer ,3 μL 蛋白酶K 溶液(600μg/ mL) ,然 后在液氮中冷冻30min 。将eppendorf 管置65 ℃ 下温育1 h ,以降解脱氧核糖核酸。在95 ℃下孵 育10 min ,使蛋白酶K变性,最后1 000 r/ min下离 心1 min ,取上清DNA 悬浮液于- 20 ℃保存备用。

IGS区序列最长，大约4～5 kb，属于高 度变化区，适合于种及种下水平的研究， 尤其适合于种的分类签定，但由于序列 过长，全程测序较难，故需结合其它分 子生物学方法进行
ITS 序列是一个多用途的遗传标记,位于 18S 和28S 核糖体DNA基因的重复簇之间, 中间被5.8S 核糖体DNA 基因分开。 受到的选择压力小，在生物种和亚种间 变化较大，可用于属、种及种群水平的 相互关系的研究，用PCR 技术扩增ITS 区，可通过酶切、克隆、测序等来揭示 线虫种间或群体间的差异，从而进行植 物病原线虫种的快速分子鉴定。


通过PCR 技术,设计特定的引物对线虫rDNA 的ITS 区进行扩增,然后用限制性内切酶酶切 扩增产物,将酶切片段进行多态性(Restriction Fragment Length Polymorphisms, RFLP) 分析.
技术路线
分子鉴定的技术路线
虫源的获得 核糖体 DNA提取
ITS区 PCR扩增

据 FAO保守估计，因为线虫为害，粮食和纤维 作物损失约为12%； 蔬菜、花生、烟草和某些果树，损失超过20%； 近年来国内蔬菜根结线虫危害严重．
美国著名线虫学家J N Sasser认为，全美每年因 线虫病害造成的农产品损失为58亿美元，全世界超 过1000亿美元； 在我国，仅大豆孢囊线虫病，造成的年损失大 1 亿美元；各种蔬菜损失达到30亿美元；水稻因潜 根线虫危害，造成7%~15％的产量损失，这类线虫 广泛分布在我国水稻产区，但迄今在国内尚未引起 注意；
TW81 ： 5’ –GTTTCCGTAGGTGAACCTGC- 3’
下AB28：5’-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT -3’
Amplification and sequencing of the D2–D3 expansion segments of the 28S rRNA
D2A：ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG D3B：TCGGAAGGAACCAGCTACTA