用于烟梗木质素降解的漆酶的分离纯化研究
木质素降解产物用于漆酶-介质体系的结构理论研究
漆酶的分离纯化及其应用研究
漆酶的分离纯化及其应用研究漆酶是一种生物催化剂，被广泛应用于漆木器、皮革、纺织品、造纸、食品等领域。
漆酶的分离纯化及其应用已经成为当前生物技术领域研究的热点之一。
一、漆酶的分离纯化方法漆酶在微生物中的合成量较少，因此，为了进行漆酶的高效生产和利用，需要对漆酶进行分离纯化。
常见的漆酶分离纯化方法有：超滤法、离子交换层析法、凝胶过滤层析法等。
超滤法是通过超滤膜将酶与其他杂质分离，可以得到相对较为纯净的漆酶。
离子交换层析法是利用离子交换树脂将需要分离的物质分离出来。
凝胶过滤层析法则是利用化学性质不同的凝胶将需要分离的物质分离出来。
二、漆酶的应用研究漆酶的应用研究主要集中在以下几个领域：1.漆木器颜色、光泽度的成型漆木器的颜色和光泽度可以通过打磨、上光等方式达到，但这种方法比较费时费力，而且不够持久。
采用漆酶涂料，可以使漆木器的颜色和光泽度更加饱满，而且能够更持久地保持。
2.制作皮革中的保护剂对皮革进行漆酶处理，可以使皮革更加柔软、舒适，同时具有保护作用，可以延长皮革的使用寿命。
3.纺织品整理在染色后，使用漆酶整理纺织品，可以提高纺织品的匀染性和光泽度，使其更加柔软舒适。
4.造纸生产漆酶在造纸生产中也起着重要的作用。
已经有不少研究表明，使用漆酶可以比传统方法更加高效地从纸浆中分离木质素，使得纸张更加柔韧、实心、白度高。
5.食品加工漆酶被广泛应用于味精、酱油等食品加工领域。
将其添加到食品中可以改善食品口感和口感质量。
结语漆酶具有一定的生物技术优势，不仅能够提高生产效率和质量，而且还能够在生态保护方面发挥重要的作用。
不过，需要在其分离纯化和应用研究方面进一步深入探索，以更好地推动其应用。
漆酶提纯分离
漆酶的提取纯化及其脱色研究摘要【目的】本实验通过选取一株突变的高产漆酶的粗毛栓菌发酵液〔培养11天产生漆酶酶活最高〕，经过离心沉淀过滤，硫酸铵沉淀，Sephadex G-75凝胶过柱层析，别离纯化漆酶以及测定其纯化相关参数，并用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定各步别离后的成分变化。
最后研究其脱色的效果，为漆酶应用的相关研究提供实验依据。
【方法】利用过滤，硫酸铵沉淀，Sephadex G-75凝胶过柱层析，的方法提取纯化漆酶，SDS-聚丙烯酰胺凝胶鉴定别离成分，并用光密度测漆酶的脱色率。
【实验材料】发酵液，相关试剂【预计结果】选用凝胶浓度为12%，结果可以明显看出，经过纯化的漆酶的条带是单一的，相关参数〔蛋白含量，活力回收，比活力，纯化倍数〕比拟高，另外，脱色效果比拟显著。
【结论】关键词漆酶纯化脱色应用1 前言1.1 实验的研究意义木质素是植物中产生的一类难于降解的高分子化合物的统称，主要由苯丙烷单元通过醚键和碳键等多种共价键连接而成的杂聚物，是自然界中碳循环的限速环节之一。
其降解主要由微生物完成，这类微生物主要包括真菌、放线菌和细菌。
其中白腐真菌〔white rot fungi〕被认为是生物圈中植物天然高分子物质木质素、纤维素和半纤维素的重要降解者，能使这些物质最终分解为二氧化碳和水。
白腐真菌通常通过分泌木质素过氧化物酶〔Lignin peroxidase，Lip〕、锰过氧化物酶〔Manganese peroxidase，MnP〕和漆酶〔Laccase，Ec.2〕三种主要的木质素降解酶类来降解木质素。
其中漆酶，能够将木质素降解为CO2和H2O，反响过程不需要H2O2的参与，在木质素降解中起主要作用。
其中漆酶〔Laccase〕是一种多酚氧化酶〔p-diphenol oxidase EC..2〕，属于蓝色氧化酶家族。
漆酶能催化降解多种芳香族化合物特别是酚类，是一种天然环保型酵素。
因而在纸浆生物漂白、染料脱色、废水处理、食品加工、生物质能源等领域具有广阔的应用前景，利用漆酶对木质纤维及一些高分子化合物的降解作用，进展合理的开发利用，可减少化学药品的使用量，降低生产本钱和保护环境。
酶解-温和酸解法分离烟梗木质素
酶解-温和酸解法分离烟梗木质素
楚文娟;李文伟;李颢
【期刊名称】《广东化工》
【年(卷),期】2015(42)17
【摘要】采用酶解-温和酸解法从烟梗粉中分离出木质素.研究了稀硫酸预处理对烟梗粉酶解过程的影响,优化了烟梗粉酶解的反应条件,考察了HC1浓度对酶解木质素温和酸解的影响.通过FT-IR的表征手段对木质素样品进行了表征,结果表明,烟梗木质素具有典型的紫丁香基和愈创木基特征峰,说明烟梗木质素的结构单元主要由紫丁香基和愈创木基组成.
【总页数】2页(P75-76)
【作者】楚文娟;李文伟;李颢
【作者单位】河南中烟工业有限责任公司安阳卷烟厂,河南安阳455004;河南中烟工业有限责任公司安阳卷烟厂,河南安阳455004;长江大学化学与环境工程学院,湖北荆州434023
【正文语种】中文
【中图分类】TQ353.42
【相关文献】
1.NaOH/尿素低温溶解法测定烟梗木质素含量的研究 [J], 孔浩辉;李秀丽;黄翼飞;纪楷滨;楼宏铭;邱学青;杨东杰
2.棕榈壳酶解-温和酸解木质素的结构及热解特性研究 [J], 常国璋;谢建军;杨会凯;
黄艳琴;阴秀丽;吴创之
3.毛竹酶解/温和酸水解木质素的快速热解研究 [J], 娄瑞;武书彬;董浩亮;吕高金
4.酶解木质素的碱催化温和水热降解 [J], 单增宇;马灼明;李淑君
5.醇酸体系分离木质素对酶解性能的影响 [J], 安胜欣;薛凤洋;李文志
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木质素的酶法纯化与应用的开题报告
木质素的酶法纯化与应用的开题报告
一、选题背景
作为天然高分子化合物之一的木质素（lignin），其分子结构复杂，其三维构象的多样性，使其被广泛应用于纸浆、生物燃料、环境污染等领域。
得益于生物技术的发展，目前已经取得了一定的进展。
在不断深入的研究探讨中，有人对木质素酶法纯化所涉及的相关问题进行了初步的讨论。
二、研究目的
以木质素的酶法纯化为研究目标，旨在探究多种酶类在木质素纯化中的应用效果及其可能存在的问题，进一步提升木质素的提取纯化效果，为实际应用提供更为充分的技术支持。
三、研究方法
通过文献调研及实验室实践相结合的方式，探究多种酶类的选择、作用机理及其在纯化木质素的过程中实际应用效果等问题，进一步验证并优化酶法提取木质素的方案。
四、研究内容
1、常见的酶类及其选择
2、各种酶类对木质素的作用机理
3、酶法提取木质素的实验方案设计
4、实验结果分析及性能评价
五、预期成果
通过对木质素的酶法纯化及应用研究，预期达到以下目标：
1、建立适合不同来源和种类木质素的酶法纯化方案；
2、探索酶法提取木质素的潜在应用领域；
3、提高木质素的纯度及其应用性能，为其更广泛的应用打下技术基础。
六、研究意义
木质素的酶法纯化及应用是目前木质素研究领域的重点研究方向之一，该研究能够提升木质素的提取纯化效果，为实际应用提供更为充分的技术支持。
木质素的应用价值广泛，与环保、能源、生态建设等领域密切相关。
因此，该研究具有重要的学术价值、工程技术价值和社会经济价值。
Trametes_hirsuta_漆酶的分离纯化及其对活性染料脱色研究
山东农业大学学报(自然科学版),2024,55(1):076-083Journal of Shandong Agricultural University ( Natural Science Edition )VOL.55 NO.1 2024 doi:10.3969/j.issn.1000-2324.2024.01.011Trametes hirsuta漆酶的分离纯化及其对活性染料脱色研究刘飞，李治宏，张仕豪，刘璇，郑晓晴，焦若若，朱友双*济宁医学院生物科学学院，山东日照 276800摘要：漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，在生物检测、工业染料脱色、有机农药降解、纸浆漂白及食品饮料等领域具有广泛的应用价值。
本研究使用实验室自主筛选鉴定的漆酶高产菌株粗毛栓菌（Trametes hirsuta），液态发酵后，培养液经硫酸铵分级沉淀、DEAE Sepharose FF 阴离子交换层析分离纯化，酶活总得率57.2%，纯化倍数6.0倍，比活力为758.5 U/mg，漆酶的分子量约为50 kDa。
利用粗毛栓菌粗酶液分别对结晶紫、溴酚蓝、孔雀石绿、詹姆斯绿B进行脱色，同时研究了染料浓度、脱色温度、pH和NaCl对溴酚蓝和孔雀石绿脱色率的影响。
结果表明，溴酚蓝和孔雀石绿浓度分别为40 mg/L 和50 mg/L时脱色率较高；在脱色温度为50 ℃时，漆酶对溴酚蓝和孔雀石绿的脱色率较高，最高脱色率分别为68.51%和83.06%；溴酚蓝在pH 3.5时脱色率最高达到72.61%，而孔雀石绿的脱色率在pH 4.5时最高达到83.49%；NaCl对Trametes hirsuta漆酶催化染料脱色有一定的抑制作用。
本研究表明Trametes hirsuta漆酶在染料脱色中具有较大的应用前景，在工业废水的处理中具有良好的应用潜力。
关键词：粗毛栓菌；漆酶；分离纯化；染料脱色中图法分类号：Q939.5文献标识码： A文章编号：1000-2324（2024）01-0076-08 Isolation and Purification of Laccase from Trametes hirsuta and Its Application in Reactive Dye DecolorizationLIU Fei, LI Zhi-hong, ZHANG Shi-hao, LIU Xuan, ZHENG Xiao-qing,JIAO Ruo-ruo, ZHU You-shuang*School of Biological Science/Jining Medical University, Rizhao 276800, ChinaAbstract: Laccase is a copper-containing polyphenol oxidase with a wide range of application, including bio-detection, industrial dye decolorization, organic pesticide degradation, pulp bleaching, and the food and beverage industries. We utilized a high-yield laccase strain of Tramete hirsuta identified in the laboratory. The laccase was separated and purified through ammonium sulfate precipitation and DEAE Sepharose FF anion exchange chromatography. The enzyme activity yield was 57.2%, with a purification fold of 6.0 and a specific activity of 758.5 U/mg. The molecular weight of laccase was about 50 kDa. The crude enzyme solution from Tramete hirsuta was used to decolorize crystal violet, bromophenol blue, malachite green, and Janus green B. The effects of dye concentration, temperature, pH and NaCl on the decolorization rate of bromophenol blue and malachite green were also investigated. The decolorization rates were higher when the dye concentration was 40 mg/L for bromophenol blue and 50 mg/L for malachite green. The decolorization rates of laccase on bromophenol blue and malachite green were 68.51% and 83.06%, respectively, at the temperature of 50℃. Bromophenol blue exhibited the highest decolorization rate of 72.61% at pH 3.5, while malachite green showed the highest decolorization rate of 83.49% at pH 4.5. NaCl had an inhibitory effect on the dye decolorization catalyzed by Trametes hirsuta laccase. Our study showed Trametes hirsuta laccase has a great application potential in dye decolorization and industrial wastewater treatment.Keywords: Trametes hirsuta; laccase; isolation and purification; dye decolorization漆酶是一种古老的含铜多酚氧化还原酶，最早发现于日本漆树中(Rhusvernicifera)[1]，属于铜蓝氧化酶。
烟叶中木质素的测定、裂解和降解研究的开题报告
烟叶中木质素的测定、裂解和降解研究的开题报告一、研究背景和意义烟叶作为我国重要经济作物之一，其烟草制品产业是国家重点支持的行业之一。
但是，烟草制品的加工过程中会释放一些有害物质，如焦油和尼古丁等，这些有害物质对人体健康造成威胁，因此近年来人们越来越关注如何减轻烟草制品对环境和人类的危害。
木质素是植物细胞壁的重要成分之一，烟草中也富含木质素。
因此，对烟草中木质素的测定、裂解和降解研究，对于减轻烟草对环境的危害，提高烟草制品的品质和降低生产成本具有重要的意义。
二、研究目的本研究的目的是测定烟草中木质素的含量，研究木质素的裂解及降解过程，为烟草制品的生产和加工提供理论基础和技术支持。
三、研究内容和方法1.烟草中木质素的测定采用高效液相色谱法测定烟草中木质素的含量。
首先将烟草样品提取，得到木质素的混合物。
然后将混合物进行分离和纯化，用高效液相色谱进行分析。
2.木质素的裂解实验采用氢氧化钠-丙酮体系进行木质素的裂解。
将烟草中木质素混合物与氢氧化钠和丙酮混合，进行加热反应，得到裂解产物。
采用气相色谱-质谱联用技术进行分析。
3.木质素的降解实验采用微生物发酵技术进行木质素的降解实验。
将烟草中木质素混合物与一定量的微生物培养物混合，并控制培养条件，观察并记录木质素的降解过程，采用高效液相色谱进行分析。
四、研究预期结果通过对烟草中木质素的测定、裂解和降解研究，可以得出以下预期结果：1.测定出烟草中木质素的含量。
2.找到一种简单可行的木质素裂解方法，并得到裂解产物。
3.通过微生物发酵技术，找到一种高效的木质素降解方法。
五、研究的实用价值本研究可为烟草制品的生产和加工提供新的思路和技术支持，减轻烟草对环境的危害，提高烟草制品的品质和降低生产成本。
此外，本研究所采用的方法和技术也可为其他植物中木质素的相关研究提供参考。
酶解木质素的分离与研究进展
现 资 源 冉 利 用 重 要 性 ，而 人 然 高 分 子 的 可 再 生 性 及 可 降 解 性 就 成 了 目前 研 究 的热 点 ． 酶 解 水 质 索
（Ｅ ｎ ｚ ｙ ｍａ ｌ ｉ ｃ ｈ ｙ ｄ ｒ ｏ ｌ ｙ ｓ ｉ ｓ ｌ ｉ ｇ ｎ ｉ ｎ，ＥＨＬ）是 一 种 从 制 备 生 物 质 化 学 品 的残 渣 Ｅ １ Ｉ 提 取 … 的重 要 可 ， 的 高 分 子 材 料 ，其 分 子 结 构 含 有 火 量 的 酚 羟 基 、脂 肪 族 羟 基 、甲 氧 基 、苯 环 、醚 键 和 羰 基 等 活 性 官 能
资 源 。 随 着 社 会 和 经 济 的 发 展 ，环 境 污 染 和 资 源
１ ． １ 有 机溶 剂萃 取法
有 机溶 剂 萃取 法 一般 是 指 将 经 过纤 维 素 嗨水
解 后 的 生 物 质 原 料 的 残 渣 ，用 能 够 溶 解 小 质 素 的
巾 性 有 机 溶 剂 进 行 萃 取 ，且 该 溶 剂 不 与 木 质 素 发
糖 ，再 用 有 机 溶 剂 进 行 苇 取 得 到 酶 解 小 质 。 １ ９ ７ ５
生 了 大 量 的 酶 解 生 物 质 资 源 废 弃 物 ， 该 废 弃 物 巾
含 有 大 量 的 木 质 素 资 源 。 近 年 来 ，Ｅ ＨＩ 的 来 源 主
要 足 从 植 物 秸 秆 、玉 米 芯 等 制 备 生 物 质 化 学 品 的
酶解 木 质 素 的分 离 与 研 究进 展
吕 思 美 ，李 佳 珠 ，杨 冬 梅 ，李 淑 君
（ 东 北 林 业 火学 生 物 质材 料科 学 与 技 术 教 育 部 重 点 实 验 室 ，黑 龙 江 哈 尔 滨 １ ５ ０ ０ ４ ０）
一种酶法降解烟草中木质素的方法[发明专利]
![一种酶法降解烟草中木质素的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/76c196918e9951e79a89279c.png)
专利名称：一种酶法降解烟草中木质素的方法专利类型：发明专利
发明人：张建栋,施栩翎
申请号：CN201010560128.5
申请日：20101124
公开号：CN102058154A
公开日：
20110518
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种酶法降解烟草中木质素的方法，主要通过对木质素具有降解作用的酶对低次烟草进行处理，获得吸味更柔和的烟草产品，有效提高低次烟草的口感。
申请人：华宝食用香精香料(上海)有限公司
地址：201821 上海市嘉定区叶城路1299号
国籍：CN
代理机构：北京君智知识产权代理事务所
代理人：吕世静
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烟梗纤维素降解菌株HF-09的分离鉴定和降解特性
（Changde Huafu Biology Technology Co.，Ltd.，Changde 415900，Hunan，China）
Abstract：In order to reduce the content of lignocellulose in tobacco stems and solve the problem of low industrial use value，bacteria
with potential for degradation of tobacco stem lignocellulose were screened. A cellulase screening medium was used to isolate a tobacco
lignocellulose-degrading strain HF-09 from tobacco cultivation soil in Kunming city. After morphological observation and physiologi⁃
growth phase in 8~20 h，which had strong adaptability. After 10-day degradation of tobacco stems of Hongda（C3F），the cellulose
degradation rate was 20.82%，the hemicellulose degradation rate was 30.28%，and the lignin degradation rate was 19.34%. At the
产漆酶菌株的筛选及其对烟秆降解效果的研究
产漆酶菌株的筛选及其对烟秆降解效果的研究杨雪梅;刘彦中;刘志莲;赖泳红;陈勇能【期刊名称】《中国农学通报》【年(卷),期】2014(30)7【摘要】为烤烟秸秆中木质素降解提供理论依据,丰富降解木质素的真菌资源。
从腐殖质中分离高产漆酶的木质素降解真菌1株,对其进行形态学鉴定,并对其液态发酵产漆酶培养条件进行优化和对碳、氮源和Cu2+进行正交试验,最后测定了该株菌对烤烟秸秆的降解情况。
结果表明:(1)该株真菌形态学鉴定为半知菌亚门,粘头霉属(Moniliales Gliocephalias sp.)命名为Z-1。
基础培养基中产漆酶的最大值出现在液态发酵第4天,酶活为2.72 U/mL。
(2)单因素试验中Z-1最适宜产酶发酵条件为:麦芽糖25 g/L、酵母膏10 g/L、Cu2+浓度2.5 mmol/L。
(3)正交试验中,培养基麦芽糖30 g/L、酵母膏12 g/L、Cu2+浓度2.5 mmol/L处理产酶最高,酶活为3.24 U/mL,较基础培养基中高出18.89%。
(4)液态发酵菌株对烟秆粉末降解30天后,失重率50%、木质素降解率39.39%、纤维素降解率36%。
该株真菌产酶较高,对烤烟秸秆降解能力较强。
【总页数】6页(P52-57)【关键词】漆酶;木质素;发酵优化;烟秆降解【作者】杨雪梅;刘彦中;刘志莲;赖泳红;陈勇能【作者单位】云南农业大学烟草学院;云南大学微生物研究所;保山市烟草公司龙陵分公司【正文语种】中文【中图分类】Q554【相关文献】1.产漆酶菌株的筛选及产酶条件的优化 [J], 王巍杰;张杰;2.组成型漆酶高产菌株的筛选及其产酶条件研究 [J], 谌斌;赵亮亮;聂小琦;黄彦;余丽娟;李芳3.产漆酶菌株的筛选及产酶条件的优化 [J], 王巍杰;张杰4.产漆酶菌株筛选及一株产酶菌株的优化与鉴定 [J], 张延威;邱树毅;韩燕峰;梁宗琦5.血红密孔菌高产漆酶菌株的筛选及其对烟梗的生物降解 [J], 宋自力;张伟;廖头根;汪世华;李伟;尹文兵因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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用于烟梗木质素降解的漆酶的分离纯化研究张锐;李元实;寇霄腾;朱良华;余翔;马林【摘要】通过云芝菌发酵得到的漆酶粗酶液经超滤浓缩后，以硫酸铵为盐析剂进行分级盐析沉淀，利用DEAE－Sepharose－F．F．柱层析对漆酶的发酵液进行分离纯化．SDS－PAGE电泳分析证明获得了电泳纯漆酶，其分子量约为64．4 kD．分离纯化过程中酶被纯化了22．80倍，酶活的回收率为36．32％，表明云芝菌产漆酶得到了很好的分离纯化．将漆酶液用于烟梗木质素的降解，实验结果表明，经此降解处理过的烟梗其内在品质得到了一定的提高：杂气和刺激性明显降低，木质气明显减弱，香气和余味均有改善．%After the laccase crude enzyme which was obtained by fermenting Coriolus versicolor had been concentrated and hyperfiltrated,grading salting precipitation and DEAE-Sepharose-F.F.column chromatog-raphy had been taken to separate and purify the laccase fermented liquid with ammonium sulfate as the sal-ting-out agent.SDS-PAGE electrophoresis results showed that pure laccase could be obtained,the molecular weight was about 64.4 kD,enzyme was purified for 22.80 times by the purification process,the enzyme ac-tivity recovery rate was 36.32%.These proved that the laccase which was produced by Coriolus versicolor could be well ing the enzyme solution in the experiment stem lignin degradation,the results showed that the intrinsic quality of the processed tobacco stems had been improved to some extent,miscel-laneous gases and irritating significantly reduced,wood gas also significantly reduced,aroma and aftertaste slightly improved.【期刊名称】《郑州轻工业学院学报（自然科学版）》【年(卷),期】2014(000)006【总页数】5页(P5-8,12)【关键词】烟梗木质素;漆酶;分离纯化;云芝菌【作者】张锐;李元实;寇霄腾;朱良华;余翔;马林【作者单位】郑州轻工业学院烟草科学与工程学院，河南郑州 450001; 云南中烟再造烟叶有限责任公司技术中心，云南昆明 650000;吉林烟草工业有限责任公司生产技术中心，吉林延吉 133000;安徽中烟工业有限责任公司原料研究部，安徽蚌埠 233000;吉林烟草工业有限责任公司生产技术中心，吉林延吉 133000;郑州轻工业学院烟草科学与工程学院，河南郑州 450001;郑州轻工业学院烟草科学与工程学院，河南郑州 450001【正文语种】中文【中图分类】TS41+30 引言烟梗的主要成分是细胞壁物质,如纤维素、半纤维素、木质素以及多糖等.烟梗中的木质素对烟草内在品质及风味有不利影响，抽吸时会产生多种有害成分，故烟梗在卷烟产品中的应用受到了很大的限制.从烟梗中分离木质素，运用漆酶对其进行降解，可改善烟梗的品质.漆酶是一种含铜离子的多酚氧化酶，与植物抗坏血酸氧化酶和哺乳动物血浆铜蓝蛋白同属于铜蓝蛋白家族[1].它最早在日本紫胶漆树的渗出液中被发现[2]，后在真菌中被发现[3-4]，在白腐菌中普遍存在，少数低等真菌和植物中也产生漆酶[5].目前,使用较广泛的产漆酶菌株有杂色云芝菌(Coriolus versicolor)、彩绒革盖菌(Trametes versicolor)等.在纯系培养中漆酶能有效地将木质素分解为CO2和H2O，但由于漆酶发酵周期长、原料成本高、酶活力较低，因而此种分解方法还未能实现大规模的工业化生产.为了更好地利用云芝菌产漆酶，本文拟通过研究漆酶粗酶液经过分离纯化后的酶活力变化情况，将纯化的漆酶应用于烟梗木质素的降解，从而改善烟梗品质，提高烟梗在卷烟中的使用价值.1 材料和方法1.1 实验仪器和材料菌种：云芝菌由郑州轻工业学院生物实验室保存，菌丝体于4 ℃保存在PDA斜面培养基上.材料：牛肉膏、蛋白胨、琼脂等(生化试剂)，北京奥博星生物技术有限责任公司产；氯化钙、硫酸亚铁、氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、硫酸镁、硫酸铵等(AR 级)，天津大茂化学试剂厂产；葡萄糖,广东汕头市西陇化工厂产.PDA固体培养基：马铃薯提取液20%，葡萄糖20.0 g/L，蛋白胨4.0 g/L，KH2PO4 3.0 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，MnSO4·7H2O 500 mg/L，ZnSO4 500 mg/L，琼脂 20.0 g/L.PDA液体产酶优化培养基：马铃薯提取液20%，葡萄糖20.0 g/L，蛋白胨 5.0g/L，KH2PO4 3.0 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，MnSO4·7H2O 500 mg/L，ZnSO4 500 mg/L，CuSO4 1.0 mmol/L，维生素B1微量.测酶活试剂：0.5 mmol/L的2,2-连氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)溶液；醋酸-醋酸钠酸缓冲溶液(pH=4.5).实验仪器见表1.表1 实验仪器1.2 实验方法1.2.1 漆酶粗酶提取液的制备将保藏的云芝菌种转接于固体的PDA培养基上，于30 ℃下培养6 d.将生长得到的菌丝平面制成直径约为10 mm的菌片，然后在无菌条件下将3块菌片接入发酵培养基.在云芝菌液体发酵产漆酶的最适发酵条件下(摇床转速150 r/min,初始pH=5.0，发酵温度28 ℃)培养 7 d，取发酵液于离心管中，在12 000 r/min下离心10 min，得到上清液，即为粗酶液.1.2.2 漆酶酶活力和蛋白质含量的测定在一定条件下，1 min氧化1.0 μmol的底物所需要的酶量定义为1个酶活力单位(U).实验以ABTS(0.5 mmol/L)为底物，于25 ℃，在2.5 mL缓冲液(0.1 mol/L 醋酸-醋酸钠，pH=4.5)中加入 0.4 mL ABTS，然后加入0.1 mL的粗漆酶液体启动反应，在 420 nm 下测定3 min内吸光值的变化，以按照同样方法处理加热失活的酶液作空白对照.蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝R-250比色法[6].1.2.3 漆酶粗酶液的超滤浓缩在最佳的发酵条件下制得300 mL粗酶液，并在4 ℃,10 000 r/min的条件下离心15 min，取上清液用0.22 μm的滤膜过滤，然后在4 ℃下进行超滤浓缩，直至体积为 150 mL 左右.1.2.4 硫酸铵分级沉淀准确量取100 mL漆酶粗酶液，缓慢加入研磨的硫酸铵粉末，缓慢搅拌至其完全溶解，取少量上清液和沉淀，测定酶活和蛋白质含量.每隔10%为1个硫酸铵饱和样点，确定沉淀所用的最佳饱和浓度.在粗酶液中加入硫酸铵饱和溶液至饱和度为40%，缓慢搅拌至混合均匀，然后在4 ℃下静置4 h，使蛋白质充分沉淀.在4 ℃,18 000 r/min 的条件下离心20 min，取上清液.在上清液中继续加入硫酸铵粉末至二级饱和度，缓慢搅拌至均匀，4 ℃静置过夜，离心后收集沉淀溶于 20 mL 乙酸钠缓冲液(10 mmol/L,pH=4.5)中，在4 ℃ 环境下保存备用. 1.2.5 透析将透析袋(透析膜截留相对分子质量为1.5×103)剪成15 cm长的片断放入盛有2%碳酸氢钠和1 mmol 乙二胺四乙酸(EDTA)溶液的烧杯中煮沸10 min.然后用蒸馏水洗涤后再煮沸 10 min，将冷却后的透析袋浸入蒸馏水中，在4 ℃下存放于95%乙醇中备用.将适量的酶液装入透析袋，放入蒸馏水中透析24 h，每隔6 h更换1次缓冲液.1.2.6 酶液浓缩在透析袋外涂布聚乙二醇粉末，放置冰箱内片刻后取出，然后更换干燥的聚乙二醇粉末继续浓缩，直至酶样品体积浓缩到5 mL左右.1.2.7 酶液DEAE-Sepharose-F.F.离子交换层析及分子量的测定将经过透析、浓缩后的酶液上样于预装好的DEAE-Sepharose-F.F.离子交换柱(3.0 cm×20 cm)，然后用0.1～0.5 mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱，洗脱流速为2.0 mL/min.用自动分步收集器收集洗脱液，每管收集4 mL，检测每管洗脱液的蛋白质含量及酶活力，收集具有酶活力的组分洗脱液并将收集的酶液透析、浓缩后，在4 ℃ 条件下保存备用.采用SDS-PAGE电泳检测漆酶的纯度及分子量[6].分离胶浓度为10%，浓缩胶浓度为4%.电泳条件为恒压，浓缩胶80 V，分离胶120 V.电泳后用考马斯亮蓝R-250进行染色.根据标准蛋白Marker在SDS-PAGE中的相对迁移率对相对分子质量作图，求出该漆酶的相对分子质量，测定样品和标准蛋白的相对迁移率Rf值，求得其纯酶的相对分子质量.1.2.8 漆酶降解烟梗中的木质素准确称取2 g烟梗粉末置于三角瓶中，加入酶解液(酶液、缓冲溶液和水)100 mL，每组重复3个平行样，置于恒温振荡培养箱中进行酶解，使烟梗末与酶液充分混合.到达规定时间后取出，过滤处理液并洗净样品，用灭活后的酶解液作为对照，其他处理条件同上.然后用Klason法[7]测定经过酶液处理前后烟梗中木质素含量，并将降解前后的烟梗制成梗丝进行感官评吸鉴定.其中木质素的降解率计算公式为木质素的降解率/%=2 结果与讨论2.1 硫酸铵分级沉淀硫酸铵分级沉淀过程中上清液漆酶活力及蛋白质含量的变化情况如图1所示.图1 硫酸铵沉淀上清液漆酶活力及蛋白质含量变化曲线从图1可以看出，当硫酸铵饱和度<30%时，上清液中漆酶活力变化不明显，约44%的蛋白质沉淀下来；当硫酸铵饱和度在40%～60%之间时，上清液漆酶活力迅速下降；当硫酸铵饱和度继续增加时，上清液中漆酶活力变化不大，此时上清液中的漆酶活力已经很低，而在此过程中，上清液中蛋白质含量的变化呈现缓慢下降的趋势.综合硫酸铵分级沉淀过程中漆酶活力和蛋白质含量的变化情况，选取饱和度为40%的硫酸铵为其分级沉淀的一级饱和度.2.2 离子交换柱层析将硫酸铵分级沉淀后的酶液，经过透析和聚乙二醇粉末浓缩至5 mL后，利用DEAE-Sepharose-F.F.层析柱，对漆酶液进行提纯，然后用0.1～0.5 mol/L 的NaCl溶液进行梯度洗脱，结果如图2所示.由于蛋白质在280 nm处有光谱吸收，故利用紫外可见分光光度计在280nm(A280)处测量酶液的吸光值(Abs).由图2可以看出，在整个洗脱阶段出现了两个大小不等的蛋白质峰.检测洗脱液各管的漆酶活力后，结果显示第28#—40#管的蛋白质峰较高，与漆酶酶活峰相一致，表示该蛋白质即为漆酶酶蛋白.2.3 漆酶纯化过程中酶活力及总蛋白的变化情况漆酶纯化过程中酶活力及总蛋白变化结果见表2.由表2可知，在漆酶纯化过程中，经过超滤浓缩、硫酸铵分级沉淀，以及DEAE-Sepharose-F.F.柱层析的逐级分离后，漆酶粗酶液得到了纯化，且效果较好.在分离纯化过程中漆酶被纯化了22.80倍，酶活的回收率为36.32%.图2 云芝菌漆酶的DEAE-Sepharose-F.F.层析图2.4 漆酶纯度及分子量测定云芝菌漆酶SDS-PAGE电泳图见图3.经过盐析和 DEAE-Sepharose-F.F.柱层析纯化后所得的漆酶为单一区带，说明样品达到电泳纯.根据标准蛋白的相对迁移率对相对分子质量作图，求出该酶的分子量为 64.4 kD.表2 漆酶纯化过程中酶活力及总蛋白变化结果图3 云芝菌漆酶SDS-PAGE电泳图2.5 木质素的降解对烟梗内在品质的影响用酶液对烟梗中的木质素进行降解，结果见表3.将降解前后的烟丝进行感官评吸，结果见表4.表3 烟梗中木质素降解结果 %表4 木质素降解对烟梗内在品质的影响由表3可知，在漆酶的作用下，烟梗中木质素的降解率最高可达16.9%.从表4明显看出，木质素降解后烟梗的内在品质均得到了一定的提高，杂气和刺激性明显降低，木质气明显减弱，香气和余味略有改善.3 结论本文通过超滤浓缩、硫酸铵盐析、透析、DEAE-Sephaorse-F.F.柱层析、NaCl梯度洗脱等一系列的纯化步骤，对云芝菌产漆酶的分离纯化进行了研究，在分离纯化过程中漆酶被纯化了22.80倍，酶活的回收率为36.32%.SDS-PAGE电泳分析证明，获得了电泳纯漆酶，确定了漆酶的分子量约为 64.4 kD，实验结果显示，云芝菌产漆酶得到了很好的分离纯化.将纯化的漆酶应用于烟梗木质素的降解中，可提高烟梗的可用性，将处理后的烟梗应用到卷烟的生产中，可以在很大程度上提高卷烟制品的品质.本文为烟梗在卷烟制品中的应用提供了较好的理论基础.参考文献:[1] 刘淑珍，钱世钧.担子菌漆酶的分离纯化及其性质研究[J].微生物学报，2003,43(1):73.[2] Yosiiida H.Chemistry of lacquer(Urusht)[J].Chem Soc,1883,43:172.[3] Bertrand G.Sur la presence simultanee de la laccase et de la tyrosinase dans le suc de quelques champignons [J].C R Hebd Seances AcadSci,1987,123:463.[4] Laborde J.Sur lacasse des vins [J].C R Hebd Seances AcadSci,1896,123:1074.[5] Reinhannar ccase in Copper Proteins and Copper Enzymes[M].Boca Raton Ela:CRC Press,1984.[6] 汪家政,范明.蛋白质技术手册[M].北京:科学出版社,2000:243-260.[7] Ryan S, Schnitzhofer W,Tzanov T,et al.An acid-stable laccase from Sclerotium rolfsii with potential for wool dye decolourization[J].Enzyme and Microbial Technology,2003, 33:766.。