免疫组化(IHC)实验具体步骤及说明

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免疫组化（IHC）实验具体步骤及说明

免疫组化（IHC）实验具体步骤及说明免疫组化（IHC）实验具体步骤及说明一、试剂和溶液乙醇: 无水乙醇，95%乙醇，85%乙醇，70%乙醇抗原修复液: 0.01M 的柠檬酸钠缓冲液：58.82g 柠檬酸三钠及7.56g 柠檬酸溶于200ml 纯水，调pH 至6.0，纯水1:100 稀释为工作液3%过氧化氢-甲醇: 30%的过氧化氢与无水甲醇1:9 稀释10X PBS: 80g NaCl，2g KCl, 14.4g Na2HPO4 和2.4g KH2PO4 加1 L 纯水，调pH 至7.4 洗涤液: 1×PBS：纯水稀释10× PBS；1× PBST：含0.05% Tween-20 的1×PBS（1×PBST）super block，生物素标记的UltraTek Anti-Polyvalent 二抗，酶标亲和素UltraTek HRP，DAB 显色试剂盒：Cat. KT1002a 抗体稀释液：3%BSA-PBS 0.5%盐酸-乙醇：0.5～1%盐酸，95.0-95.5%乙醇苏木素：苏木精2g 溶于250ml 无水乙醇，十六水合硫酸铝17.6g 溶与750ml 纯水，以上溶液充分混合，加入碘酸钠0.2g 和冰醋酸20ml二、实验步骤1.组织固定：烘箱温度65-75℃ 30min 或者65℃过夜；2.脱蜡：二甲苯浸泡三次，每次10 分钟；3.水化：依次经过无水乙醇，95%乙醇，85%乙醇，70%乙醇浸泡，每次5min；4.洗涤：自来水冲洗1 次，PBS 浸泡3min；5.抗原修复：放入稀释100 倍的柠檬酸盐缓冲液(pH6.0) 中，高压锅煮沸10min，常温冷却30min；6.洗涤：纯水浸泡2 次，PBS 浸泡1 次，每次3min；7.灭活酶：室温下3%过氧化氢-甲醇暗处处理切片15min；8.洗涤：纯水浸泡1 次，PBS 浸泡2 次，每次3min；9.封闭：加入适当体积的super block（KT1002a Reagent A），37℃温箱孵育5min；10.洗涤：纯水浸泡1 次，PBS 浸泡2 次，每次3min；11.一抗：加入反应体积为0.15ml，适合浓度的一抗, 37℃ 湿盒孵育60min。

免疫组化相关步骤

免疫组化相关步骤免疫组化（immunohistochemistry，IHC）是一种基于抗原抗体反应的方法，用于检测组织或细胞中其中一种特定蛋白质的表达。

下面将详细介绍免疫组化的相关步骤。

免疫组化的步骤包括样品制备、抗原修复、阻断、一抗反应、二抗反应和染色，具体如下：1.样品制备：首先，需要获取组织标本。

通过活体组织切片、细胞涂片或冷冻切片等方法制备标本。

制备好的标本需要保持完整和有代表性，通常要求切片不超过5μm厚。

2.抗原修复：组织切片在固定过程中会损害抗原的完整性，因此需要进行抗原修复，以恢复抗原的表达。

常用的抗原修复方法包括热解修复（如加热、压力煮等）和酶解修复（如胰蛋白酶消化等）。

3.阻断：组织切片会与非特异抗体结合，影响免疫反应的特异性，因此需要进行阻断。

常用的阻断方法包括用牛血清白蛋白（BSA）或奶粉进行阻断，以防止非特异性背景信号的产生。

4.一抗反应：将含有特异性抗体的试剂加到组织切片上，使其与目标抗原结合。

特异性抗体可针对不同的抗原进行选择，如研究一些蛋白质的表达，可以选择该蛋白的特异性抗体。

5.二抗反应：一抗与抗原结合后，需要加入与该一抗来自不同物种的二抗。

二抗通常是免疫出来的，其与一抗结合后，可形成复合物，具有荧光或酶标记。

6.染色：最后，通过染色方法来显示抗原的表达。

染色可以是荧光染色或酶标染色。

荧光染色利用特定颜料对特异性标记的抗体进行荧光标记，并在荧光显微镜下观察。

酶标染色则使用酶标记的二抗，再加入相应的底物进行染色。

除了以上的基本步骤1.控制组：为了验证实验是否准确，通常需要设置阴性和阳性对照组。

阴性对照组通常是替代一抗的种属、浓度和机制抗体；阳性对照组是已知具有目标蛋白表达的组织切片。

2.负载密度和反应时间：一抗的负载密度和反应时间需要优化，以确保对目标蛋白的增强标识，同时最大限度地减少背景信号。

3.显微镜观察和图像分析：观察染色结果时，要选择合适的显微镜，以获得清晰的图像。

免疫组化检测

免疫组化SOP一．总纲（一）技术原理免疫组化全称为免疫组织化学技术（immunohistochemistry，IHC）。

基本原理是抗原与抗体特异性结合，具体为带有显色剂标记的抗体在组织细胞上与抗原特异性结合，对抗原进行定性、定位和定量检测的技术。

（二）研究进展二．实验操作免疫组化基本操作流程如下：（一）切片脱蜡水化脱蜡水化的目的是将石蜡包裹住的抗原暴露于与抗体结合的水环境中，便于两者结合。

若脱蜡和水化不全，则易出现局灶性反应和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。

1.实验操作如下：（1）烤片：将石蜡切片置于烤箱中烤片60min；（2）脱蜡：入二甲苯5min×3；（3）水合：100%乙醇，5min×2；95%乙醇5min；70%乙醇5min；ddH2O浸洗5min ×2。

2.技术要点：（1）注意无水乙醇和二甲苯的新旧程度，若出现雾状，则需及时更换；（2）60℃烘箱烤片时间勿过久；（二）消除内源性过氧化物酶由于在红细胞、中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性细胞、出血坏死组织等组织细胞中含有内源性的过氧化物酶，在DAB显色时，可与HRP一样催化底物显色。

为排除干扰，可用过氧化氢溶液消除该酶的活性。

1.实验操作如下：（1）ddH2O漂洗5min×2；（2）滴加3%H2O2于切片组织细胞上，湿盒中37℃孵育20min；（3）PBS漂洗5min×22.技术要点：（1）过氧化氢消除内源性过氧化酶应避光处理。

（三）抗原修复与封闭液封闭由于固定液和石蜡导致组织蛋白的氨基酸残基在分子内或分子间形成醛基，或发生蛋白交联，导致蛋白质三级结构或四级结构改变，出现空间位阻，从而封闭抗原决定簇，阻碍抗体与抗原的结合。

因此，需要进行抗原修复暴露抗原。

修复方法有很多种，常见的为高温高压修复法。

封闭目的为细胞表面（特别是淋巴造血组织、淋巴细胞、单核细胞等）存在Fc受体，可与抗体（Ig）结合，形成非特异性染色。

简述免疫组化实验流程及注意事项

简述免疫组化实验流程及注意事项English Answer:Immunohistochemistry (IHC) is a powerful technique used to visualize the expression and localization of specific proteins within tissue sections. It involves the use of antibodies to bind to the target protein, followed by enzymatic detection to produce a colored precipitate.IHC Experiment Workflow:1. Tissue preparation: Tissue samples are fixed, dehydrated, and embedded in paraffin wax or frozen for optimal preservation.2. Sectioning: Thin tissue sections (typically 5-10 μm thick) are cut using a microtome and mounted on slides.3. Deparaffinization and rehydration: Paraffin-embedded sections are deparaffinized with xylene or other solventsand rehydrated through a graded series of ethanol solutions.4. Antigen retrieval: Certain antigens may requireheat-induced or enzyme-induced antigen retrieval to expose their epitopes.5. Blocking: Non-specific binding is blocked using a blocking solution, such as bovine serum albumin or goat serum.6. Primary antibody incubation: The specific primary antibody is applied to the tissue section and incubated to allow binding to the target protein.7. Washing: Excess unbound antibody is removed by washing with a buffer solution.8. Secondary antibody incubation: A secondary antibody conjugated to an enzyme (such as horseradish peroxidase or alkaline phosphatase) is added to bind to the primary antibody.9. Washing: Excess secondary antibody is removed by washing with a buffer solution.10. Chromogenic substrate application: A chromogenic substrate is added to the section, which reacts with the enzyme bound to the secondary antibody to produce a colored precipitate.11. Counterstaining: The tissue section is counterstained with a dye, such as hematoxylin, to provide contrast and cellular visualization.12. Mounting: The stained section is mounted with a coverslip for preservation and examination.注意事项：Use high-quality antibodies specific for the target protein.Optimize antibody concentrations and incubation times to achieve optimal staining results.Control for non-specific staining by using appropriate negative controls.Interpret results with caution, considering factors such as tissue preparation, antibody specificity, and staining intensity.中文回答：免疫组化实验流程：1. 组织制备，对组织样本进行固定、脱水、包埋于石蜡中或冷冻，以获得最佳保存效果。

免疫组化超详细步骤

免疫组化超详细步骤免疫组化（immunohistochemistry，IHC）是一种通过使用抗体来检测组织或细胞中特定蛋白质的方法。

该技术的原理基于抗体与其特异性抗原结合的特性。

下面将详细介绍免疫组化的步骤。

第一步，固定组织：将待检测的组织或细胞固定在载玻片上。

常用的固定剂包括甲醛和乙醛，可通过浸泡、喷洒或滴加等方式施加在组织上，使细胞和蛋白质保持其形态和结构。

第二步，脱水：将固定的组织经过一系列浓度逐渐升高的酒精溶剂中处理，以去除水分，使组织逐渐与酒精混合。

第三步，脱脂：将组织在适当的溶剂（如二甲苯或苯）中脱脂，以去除酒精和脂质。

第四步，石蜡浸渍：将脱脂的组织浸泡在液态石蜡中，使其渗透并替代脱脂剂和二甲苯，然后固化组织。

第五步，切片：使用微tome切割固化的样本，制备出薄片，常见的切片厚度为4-5μm。

第六步，脱离：将切好的薄片与载玻片分离，常用的方法是利用热水浸泡薄片，使其松散分离。

第七步，抗原修复：利用高温和压力的方法，如蒸汽煮沸或压力锅，对薄片上的蛋白质进行解散，以恢复其免疫活性。

第八步，阻断非特异性结合：使用一些蛋白质如牛血清蛋白、动物血清或其他蛋白质来包裹薄片上的非特异性结合位点，以减少假阳性反应。

第九步，抗体处理：将特异性抗体加到薄片上，与待检测的蛋白质结合。

抗体可以是原代抗体（直接与靶蛋白质结合）或二抗（与原代抗体结合）。

第十步，洗涤：用缓冲液洗去未结合的抗体，并去除阻断剂和非特异性结合物。

第十一步，检测：将检测试剂滴加到薄片上，以产生特定色素或荧光信号。

常用的检测方法包括酶标法（如辣根过氧化物酶法，HRP法）和荧光标记（如荧光素酶法，AP法）。

第十二步，显微镜检查：使用显微镜观察薄片上的染色结果，评估标记物的定位和表达情况。

通过上述步骤，免疫组化技术可以帮助研究人员检测并定位组织或细胞中感兴趣的蛋白质。

其广泛应用于生物医学研究、临床诊断以及药物研发等领域，为揭示疾病的分子机制和开发新的治疗手段提供了重要的工具。

免疫组化il-1β实验步骤

免疫组化il-1β实验步骤免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种用来检测组织中特定蛋白质表达的方法。

IL-1β是一种重要的细胞因子，它在免疫和炎症过程中发挥着重要作用。

进行IL-1β的免疫组化实验需要严格遵循一系列步骤，以确保实验结果的准确性和可靠性。

1. 样本处理，首先，需要准备组织样本，可以是组织切片或细胞培养物。

对于组织样本，需要进行固定、脱水和包埋等处理，以保持样本的完整性和稳定性。

2. 抗体处理，选择合适的IL-1β抗体，确保其特异性和敏感性。

将样本切片或细胞培养物与IL-1β抗体孵育，使抗体与目标蛋白结合。

3. 洗涤，将样本进行洗涤，去除未结合的抗体和其他杂质。

4. 二抗处理，加入与IL-1β抗体结合的二抗，如辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，以增强IL-1β的检测信号。

5. 显色反应，加入适当的显色底物，使IL-1β呈色反应产生，常用的底物包括DAB（二氧化苯胺）或VIP（维克罗尼亚紫）。

6. 停止反应，在IL-1β显色适当程度后，通过停止反应来终止显色过程，常用的方法是将样本浸入脱离液中。

7. 脱水和封片，对样本进行脱水、透明化处理，并最终封片，以便于显微镜观察和图像获取。

需要注意的是，在整个实验过程中，需要严格控制实验条件，包括温度、时间、试剂浓度等，以确保实验的重复性和可比性。

此外，还需要进行负对照和阳性对照实验，以验证实验结果的准确性和特异性。

总之，IL-1β的免疫组化实验是一个复杂而精细的过程，需要熟练的操作和严谨的态度。

通过严格遵循上述步骤，可以获得准确可靠的IL-1β表达情况，为相关研究提供重要的实验数据支持。

免疫组化原理步骤及试剂

免疫组化原理步骤及试剂免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种广泛应用于生物医学领域的实验技术，用于检测组织切片中特定抗原的分布和表达水平。

它结合了免疫学和组织学的原理，能够在组织切片上定位和检测抗原，并通过染色方法将抗原可视化，从而实现对抗原的定性和定量分析。

免疫组化实验的步骤通常包括固定、脱脂、抗原修复、抗体和检测步骤。

下面将详细介绍每个步骤的操作和常用试剂。

1.组织固定：组织固定的目的是保持组织结构完整并固定细胞的抗原。

常用的固定试剂包括10%中性缓冲福尔马林（10% neutral buffered formalin，NBF）和乙醇等。

2.脱脂：脱脂是将组织切片中的脂质去除，以提高抗体对抗原的结合效率。

常用的脱脂试剂包括二甲苯、甲醛和乙醚等。

3.抗原修复：抗原修复是为了使被固定的组织恢复原样，增强抗原的可检测性。

抗原修复的方法包括热处理、酶解法和pH调整等。

常用的抗原修复试剂包括热解剂例如EDTA缓冲液、Tris-EDTA缓冲液，酶解剂例如胰蛋白酶和蛋白酶K，以及甲酸、盐酸等酸性溶液。

4.抗体：5.检测：检测步骤用于将抗原-抗体复合物可视化。

这通常通过染色方法完成。

常用的染色方法包括免疫酶标记、免疫荧光和免疫金标记等。

免疫组化实验所需的试剂种类繁多，下面列举一些常用的试剂：1. NBF（10% neutral buffered formalin）：用于组织固定，保持组织形态完整。

2.二甲苯：用于脱脂步骤，去除组织中的脂质。

3.甲醛：用于脱脂步骤。

4.乙醚：用于脱脂步骤。

5.EDTA缓冲液：用于抗原修复的热解剂。

6. Tris-EDTA缓冲液：用于抗原修复的热解剂。

7.胰蛋白酶：用于抗原修复的酶解剂。

8.蛋白酶K：用于抗原修复的酶解剂。

9.盐酸：用于抗原修复的酸性溶液。

10.一抗：选择特异性良好的一抗抗体，常用的有多克隆和单克隆抗体。

11.二抗：用于检测一抗结合的抗体，常用的二抗有反兔、反小鼠或反人的多克隆抗体。

免疫组化原理和步骤

免疫组化原理和步骤免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种广泛应用于组织学和细胞学研究中的实验方法，主要用于检测和定位蛋白质在组织或细胞中的分布和表达水平。

它结合了免疫学原理和组织学技术，通过使用特异性的抗体和染色剂来实现对目标蛋白质的检测和可视化。

免疫组化的原理主要是利用抗体的高度特异性与抗原相结合，然后使用染色技术来显示抗原的位置。

该技术的基本原理可分为抗原-抗体反应、信号放大和信号显示三个步骤。

第一步：抗原-抗体反应免疫组化的第一步是选择合适的抗体，通过与目标蛋白质的特异性结合来形成抗原-抗体复合物。

抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。

单克隆抗体具有高度特异性，只能结合到特定的抗原上。

多克隆抗体具有高度敏感性，可以结合多个位点，从而实现信号放大。

通常，为了提高抗原的可检测性，需要对组织样本进行抗原修复处理。

这可以通过热处理（如蒸汽加热、微波加热）或酶切处理来实现。

修复可以解除组织样本中抗原与蛋白质结构之间的交联，增加抗体的渗透性和可结合性。

当抗原-抗体反应发生时，可通过一系列化学反应来形成抗原-抗体复合物。

例如，可以使用二抗来与抗原-抗体复合物结合，然后使用辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）标记的二抗来与二抗结合。

该反应可形成稳定的抗体-酶复合物。

第二步：信号放大由于抗原-抗体复合物的信号很弱，通常需要进行信号放大以便更好地检测到目标蛋白质。

放大信号的方法有很多种，其中最常用的是酶免疫标记联合酶放大技术。

酶免疫标记是通过将抗体与酶结合，使其能够催化特定的化学反应来产生荧光、色素或光学信号。

常用的酶免疫标记包括辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。

这些酶能够催化荧光素、二苯基胺、硝基蓝等底物的氧化还原反应，从而产生可视化的信号。

酶放大技术常用的方法包括：免疫酶化学法（如DAB法）、免疫荧光法和免疫酶学荧光混合法等。

这些方法可通过将底物转化为可见的色素或荧光信号来标记抗原-抗体复合物，从而实现目标蛋白质的检测和定位。

免疫组化步骤范文

免疫组化步骤范文免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种应用于组织学研究中的技术方法，用于检测和定位特定的抗原或蛋白质在组织或细胞中的表达。

免疫组化可以提供细胞和组织的一些重要信息，如蛋白质分布、定位和表达的数量。

以下是免疫组化的一般步骤：1.材料准备：-组织切片：将组织固定、包埋和切片。

-切片预处理：将切片置于载玻片上，并进行脱脂、水洗和固定处理。

2.抗原修复：-如果组织经过了形态改变或抗原损失，需要对切片进行抗原修复。

常见的方法有热处理（如煮沸、加热蒸汽、加热压力等）和酶处理（如胰蛋白酶、丝氨酸蛋白酶等）。

3.阻断非特异性结合：-切片上的非特异性结合位点可能与前体抗体非特异性结合，导致假阳性结果。

因此，需要将非特异性结合位点进行阻断，通常使用牛血清蛋白（如BSA或NGS）或非特异性抗体进行阻断。

4.一抗处理：5.洗涤：-用缓冲液对切片进行洗涤，以去除未结合的一抗和非特异结合的物质。

6.二抗处理：-加入二抗，即针对一抗的抗体。

二抗通常是与标记物连接的抗体，可以是荧光染料、酶或金纳米等。

7.洗涤：-用缓冲液对切片进行洗涤，以去除未结合的二抗和非特异性的结合。

8.标记物检测：-标记物可以是荧光染料、酶或金纳米等，它们与二抗结合形成复合物，并可通过荧光显微镜或酶反应显色方法来观察。

9.洗涤和封片：-用缓冲液对切片进行彻底的洗涤，以去除未结合的标记物或荧光染料。

然后，将切片用有机溶剂除去水分，然后使用封片剂覆盖并封装切片。

10.观察和分析：-将切片放入显微镜下观察和分析，如荧光显微镜观察、酶反应显色方法观察等。

可以通过比较反应强度、分布和定位等特征来分析抗原或蛋白质在组织或细胞中的表达情况。

以上是一般的免疫组化步骤，具体操作可能会根据实验设计和研究目的的不同而有所差异。

在进行免疫组化实验时，需要严格控制实验条件和相应的质量控制，以确保结果的可靠性和准确性。

此外，还需要根据具体的实验需求选择合适的抗体、标记物和检测方法，以及根据组织类型和抗原性质选择适当的抗原修复和阻断非特异性结合的方法。

免疫组化染色操作步骤

免疫组化染色操作步骤免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种在组织学上，通过对细胞和组织中一些免疫反应物的特异性染色来研究蛋白质表达和分布的方法。

免疫组化染色操作步骤一般包括以下几个主要步骤：组织固定、切片、抗原修复、抗原阻断、一抗和二抗染色、显色反应和染色质反应控制。

下面将详细介绍每个步骤。

一、组织固定组织固定是将新鲜组织固定在组织学玻片上以保持其形态和结构。

常用的固定剂有甲醛和乙酸（酒精）。

固定剂的选择应根据研究目的和检测的抗原选择合适的固定剂。

甲醛固定对细胞膜蛋白质有较好的保护作用，适用于一些膜蛋白的免疫染色；而乙酸（酒精）固定可以在较短时间内固定组织，适用于快速染色的情况。

二、切片固定好的组织需要进行切片处理，将其切割成5-10微米厚的切片。

常用的器械有冰冻刀、滑刀等。

冰冻刀用于切割冰冻组织，滑刀用于切割固定组织。

切割好的组织切片需要进行干燥处理。

三、抗原修复抗原修复是为了恢复组织中被固定剂破坏的抗原形态。

抗原修复的方法一般有热诱导抗原修复和酶诱导抗原修复两种。

热诱导抗原修复是将切片浸泡在高温的缓冲液中进行加热处理，常用的缓冲液有PBS、Tris等。

酶诱导抗原修复是通过加入蛋白酶K等酶来修复抗原。

四、抗原阻断抗原阻断是为了阻止非特异性的结合，减少假阳性结果。

一般是通过加入牛血清白蛋白（BSA）或小鼠IgG等蛋白质来阻断非特异性结合位点。

五、一抗和二抗染色一抗是指充分体内或体外免疫后所制备的单克隆或多克隆抗体。

在进行一抗染色前，需要对切片进行预处理，如使用过氧化氢或金胶子等对内源性酶进行体外灭活。

一抗的稀释倍数需要根据标示规定，也可以进行实验室优化。

一般在4℃下孵育过夜。

第二天，用PBS进行洗涤后加入二抗。

二抗是对一抗的特异性抗体，通常是兔抗小鼠或小鼠抗兔的抗体。

加入二抗后，需要进行适当时间的孵育，一般是30分钟到1小时，然后用PBS进行洗涤。

六、显色反应显色反应是为了检测所免疫染色的反应物。

免疫组化实验步骤及常见问题分析

免疫组化实验步骤及常见问题分析免疫组化实验步骤及常见问题分析免疫组化实验流程1.样品制备2.组织固定：根据要求收集人或动物的组织用于IHC分析，冲洗并用固定剂（一般用甲醛）进行固定3.组织包埋：将经甲醛固定的组织嵌入石蜡，以长期保持其天然形状和组织结构4.切片安装：将组织样品在切片机上切片，并转移至载玻片上干燥保持其形态5.脱蜡水化：因切片上的石蜡会妨碍染色，所以需将切片上的石蜡溶出，并水化。

脱蜡或水化不全容易造成非特异性背景着色（一般的脱蜡水化步骤是：将切片依次浸入二甲苯Ⅰ10min-二甲苯Ⅱ10min-无水乙醇5min-95%无水乙醇5min-90%无水乙醇5min-80%无水乙醇5min-70%无水乙醇5min-50%无水乙醇5min-蒸馏水5min×3，进行脱蜡水化）。

6.抗原修复：由于组织在甲醛固定过程中，蛋白之间发生了交联及醛基的封闭从而掩盖抗原决定簇。

可以通过高压加热修复抗原，使细胞内抗原决定族暴露，从而提高抗原检测率。

7.非特定位点封闭：为了防止一抗的非特异性结合造成假阳性，可以选用BSA、羊血清等封闭非特异性结合位点。

封闭血清来源一般与二抗保持一致，室温封闭10-30min。

8.样品染色一抗、二抗孵育：抗体孵育时间、温度及浓度等因素对染色结果都存在很大影响。

在4℃下反应缓慢，背景较浅；37℃反应较快时间较短；而室温介于两者之间，选择室温有利于实验的进行。

二抗一般室温孵育30min。

底物显色：基于与酶缀合的二抗，抗原通过生色或荧光方式直接检测。

复染封片：组化染色后进行复染可以衬托出组织形态结构，常用的复染剂有苏木精、曙红、甲基绿、DAPI和Hoechst荧光染色。

观察结束后使用中性树胶进行封片，可以长久保存。

免疫组化实验常见问题分析1. IHC实验结果显色过深一抗浓度过高或孵育时间过长——降低一抗浓度或减少孵育时间孵育温度过高——选择4℃或室温孵育2. 实验结果存在非特异性显色石蜡切片脱蜡不够——延长脱蜡时间蛋白封闭不充分——增加蛋白封闭时间组织富含内源性生物素与过氧化物酶——使用相关试剂进行封闭3. 实验结果显色弱或无染色一抗浓度过低或孵育时间过短——增加一抗浓度或延长孵育时间组织中无目的抗原的表达：一抗种属来源与二抗不匹配免疫组化实验注意事项切片脱蜡和水化要充分，加反应液时要覆盖组织充分；每次加液前甩干洗涤液，同时防止干片。

蛋白实验技术——免疫组化实验步骤

蛋白实验技术——免疫组化实验步骤免疫组化（immunohistochemistry，IHC）是一种常用的分子生物学研究手段，用于检测和定位特定蛋白质在组织或细胞中的表达和分布情况。

以下是免疫组化实验的常见步骤：1.材料准备：-组织样本：一般使用福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片。

-抗体：根据要检测的蛋白质选择特异性和高亲和力的一抗。

还需选取对该抗体特异性有所了解的阴性对照抗体作为对照。

-二抗：选择特异性与一抗结合的二抗，二抗常标记有荧光素、酶或金颗粒等。

-染色剂：包括染色素、转化底物和显色剂等。

2.样本处理：-脱蜡：将石蜡包埋的组织切片放置在58-60℃热箱中，反复浸泡于甲醇和乙醇中将石蜡脱除。

-抗原修复：使用热蒸汽或酶解剂等方法，将福尔马林固定的组织切片中的抗原开放，以方便抗体与抗原结合。

-除脂：用乙醚或甲醚等化学溶剂洗涤，去除脂肪质的干扰。

3.抗体处理：-阻断剂处理：使用阻断剂（如牛血清蛋白）阻断切片中非特异性结合位点。

-一抗处理：将选择的抗体稀释于阻断液中，加到组织切片上，保持温度和湿度有利于抗原结合。

-二抗处理：根据实验需要，选择将一抗特异性结合的二抗标记，加到组织切片上。

二抗的选择需要根据实验所用的检测方法进行确定。

4.检测与显色：-荧光染色：使用激光产生的特定波长的光源，观察组织中特异性荧光的发光。

-酶联免疫组化：在二抗的标记中常使用辣根过氧化物酶（HRP），添加辣根过氧化氢-二甲基氨基甲酸酯（DAB）进行染色反应。

-光镜观察：使用透射光镜观察染色的结果。

通过比较阳性对照和阴性对照组织切片，可以确定染色结果的特异性。

5.结果分析：-显微镜下观察：根据阳性对照组织切片和实验组织切片的染色情况进行观察和比较。

-计算和分析：可以根据染色结果的强度和程度进行定量研究，使用图像分析软件进行图像处理和数据分析。

此外，免疫组化实验还需要注意以下几点：-尽可能使用正常组织作为阳性对照，使用未加抗体或添加非特异性免疫血清的组织作为阴性对照，以确保实验结果的准确性。

免疫组化操作规程

免疫组化操作规程
《免疫组化操作规程》
免疫组化（Immunohistochemistry, IHC）是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断中的技术，其操作规程的严谨性和标准化对于获得准确可靠的结果至关重要。

下面是一份免疫组化操作规程供参考：
1. 样本处理：将组织标本固定在适当的条件下，然后进行蜡包埋并切片。

注意保护好标本的完整性和质量。

2. 抗原修复：对标本进行适当的热处理或酶处理，以修复由于固定等步骤导致的抗原构象变化。

3. 抗体选择：选择适当的一抗和二抗，确保一抗的特异性和敏感性，二抗的来源和标记物的稳定性。

4. 标本处理：将切片标本进行脱脂、脱水和透明化处理，确保标本的透明度和形态保持完好。

5. 抗体染色：将标本与一抗和二抗分别反应，通过荧光标记或酶标记来检测靶标记的位置和强度。

6. 阅读结果：采用专业显微镜观察标本的染色结果，进行定量分析或者定性分析。

7. 结果验证：通过对照组和阳性对照进行染色结果的验证，确
保结果的准确性。

8. 结果分析：根据染色结果和临床信息进行综合分析，作出科学可靠的结论。

以上是一份免疫组化操作规程的基本内容，但在实际操作中还需要根据具体的实验室条件和要求进行进一步的细化和规范化。

希望这份规程能为从事免疫组化工作的科研人员和临床检验人员提供一些帮助。

免疫组化法实验操作步骤

免疫组化法实验操作步骤免疫组织化学(Immunohistochemistry, IHC)是一种利用抗体与组织中的抗原特异性结合的技术。

它是一种重要的研究方法，可以用于检测和定位组织中的特定蛋白质和其他生化分子。

以下是免疫组织化学实验的一般操作步骤：1.样本处理：a.固定：将待检测的组织样本进行固定处理，以保持其形态结构并保留组织内的抗原。

b.切片：将固定的组织样本切成非常薄的切片（通常为3-5微米厚），并将其放置在载玻片上。

2.抗原解蓝（抗原恢复）：a.对于不同类型的组织样本，选择适当的抗原解蓝方法。

b.抗原解蓝可以通过加热、酶解或其他方法来恢复组织样本中的抗原。

3.阻断非特异性结合：a. 使用一种非特异性的蛋白质来阻断载玻片上未特异性结合的位点，例如牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA)或小鼠免疫球蛋白(Mouse IgG)。

b.加入适当浓度的阻断剂，并孵育片玻片上的切片，以阻断非特异性结合位点。

4.主抗体孵育：a.加入含有特定抗原的主抗体溶液，其可以与组织样本中特定的抗原结合。

b.孵育片玻片上的切片，使主抗体与待检测的抗原结合。

5.洗涤：a.用缓冲液或PBS等洗涤溶液洗涤载玻片上的切片，以去除未结合的主抗体。

6.二抗孵育：b.孵育片玻片上的切片，使辅助抗体与主抗体结合。

7.洗涤：a.再次用缓冲液或PBS洗涤载玻片上的切片，以去除未结合的辅助抗体。

8.信号放大：a.可根据需要，使用染色剂或底物来增强或显色识别待检测抗原的结合位置。

b.例如，使用荧光染料或酶底物，通过显微镜观察或光镜观察，可使抗原可视化。

9.洗涤：a.最后一次用缓冲液或PBS洗涤载玻片上的切片，以去除未结合的染色剂或底物。

10.封片：a.加入适当的封片剂，如富含丙酮的溶液，将载玻片上的切片封装起来，以保护切片和保存染色结果。

免疫组织化学是一种复杂的实验技术，需要仔细的操作和精确的控制条件才能得到准确的结果。

免疫组化操作规程及操作流程

免疫组化操作规程及操作流程免疫组化（immunohistochemistry，简称IHC）是一种利用抗体-抗原反应来检测组织中特定蛋白质表达的方法。

它广泛应用于医学研究和临床诊断中，常用于检测肿瘤标志物、免疫细胞浸润和病毒感染等。

I.免疫组化操作规程1.样本处理a.组织固定：将组织标本进行固定，一般使用10%中性缓冲福尔马林进行固定，固定时间一般为24-48小时。

b.去脂化：对于脂肪较多的组织，需要将其进行去脂处理，可使用二甲苯或其他去脂剂进行处理，处理时间一般为20-30分钟。

2.抗原恢复a.热诱导抗原恢复：将固定的组织样本放入蒸汽气锅中，用缓冲液浸泡标本，加热至高压下，进行抗原恢复处理。

具体温度和时间根据样本类型和抗体要求而定。

b.酶诱导抗原恢复：对于抗原蛋白固定后被交联、无法热诱导恢复的样本，可使用酶解剂（如胰蛋白酶）进行抗原恢复。

3.阻断非特异结合a.使用非特异结合阻断剂：在进行免疫染色之前，需要将非特异结合位点进行阻断，可使用蛋白质阻断剂，如牛血清蛋白（BSA）或鱼凝胶蛋白（FSG）等，在阻断液中孵育样本。

4.抗体反应a.一抗孵育：将目标抗体（一抗）稀释后，滴加于待检样本上，进行孵育，一般时间为1-2小时。

b.二抗孵育：选择免疫印迹试剂盒中对应一抗的二抗，将其稀释后，滴加于待检样本上，进行孵育，一般时间为30-60分钟。

5.染色和显色a.底物酶标：使用底物和酶的复合物，进行染色和显色反应。

常用的底物有DAB（二氨基苯），TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）等，反应时间一般为5-10分钟。

b.荧光染色：若使用荧光标记的二抗，需进行相应波长的激发光照射，观察荧光信号。

6.降解和清理a.用超纯水洗涤：使用超纯水进行标本洗涤，彻底清除底物和底物残留物。

b.孵育升级脱位溶液：将样本浸泡在脱位溶液中，使特异结合的抗体与抗原分离。

c.用盖玻片封装：涂上透明胶和玻片，使其固定在盖玻片上，并封住。

免疫组化实验具体步骤及说明

免疫组化实验具体步骤及说明免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种用于检测组织部分或特定分子的表达、定位和定量的技术。

它基于抗原抗体相互作用的原理，通过特异性的抗体与目标分子结合形成复合物，再通过染色反应显示出目标分子的位置和数量。

IHC广泛应用于癌症诊断、疾病研究和药物开发等领域。

以下是免疫组化实验的具体步骤及说明：1.标本制备：首先，取得切片的组织标本，通常是经过固定和包埋的组织。

然后，将组织切片取下玻片，用去离子水处理。

最后，将切片分别置于乙醇溶液中进行脱水，再用苯酚或其他抗氧化剂处理，以保护切片的蛋白质结构。

2.去蜡：将切片置于细胞清洗液中，用搅拌器在室温下搅拌，去除蜡层。

然后，分别使用乙醇降级脱水和再次用去离子水处理，以去除残留的蜡。

3.抗原检出：使用特定的抗体来检测目标分子。

首先，在切片中添加抗原修复溶液，进行退火和抗原修复，以恢复抗原的免疫原性。

然后，用PBS洗涤切片，去除剩余的抗原修复液，并将切片与蛋白质阻断剂孵育，以防止非特异性结合。

最后，将切片与特异性的初级抗体孵育，以形成抗原-抗体复合物。

4.特异性结合检测：添加特异性的二级抗体，如辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗鼠IgG，与初级抗体特异性结合。

此外，还可以使用荧光标记的二级抗体，以便通过显微镜直接检测目标蛋白质的荧光信号。

完成二级抗体与抗原复合物的结合后，用PBS洗涤切片。

5.信号放大与检测：对于HRP标记的二级抗体，使用辣根过氧化物酶底物，如DAB（二氨基苯类胺）或TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）。

这些底物在酶作用下会形成可见的棕色沉积物。

对于荧光标记的二级抗体，在显微镜下直接检测荧光信号。

6.染色和显微镜观察：将切片用PBS洗涤，然后用余晖蓝染色溶液浸泡，以增强显微镜下观察的对比度。

最后，用水轻轻冲洗切片，除去多余的染色剂。

用显微镜观察切片，评估目标蛋白质的表达和定位。

免疫组化方法和步骤

免疫组化方法和步骤免疫组化（Immunohistochemistry，简称IHC）是一种重要的实验技术，通过使用特异性抗体标记目标蛋白质在组织或细胞内的表达，从而实现对相关分子的定位和定量分析。

免疫组化技术适用于各种生物学研究领域，包括分子生物学、细胞生物学、肿瘤学等，成为了生命科学研究中不可或缺的手段之一本文将介绍免疫组化方法和步骤，包括样品制备、抗体选择、抗体标记、免疫染色反应和结果解读等内容。

1.样品制备在进行免疫组化实验之前，首先需要准备和处理适当的样品。

样品可以是组织切片、细胞涂片、细胞悬液等。

常用的样品制备技术包括固定、包埋和切片等步骤。

例如，对于组织切片，可以使用福尔马林进行固定，然后将组织包埋在石蜡中，最后切割成适当的厚度（通常为4-10μm）。

2.抗体选择选择适当的抗体是进行免疫组化实验的关键。

抗体的选择应基于目标蛋白质的特异性和抗体的靶向性。

常用的抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体。

单克隆抗体能够提供更高的特异性和一致性，而多克隆抗体的优势在于更好的识别多个蛋白质表位。

3.抗体标记为了能够对目标蛋白质进行可视化，需要将抗体标记。

这一步骤通常是通过将抗体与荧光染料、酶或金属颗粒等标记物结合来实现。

常用的标记物有荧光标记物（如荧光素、荧光蛋白等）、酶标记物（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）和金属颗粒（如金、银等）。

选择合适的标记物应考虑实验目的、设备可用性和信号灵敏度等因素。

4.免疫染色反应免疫染色反应是免疫组化实验的核心步骤。

该步骤包括抗原解层、抗体结合、洗涤和可视化等过程。

-抗原解层：解层是为了暴露目标蛋白质，从而使抗体能够与其结合。

解层的方法可以包括热解层、酶解层和酸解层等。

-抗体结合：在解层后，样品与标记抗体的混合溶液孵育在一起，使抗体能够与目标蛋白质结合。

不同的抗体结合时间和温度可能有所不同，需要根据具体实验进行优化。

-洗涤：为了去除未结合的抗体和其他非特异性结合物，需要对样品进行洗涤。

免疫组化操作步骤

免疫组化操作步骤免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种广泛应用于病理学和生物医学研究中，用于检测和定量分析组织或细胞中特定抗原的方法。

它通过将标记有特定抗体的染色剂与细胞或组织中的相应抗原结合，从而实现对抗原的定位和可视化。

以下是免疫组化操作的详细步骤：准备组织样本：1.选择需要研究的组织样本，可以是固定的组织块、冰冻切片或细胞涂片。

2.如果是固定的组织块，使用福尔马林等适当的固定剂进行固定，并进行脱水和包埋。

3.如果是冰冻切片，将组织冷冻在液氮中，使用微型切片机切割薄片。

4.如果是细胞涂片，将细胞均匀涂布在载玻片上。

脱脂和再脱水：1. 对于固定的组织块和细胞涂片，使用低渗透性石蜡溶液（如xylene）进行脱脂，一般需要多次处理。

2.使用梯度酒精浓度（例如100%，90%，80%和70%）进行再脱水处理，每个浓度的浸泡时间一般为5-10分钟。

抗原修复：1.固定的组织块可使用热诱导抗原修复（如加热高压反应釜中）或酶诱导抗原修复（如2%的蛋白酶）进行抗原修复。

2.冰冻切片和细胞涂片不需要抗原修复。

阻断非特异性结合位点：1.使用一种非特异性抗体，如牛血清蛋白、小鼠和兔血清、杂交小鼠兔血清混合物等，进行阻断非特异性结合位点，减少假阳性反应。

一抗和二抗处理：1.加入特异性一抗，该抗体将结合目标抗原。

一抗的浓度根据实验要求和文献建议进行选择。

2.在室温下，对样本进行适当时间的孵育，以便一抗与抗原结合。

4.加入标记有荧光素或酶素的二抗，如荧光素-同种同型抗体或酶标记的抗小鼠或抗兔免疫球蛋白。

5.孵育样本适当时间，以便二抗与一抗结合。

洗涤：1.使用缓冲液对样本进行洗涤，以去除未结合的抗体和其他非特异性的结合物。

2.洗涤的时间和次数根据实验要求和抗体的特性进行调整。

可视化和显色：1.对于荧光标记的二抗，使用荧光显微镜观察并拍摄图像。

2.对于酶标记的二抗，使用适当的显色物质，如DAB（3,3'-二氨基苯啶）或VIP（维泊酶）等，进行显色反应。

免疫组化步骤及原理

免疫组化步骤及原理引言免疫组化（Immunohistochemistry, IHC）是一种用于检测组织样本中特定蛋白质的方法，它结合了免疫学和组织学的原理和技术。

免疫组化在研究和临床诊断中广泛应用，帮助我们了解疾病的发生机制和诊断疾病的标志物。

本文将介绍免疫组化的步骤及其原理。

免疫组化的步骤免疫组化主要包括抗原修复、抗体染色和结果观察三个主要步骤。

下面我们将详细介绍每个步骤的原理和操作流程。

抗原修复抗原修复是免疫组化中的关键步骤之一。

它的主要目的是使组织样本中的抗原蛋白恢复成可检测的状态。

组织样本在经历固定处理后，抗原会发生变性和交联，导致其结构的改变，使其难以与抗体结合。

因此，需要对组织样本进行抗原修复，以使其恢复原有的抗原性。

抗原修复的方法有两种常用的方式：热原修复和酶解原修复。

热原修复使用高温和缓冲液对样本进行处理，恢复抗原的三维结构，使其可用于抗体的结合。

酶解原修复通过使用酶类，如胰蛋白酶、蛋白酶K等，降解组织样本中的蛋白质，使其中的抗原暴露于溶液中，便于抗体的结合。

具体的操作流程如下： 1. 取出已固定的组织样本，将其置于适当的缓冲液中。

2. 对于热原修复，将样本加热至适当的温度（通常为95-100摄氏度），保持一定的时间（通常为15-30分钟）。

3. 对于酶解原修复，将样本加入含有特定酶的缓冲液中，孵育一定的时间（通常为30分钟至1小时）。

4. 护理样本：对于热原修复，将样本冷却至室温；对于酶解原修复，用PBS（磷酸盐缓冲液）或纯净水洗涤样本。

抗体染色抗体染色是免疫组化的核心步骤，通过与特定抗原结合，可以检测出组织样本中的目标蛋白质。

该步骤涉及抗体的选择、检测系统的建立和染色方法的确定。

抗体选择抗体选择是免疫组化中的关键因素之一。

根据研究或临床需求，选择适当的一抗体和二抗体非常重要。

一抗体通常是针对目标抗原的特异性抗体，可以是单克隆抗体或多克隆抗体。

二抗体通常是对一抗体偶联的辅助抗体，可以是标记有多种标签的抗体，如辣根过氧化酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）。