表达MUC1的小鼠胰腺癌细胞系的构建及成瘤实验

The Construction of the Pancreatic Cancer Cell Line Panc022MUC1 RO N G Ye f ei J I N D a y on g W U W ench uan L OU W enhui N I X i aol i n g X U B i n Q I N X i ny u De p art ment of General s u r gery , Z hon gs han H os pi t al , Fu d an U ni versi t y , S han g hai 200032 , Chi na Abstract Objective :To const ruct t he pancreatic cancer cell line panc022MUC1 t hat could exp ress t he MUC1 p rotein. Meth2
ods : In vit ro , t he plasmid pcDNA32MUC1 was t ransfected into t he pancreatic cancer cell line panc02 by t he Lipofectamine2000 and t he empty plasmid pcDNA3 t ransfected cell line was taken as cont rol. After t ransfection , the G418 was used to select t he monoclonal pancreatic cancer cell line panc022MUC1 . Results : The monoclonal pancreatic cancer cell line panc022MUC1 could exp ress MUC1 which was confirmed by t he Western blot and immunofluo rescence. Then in t he animal model , it co uld fo rm
2 结 果 2 . 1 单克隆细胞检测结果 2 . 1 . 1 Western blot 检测结果 单克隆细胞 株 panc022MU C12C 及 panc022MU C12F 可 见 MU C1 表达 ,而对照细胞株 panc022Neo 未见 MU C1 表达 , 在其下实验中以 panc022MU C12C 作为实验用细胞 株 ,简称为 panc022MU C1 (图 1) ,转染空质粒的对 照细胞简称为 panc022Neo 。
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充分裂解细胞 ,10 000 r ·min - 1 离心 5 min ,取上清 液 。PA GE 电 泳 , 转 膜 。采 用 鼠 抗 VN TR 单 抗 VU3C6 为一抗 , H RP 标记的羊抗鼠 Ig G 为二抗 。 1 . 3 . 2 免疫荧光检测 单克隆细胞培养于 12 孔板 中 ,待细胞完全贴壁融合生长后 ,弃去上清液 ;4 ℃以 4 %甲醛固定贴壁细胞 30 min ,然后以穿孔液渗透细 胞 ,5 % BSA 封闭细胞 ;BSA 封闭后 ,各孔细胞予以 VU3C6 (1 :200) 标记细胞 ;一抗标记后细胞再以相应 的二抗标记 。最后细胞予以 DAPI (1 :10 000) 标记 , 再于荧光显微镜下观察细胞 MUC1 表达情况。 1 . 4 小鼠成瘤实验 1 . 4 . 1 小鼠成瘤实验 6～7 周雌性 C57BL/ 6 小 鼠随机分为两组 ,分别在左前肢腋窝皮下接种肿瘤 细 胞 panc022MU C1 及 panc022Neo ( 1 ×106 / 100 μL/ 只) ,每组 6 只 。每 2～3 d 观察肿瘤生长情况 , 测量肿瘤长径 (a) 及短径 ( b) 1 次 ,肿瘤体积按如下 公式计算 :体积 ( mm3 ) = a ×b2 / 2 。 1 . 4 . 2 病理 H E 染色 小鼠用颈椎脱臼法处死后 , 切除皮下肿瘤组织 ,以 4 %甲醛固定 , 常规石蜡包 埋 ,4 μm 切片 。常规 H E 染色后显微镜下观察细胞 形态 。
t umo rs in t he no rmal C57BL/ 6 mice and immuno histological examinatio n showed t hat t his cell line co uld exp ress MUC1 in vivo . Conclusions : This cell line panc022MUC1 could exp ress MUC1 and it co uld form t umors in t he no rmal mice.
1 . 4 . 3 免疫组织化学检测 脱蜡 、水化 , PBS 清 洗 ,滴加 3 % H2 O2 ,室温静置 10 min ,抗原修复后滴 加正常 血清 封闭 液 , 室 温 孵 育 20 min , 滴 加 Ⅰ抗 VU3C6 ( 1 : 100 ) 50 μL , 4 ℃过 夜 。37 ℃复 温 45 min ,滴加 Ⅱ抗羊抗鼠单抗 Ig G(1 : 1 000) 50 μL ,室 温静置 1 h ,DAB 显色 、苏木精复染 ,盐酸乙醇分化 , 脱水 、透明 、封片 、显微镜检查 。
摘要 目的 :构建表达黏蛋白 1 (MUC1) 的小鼠胰腺癌细胞系 panc022MUC1 。方法 :体外以脂质体 2000 (Lipofectamine 2000) 转染 pcDNA32MUC1 质粒到小鼠胰腺癌细胞系 panc02 中 ,并以空载质粒 pcDNA3 转染细胞为对照 。转染细胞再经 G418 压 力筛选单克隆细胞株 ,并接种于小鼠皮下进行成瘤实验 。结果 :单克隆细胞株 panc022MUC1 经 Western blot 检测可见 MUC1 表达 ;细胞免疫荧光检测可见细胞膜上有 MUC1 表达 。动物接种实验证实该细胞可在正常小鼠皮下成瘤 ,免疫组织化学检测 可见该细胞系在 C57BL/ 6 小鼠皮下接种胰腺癌模型中可表达 MUC1 。结论 :构建的胰腺癌细胞系为可表达 MUC1 的单克隆 细胞系 ,且该细胞系可在正常 C57BL/ 6 小鼠中成瘤 。 关键词 胰腺癌 ; 细胞系 ; 黏蛋白 1 中图分类号 R735. 9 文献标识码 A
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中国临床医学 2010 年 4 月 第 17 卷 第 2 期 Chinese Journal of Clinical Medicine ,2010. Vol. 17 ,No. 2
图 1 单克隆细胞株 panc022Neo、panc022MUC12C 及 panc022MUC12F Western blot 电泳结果
2 . 1 . 2 细胞免疫荧光检测结果 图 2 可见 panc022 MU C1 单克隆细胞膜表面表达 MU C1 ,而转染空质
图 42a panc022MUC1 细胞光镜( ×40) 下形态
图 3 panc022Neo 及 panc022MUC1 细胞系在 C57BL/ 6 小鼠中成瘤实验
2 . 2 . 2 H E 染 色 结 果 图 42a 、图 42b 分 别 为 panc022MU C1 细胞及 panc022Neo 细胞接种小鼠成 瘤后组织 H E 染色光镜 ( ×40) 下的形态 ,两者间无 明显的形态学差异 。
基金项目 :上海市科委生物医药重大项目( 编号 :06DZ19009) ; 复旦大学青年骨干基金( 编号 :S261) 通讯作者 秦新裕 , E2mail :qin. xinyu @zs2ho spital. sh. cn
gen plasmid midi kit) 购自上海吉泰生物工程公司 , 脂质 体 2000 ( Lipofectamine 2000 ) 购 自 美 国 In2 vit ro gen 公司 , G418 购自美国 Invivogen 公司 ,鼠抗 人 MU C1 单抗 V U3C6 购于美国 Chemico n 公司 , 鼠抗人 Tubulin 单抗购于 Sigama 公司 ,羊抗鼠抗体 Ig G 购于上海晶美生物工程公司 。 1 . 2 单克隆细胞株筛选 依照 Qiagen plasmid mi2 di kit 操作方法进行质粒抽提 ,转染前 1 d ,将小鼠胰 腺癌细胞系 panc02 按照 2 ×106 ·mL - 1 加入到 6 孔 培养板中 , 每孔 2 mL 。按照 Lipofeactamine 2000 操作手册进行转染操作 ,且以空质粒 pcDNA3 转染 细胞作为对照 。转染后细胞予以 G418 压力筛选 , 获得 单 克 隆 细 胞 株 , 分 别 称 为 panc022MU C1 及 panc022Neo 。 1 . 3 单克隆细胞检测 1 . 3 . 1 Western blot 检测 单克隆细胞培养后 , PBS 洗涤培养皿 3 次 ,加 200 μL PLB 裂解液 ,刮取 细胞 ,收集入 1 . 5 mL Eppendorf 管中 ,于震荡器上
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Chinese Journal of Clinical Medicine ,2010. Vol. 17 ,No. 2 中国临床医学 2010 年 4 月 第 17 卷 第 2 期
·论著 ·
表达 M UC1 的小鼠胰腺癌细胞系的构建及成瘤实验
戎叶飞 靳大勇 吴文川 楼文晖 倪晓凌 徐 彬 秦新裕 (复旦大学附属中山医院普外科 ,上海 200032)
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
Key Words Pancreatic cancer ; Cell line ; MUC1
目前胰腺癌动物模型以裸鼠为主 ,所用的细胞 系大多为人源性的肿瘤细胞 ,然而由于裸鼠免疫系 统缺陷 ,因而不是理想的肿瘤免疫治疗模型 。本实 验构建表达全长黏蛋白21 ( MU C1) 的小鼠胰腺癌细 胞系 ,初步探讨该细胞系在 C57/ BL6 小鼠体内的成 瘤效应 。 1 资料与方法 1 . 1 材 料 表 达人 类 全 长 MU C1 的 质 粒 pcD2 NA32MU C1 由美国匹兹堡大学 Finn[1 ] 赠送 ,小鼠 胰腺癌细胞系 panc02 由美国 A nder so n 肿瘤中心[2 ] 赠送 ,pcDNA3 空质粒由上海交通大学医学院免疫 所提供 。6～7 周雌性 C57BL/ 6 小鼠购于上海斯莱 克实验动物公司 ,所有动物饲养于上海交通大学医 学院实验动物中心 ,清洁级 。质粒抽提试剂盒 (Qia2
粒的 单 克 隆 细 胞 panc022Neo 的 细 胞 膜 表 面 无 MU C1 表达 ,证实构建细胞系为表达 MU C1 的单克 隆细胞系 。
图 2 单克隆细胞免疫荧光检测
2 . 2 小鼠成瘤实验结果 2 . 2 . 1 小鼠成瘤实验结果 两组正常小鼠分别接 种 panc022Neo 及 panc022MU C1 细胞 ,两组间肿瘤 细胞生长速度相当 ,第 24 天时肿瘤体积无明显差异 ( P = 0 . 4 ,图 3) ,提示该转染人类 MU C1 的单克隆 细胞株 panc022MU C1 可以在正常小鼠中成瘤且其 肿瘤成瘤效应未见明显改变 。