生物技术在法庭科学上的应用期末作业

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第一部分简述PCR技术的原理及发展历史

什么叫做PCR技术？它是聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增技术。是近年来发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术。

DNA扩增的传统方法一般采用分子克隆法，需将构建的含有目的基因的载体导入细胞进行扩增，并需要用探针进行筛选，牵扯到DNA酶切、连接、转化、培养及探针杂交等技术，虽然技术上已无难点，但操作复杂，需数周到数月的时间，且不利于普及。

PCR技术是由1985年由美国Cetus 公司的Kary Mullis 首创，可以将微量目的DNA 片段扩增一百万倍以上。

它的优点是敏感度高、特异性强、产率高、重复性好以及快速简便等，广泛应用于微生物学、考古学、法医学及体育等领域，并已普及到许多普通实验室，大大简化了传统的分子克隆技术，从而比较容易地对目的基因进行分析、鉴定。

PCR的原理：

用于扩增位于两段已知序列之间的DNA片段，类似于天然DNA的复制过程。

以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5′末端和3′末端互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。

扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合，基本反应步骤分三步：

1. 变性(Denaturation)：

加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链。94℃30″

2. 退火(复性) (Annealling):

突然降温后模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，也存在两条模板链之间的结合，但由于引物的高浓度，结构简单的特点，主要的结合发生在模板与引物之间。55 ℃30 ″

3. 延伸(Extension):

将反应温度调节到酶的最适温度，在DNA聚合酶、4种dNTPs 及镁离子等存在的条件下，以引物的3′ 端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的新DNA链。72 ℃1′上述 3 步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～40个循环后DNA可扩增106 ～109 倍。

PCR扩增的特异性是由一对寡核苷酸引物所决定的。反应初期，原来的DNA担负起使模板的作用，随着循环次数的递增，由引物介导延伸的片段急剧增多而成为主要模板，最终的扩增产物是介于两种引物5’ 端之间的DNA片段。

PCR技术主要用于目的基因的克隆、基因的体外突变、DNA和RNA的微量分析、DNA序列测定和基因突变分析。

PCR的发展历史

PCR的最早设想核酸研究已有100多年的历史，本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想:“经过DNA 变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。

PCR的实现1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供以致一种合适的条件---摸板DNA ，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。

PCR的改进与完善Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA 聚合酶I 的Klenow片段，其缺点是：①Klenow酶不耐高温，90℃会变性失活，每次循环都要重新加。

②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。

1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。

1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：①耐高温，在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%。②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别，将此酶命名为Taq DNA 多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使PCR广泛的被应用。

第二部分亲子鉴定的原理？社会意义及预测下未来的应用？

亲子鉴定就是利用法医学、生物学和遗传学的理论和技术，从子代和亲代的形态构造或

生理机能方面的相似特点，分析遗传特征，判断父母与子女之间是否是亲生关系，是法医物证鉴定的主要组成部分，亲子鉴定在中国古代就已有之，滴血验亲等。简单来说，就是通过血型或DNA测试等鉴定父母与子女之间的亲缘关系。

鉴定亲子关系目前用得最多的是DNA分型鉴定。人的血液、毛发、唾液、口腔细胞及骨头等都可以用于亲子鉴定，十分方便。

DNA亲子鉴定主要通过以下特征来判定

体细胞稳定性：同一个体的血液、唾液、精液以及各器官组织DNA是一致的，并且对同一健康人来说是终生不变的，这是最基本的前提。

个体高度特异性：不同个体DNA 分子水平上遗传本质的差异，决定了同一种限制酶消化基因组DNA ，某一个体与另一个体的等位核子基因片段在数量和长度上是不可能相同的，从而产生具有个体特异性的DNA 。

按孟德尔遗传规律遗传：通过大量的家系调查证明，子代DNA 中所有等位核子基因带都可以在双亲的DNA中找到，片段的传递符合孟德尔遗传规律。

DNA(脱氧核糖核酸)是人身体内细胞的原子物质。每个原子有46个染色体,另外,男性的精子细胞和女性的卵子,各有23个染色体,当精子和卵子结合的时候。这46个原子染色体就制造一个生命,因此,每人从生父处继承一半的分子物质,而另一半则从生母处获得。

一个人有23对（46条）染色体，同一对染色体同一位置上的一对基因称为等位基因，一般一个来自父亲，一个来自母亲。如果检测到某个DNA位点的等位基因，一个与母亲相同，另一个就应与父亲相同，否则就存在疑问了。

亲子鉴定原理是运用SIGMA试剂盒从毛发或口腔棉签中提取DNA，运用进口试剂盒执行复合PCR(复合PCR过程较普通PCR能够缩短为1/4至1/16)。采用DNA测序仪，运用毛细管电泳配合分型软件，在基因组中STR标记(PCR-STR)处进行比对从而完成个体识别。

利用DNA进行亲子鉴定，只要作十几至几十个DNA位点作检测，如果全部一样，就可以确定亲子关系，如果有3个以上的位点不同，则可排除亲子关系，有一两个位点不同，则应考虑基因突变的可能，加做一些位点的检测进行辨别。DNA亲子鉴定，否定亲子关系的准确率几近100%，肯定亲子关系的准确率可达到99.99%。

DNA亲子鉴定测试与传统的血液测试有很大的不同。它可以在不同的样本上进行测试,包括血液,腮腔细胞,组织细胞样本和精液样本。由于血液型号,例如A型,B型,O型或RH型,在人群中的运用比较普遍,用来分辨每一个人的血缘关系,但不如DNA亲子鉴定测试有效。