第五章 药用植物分子鉴定

遗传稳定性：DNA分子作为遗传信息的直 接载体，不受外界因素和生物体发育阶段及 器官组织差异的影响，每一个体的任一体细 胞均含有相同的遗传信息。因此，用 DNA 分 子特征作为遗传标记进行物种鉴别更为准确 可靠。

遗传多样性： DNA 分子是由 G 、 A 、 C 、 T 四 种碱基构成，为双螺旋结构的长链状分子， 生物体特定的遗传信息便包含在特定的碱基 排列顺序中，不同物种遗传上的差异表现在 这4种碱基排列顺序的变化，这就是生物的遗 传多样性(genetic diversity)。比较物种间 DNA分子的遗传多样性的差异来鉴别物种就是 DNA 分 子 遗 传 标 记 鉴 别 (identification by DNA molecular genetic marker)。
在
RAPD 和 RFLP 技 术 基 础 上 建 立 了 SCAR(Sequence characterized amplified regions， 序 列 特 异 性 扩 增 区 域 ) ， CPAS(Cleaved polymorphic amplified sequence， 酶 切 扩 增 多 态 序 列 ) 和 DAF(DNA amplified fingerprints，DNA 扩增指纹 ) 等 标记技术。这些技术的出现，进一步丰富和 完善了第一代分子标记，增加了DNA多态性的 研究手段。
品种2 TCTTGTAGACTCACTATAG.....GCGTACATCAGATAG
两个步骤：
• 获得目标DNA片段：酶切，扩增（PCR）
• 检测不同样品间目标片段的差异（多态性）：电泳，
分子杂交，DNA芯片（高通量）
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化学稳定性： DNA 分子作为遗传信息的
载体，除具有较高的遗传稳定性外，在诸多 的生物大分子中，比蛋白质、同功酶等具有 较高的化学稳定性。不象蛋白质和同功酶那
样，在生物体死亡后，很快失去生物活性，
并迅速降解。在陈旧标本中所保存下来的DNA
仍能够用于DNA分子遗传标记的研究。
4.4 分子标记的类型
该座位是否存在多态性。
RFLP原理示意图
左边：等位序 列酶切电泳的 结果
右边：用探针
检验的结果。
1.1 产生RFLP的原因
•点突变：单个碱基的改变 （转换或颠换），造成失 去某个酶切位点或产生一 个新的酶切位点，使突变 型酶切片段变长或变短。 •插入突变：使突变型酶切 片段变长。 •缺失突变：使突变型酶切 片段变短。
2.随机扩增多态性DNA（RAPD）
RAPD原理：
建立于 PCR 基础之上，使用一系列具有 10 个左右
碱基的单链随机引物，以较低的退火温度
（36℃），对基因组的DNA全部进行 PCR扩增，
以检测多态性。由于整个基因组存在众多反向重
复序列，因此须对每一随机引物单独进行 PCR 。
单一引物与反向重复序列结合，使重复序列之间 的区域得以扩增。
RFLP的缺点 标记技术需要酶切，对DNA
质量要求高；
RFLP
的多态性程度偏低； 分子杂交时会用到放射性同位素，对人体和 环境都有害； 探针的制备、保存和发放也很不方便； 分析程序复杂、技术难度大、费时、成本高。
1.遗传学图的构建
结合RFLP连锁图，任何 能用 RFLP 探针检测出的基因及其 DNA 片段 都可以通过回交，快速有效地进行转移。
优点：经济、方便、成本较低
缺点：结构基因表达产物，对非结构基因无能为
力；所检测位点只是基因组一部分；数量有限，有
时受发育时期和环境影响。
4. 分子标记（molecular markers）
• 分子标记是指能够被检测出来的DNA序列上的遗 传多态性（等位差异）。
碱基差异 长度差异
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②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变 性成单链后，温度降至 55℃ 左右，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合；
③引物的延伸： DNA 模板－引物结合物于 72℃ 左右在TaqDNA聚合酶的作用下，以 dNTP为反 应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留 复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的 半保留复制链。
优点：简单、直观 缺点：仅对个体性状的描述，得出的结论不完善；
另外数量性状易受环境影响。
孟德尔豌豆杂交试验所研究的七对性状 都是典型的形态学遗传标记
染色体数目变异及结构变异，表现在染色体核型
如数目、大小、着丝点位置变异等。
优点：直观、快速而经济 缺点：但变异十分有限，当染色体数目形态相似
2.基因定位
利用RFLP技术能够准确地标记 定位种质中的目标基因，结合杂交，回交及 组织培养等技术就可以快速有效的将所需目 标基因的DNA片段引入栽培品种中，实现品 种改良。
3. 遗传多态性分析
运用RFLP技术可以尽可 能多地保存那些在已知位点上有异态的品系， 以求最大程度地保持品种的多样性。 4. 细胞质遗传研究 RFLP 技术是对 DNA 序列 自然变异的直接检测，只需选择适当的限制 性内切酶或DNA探针作分子标记，因而对植物 不同种属或杂种后的细胞质遗传变异及基因 型的鉴定具有较高的灵活性和灵敏性，从而 能较好地应用于细胞质遗传的研究。
第二节 常用的分子标记
1. 限制性片段长度多态性（RFLP）
RFLP原理：
• 基因组DNA经限制酶切，可产生大量长短不一的片段。 通过电泳可以将这些片段分离开。片段长的迁移速 度慢，短的迁移速度快。 • 如果一对等位基因（序列）的限制酶切片段长度不 同，则称为 RFLP 。以标有放射性同位素或化学标记 物质、来自特定基因座的DNA片段为探针，可以检验
2.
3.
定义：由一对等位基因差异
造成的，能够明确区分，遗传 传递过程可以跟踪的相对性状 或生物特征。
如形态上的质量性状：花瓣
颜色、种子颜色、叶片颜色、 叶片形状、种子形状等。
遗传标记的类型
遗传学上稳定、可见的外部特征
--- 遗传与环境、结构基因与调控基因综合作用的结 果，这种标记可以用于研究物种间关系、分类和鉴 定。 如植株高矮、花瓣颜色、叶片颜色、叶片形状、种 子形状等。
分子标记的发展经历了三个阶段，也称为三代DNA分子 标记：
第一代分子标记（以分子杂交为核心）：RFLP；
第二代分子标记（以 PCR 为核心）： RAPD ； AFLP ； SSR；ISSR分子标记 第三代分子标记（以DNA测序为核心）：单核苷酸多 态性 (SNP)；表达序列标签(EST)；ITS
Molecular Identification of Medicinal Plants
试讲人：田恩伟 科室：药植与中药鉴定教研室
中药材市场假药多
1.
了解遗传标记定义、类型、优缺点，掌 握分子遗传标记定义、原理和在药用植物鉴 定中的应用。熟悉PCR的原理和步骤。 掌握常用的分子标记（RFLP、RAPD、SSR、 ISSR、SNP）原理和方法。 重点掌握药用植物分子鉴定的方法和流 程（以柴胡为例）。
OPD8
2 北柴胡(河北) 5 小叶黑柴胡 6 狭叶柴胡
OPA1
3 竹叶柴胡 M Marker
OPD11: 5’-AGCGCCATTG-3’
OPD8: 5’-GTGTGCCCCA-3’
RAPD analysis of 27 safflower accessions from eight different geographical regions with Operon primer AA-0ds
参考书及相关文献资料
参考书： 1.《中药生物工程》,主编:高文远,上海科学技术出版社. 2《中药现代生物技术》,主编:胡之璧,人民卫生出版社. 3.《中药生物技术》,主编:贾景明,化学工业出版社. 参考文献： 1.徐红, 王峥涛, 胡之璧.中药DNA分子鉴定技术的发展与 应用[J].中药现代化, 2003,5(2):24-30. 2. 海学忠.DNA分子标记在中药鉴定中的应用进展[J].中 外健康文摘, 2012, 9(35):442-446. 3.陈士林,郭宝林,张贵君等.中药鉴定学新技术新方法研 究进展[J].中国中药杂志, 2012, 37(8):1043-1055.
Lanes 1 and 26: ladder 1 Kb; Lanes 2 to 27: melon. Arrows indicate polymorphic markers used for analysis.
RAPD的优点：
技术简单，实验周期短，信息量大，检测速度快；
DNA用量少；
实验设备简单，不需DNA探针，设计引物也不需要
时难以分辨。
王喻宁等，2013

生化标记：指把植物体内的某些生化性状作为遗传标记，
如贮藏蛋白、同工酶等。这种标记可用于绘制“指纹图谱”
进行植物系统发育、亲缘关系和种类鉴定研究。

同工酶：指够催化相同的化学反应，但分子结构、理化特 性等不同的一组酶。
3. 生化标记（Biochemical Markers）
引物结合位点DNA序列的改变以及两扩增
位点之间DNA碱基的缺失、插入或置换均可导
致扩增片段数目和长度的差异，经聚丙烯酰 胺或琼脂糖凝胶电泳分离后通过EB(溴化乙锭)
染色以检测DNA片段的多态性。
RAPD原理示意图
RAPD的应用-分类鉴定
OPD11
1 北柴胡(陕西) 4 大叶柴胡
OPA1: 5’-CAGGCCCTTC-3’
1.2 RFLP的检测方法
酶切 电泳 Southern杂交 放 射自显影
结核分枝杆菌基因组RFLP图谱
RFLP的优点 标记广泛存在于生物体内，不受组织、环境
和发育阶段的影响。
RFLP
标记的等位基因是共显性的，不受杂
交的影响，可区分纯合基因与杂合基因。
可产生的标记数目很多，可覆盖整个基因组。
PCR定义：是一种模拟体内DNA复制过程的体 外酶促合成特异性核酸片段的技术。 PCR原理：以待扩增的两条DNA链为模板，由 一对人工合成的寡核苷酸引物 (15-25 碱基 ) 介导，通过 DNA 聚合酶酶促反应，在体外进 行特异DNA序列扩增。
PCR三步骤
①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右 5 min，使模板DNA双链解离，使之成为单链， 以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
长度差异片段电泳检测：
品种1 电 泳 方 向 品种2
本质是以核苷酸序列作为标记，一般特点： （1）不受季节、环境、基因表达与否的限制； （2）多态性高，存在着丰富的等位变异； （3）数量丰富，多态性遍及整个基因组； （4）多数分子标记表现共显性，能鉴别纯合 杂合基因型，提供完整的信息。
共显性：
遗传学上，把共显性定义 为F1代中，双亲的性状同 时表现的现象。共显性能 够将杂合体和纯合体从表 现上区分开。
小结与思考
小结： 1. 四种类型遗传标记中，分子标记具有其他遗传标记无 法比拟的有点，遗传稳定性、多态性、化学稳定性，在 药用植物或生药鉴定中应用最为广泛的标记。 2. PCR技术是分子标记的基础，PCR原理和步骤为： 变性-退火-延伸。
思考： 1.分子标记进行药用植物鉴定依据的是什么？ 2.与三种传统遗传标记相比，分子标记优势体现在哪些 方面？ 3.理解PCR的原理和步骤。
预先克隆标记或进行序列分析；
不依赖于种属特异性和基因组的结构，合成一套引
物可以用于不同生物基因组分析；
用一个引物就可扩增出许多片段，几乎覆盖整个基
因组，而且不需要同位素，安全性好。
RAPD缺点：
显性遗传，不能识别杂合子位点，这使得遗
传分析相对复杂，在基因定位、作连锁遗传图 时，会因显性遮盖作用而使计算位点间遗传距 离的准确性下降； RAPD对反应条件相当敏感，包括模板浓度、 Mg2+浓度，所以实验的稳定性和重复性差。
F1
P1
F1
通过比较药用植物种间DNA分子遗传多样性差异来鉴别其种类的方法。
北柴胡 Bupleurum chinense 狭叶柴胡 Bupleurum scorzonerifolium
中国柴胡有42 种，17变种
Chao et al. 2014 Phytomedicine
DNA 分子标记技术直接分析生物的基因型， 与上述传统的方法比较，具有下列优点：