脑梗死后细胞骨架和暗神经元的变化

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中华神经科杂志 2000 年 2 月第 33 卷第 1 期 Chin J Neurol , February 2000 ,Vol 33 , No. 1
资料和方法
一 、资料 尸检病例 7 例 ,年龄 60～67 岁 。男 4 例 ,女 3 例 ,均来自哈尔滨医科大学第一医院神经内科 。所 检的大脑半球均为首次卒中 ,缺血时间为 10 、27 h 和 2 、3. 5 、7 、12 及 14 d 。3 例对侧半球有过卒中 ,但 没有肢体瘫痪 。7 例均为大脑半球梗死 ,生前 6 例 头颅 CT 扫描证实为大脑中动脉区梗死 。4 例伴糖 尿病 ,2 例伴高血压 。无持续 24 h 以上的呼吸衰竭 、 休克等 。生前无重要器官功能衰竭 。死后 24 h 内 局部剖检脑 5 例 ,48 h 内剖检脑 2 例 。剖检脑标本 立即用 10 %福尔马林固定 ,所选病例固定时间为 1 个月至 1 年 。实验前自来水冲洗 24 h 。 二 、方法 全脑冠状大切片 ,进行 HE、LFB 染色 。镜下按 组织损伤程度分区 ,不同区域依次取小块 ,对细胞骨 架蛋白的 NF200 、MAP2 、GFAP 进行免疫组化染色 , 用早期凋亡启动标记死亡受体 FAS 以及双链 DNA 片段出现后的 TUNEL 法检测凋亡细胞 。因为是剖 检脑 ,为了区分细胞骨架死后自然破坏 、固定损伤与 病变后的异常 ,注意每个病例的病灶内外及对侧的 自身对照 。 免疫组化采用 SP 法 ,特异性抗体均由宝灵曼公 司提 供 。检 测 NF200 、MAP2 、GFAP 的 方 法 基 本 相 同 。二甲 苯 浸 泡 2 次 , 酒 精 梯 度 脱 水 , 蒸 馏 水 洗 (60 ℃加热) ;0. 4 % Triton2100 室温 1 h ,TBS 洗 3 次 ; 3 %过氧化氢室温孵育 5 min ; 蒸馏水洗 , TBS 浸泡 5 min ; 0. 05 %胰酶 37 ℃ 30 min , TBS 洗 3 次 。煮沸 加热修复抗原 , 92～95 ℃ 20 min ,室温自然冷却至 37 ℃。10 %正常山羊血清室温 60 min 。倾去血清 , 加入特异性抗体 。检测 NF200 时加入 50 μl (10 μg/ ml) 的 特 异 性 鼠 抗 人 的 神 经 丝 ( 相 对 分 子 质 量 为 200 000) 单 克 隆 抗 体 , 室 温 1 h ; 检 测 MAP2 时 用 MAP2 抗体 50μl (10μg/ ml) ,37 ℃,30 min ;检测 GFAP 时用 GFAP 抗体 50 μl (25 μg/ ml) 。抗体用 TBS 稀 释 ;TBS 洗 5 min , 3 次 ; 滴 加 生 物 素 标 记 的 二 抗 , 37 ℃,30 min ;TBS 洗 3 min ,3 次 ;辣根酶标记的链酶 卵白素 37 ℃孵育 30 min ; TBS 洗 3 min ,3 次 ;DAB 显 色 ;苏木素复染 ;常规树胶封片 。 FAS 的处理过程略有不同 。脱蜡前 60 ℃ 5 ～ 10 min ,玻片浸于 pH 6. 0 的柠檬酸缓冲液中 ,修复抗 原同前 ;洗片封闭用 PBS、PBSA2001 、PBSA21 ,抗体工
7 例尸检梗死脑做全脑大切片染色后 ,将梗死及其周围分成 4 个区 (0～3 区) ,各区取小块组织 ,用组 织化学和免疫组织化学的方法观察梗死脑的暗神经元 、微管相关蛋白 (MAP2) 、相对分子质量为 200 000的神经丝 (NF200) 和星形细胞中的胶质纤维酸性蛋白 ( GFAP) ,认识暗神经元 、细胞骨架与梗死 病理过程之间的关系 ,并进行病灶内外及其与对侧脑组织细胞骨架变化的对比 。结果 1 区暗神经 元约为 90 % ;2 区为 40 %～50 % ,有些暗细胞伴有细胞骨架的严重变化 ,有的细胞骨架显色正常 ,少数 FAS 染色阳性 ,末端脱氧核苷酸转移酶介导 DUPT 的缺口末端描记法 ( TUNEL 法) 全部阴性 。0 区 MAP2 和 NF200 消失 ,1 区 MAP2 和 NF200 显著异常 ,提示为不可逆的缺血损伤 ;2 区 MAP2 和 NF200 有 轻度改变 ,提示损伤可能为可逆性 ;3 区细胞骨架正常而星形细胞增生明显 ,表明为损伤反应 。结论 暗神经元是脑缺血后的主要神经元变化形式之一 ,少数处于凋亡早期 ,多数则尚未凋亡 。缺血细胞骨 架损伤轻者 ,神经细胞功能有可能恢复 ;损伤重者 ,神经细胞功能不能恢复 。
缺血后神经元的变化形式有 :暗神经元 、嗜伊红 神经元 、细胞影及细胞消失 ,还有一部分肿胀的神经 元 。细胞核仁偏位 ,核变形 ,尼氏染色突起明显 ,胞 体变 形 。暗 神 经 元 在 1 区 占 80 %～ 90 % , 2 区 占 40 %～60 %。暗神经元分布于梗死形成的坏死组织 与正常组织的移行区 ,即本组资料的 1 区和 2 区 。 随着缺血时间的延长 ,与坏死相邻侧脑组织内嗜伊 红神经元渐多 ,暗神经元渐少 。缺血 10 h 暗神经元 主要在皮层的 II、III 层 ,之后逐渐向深层发展 。血 管增生部位暗神经元减少 。
基因项目 :九五国家重点科技项目攻关计划 (962906202221) 作者单位 :100710 中国医学科学院中国协和医科大学北京协和 医院神经内科 (高晶 、郭玉璞) ;哈尔滨医科大学附属第一医院神经内 科 (赵庆杰) 通信作者 :高晶 ,150001 哈尔滨医科大学附属第一医院神经内科
指导临床选择治疗时机是非常重要的 。暗神经元 (dark neuron) 是缺血后神经元变化的形式之一 ,存在 时间长 、分布广 ,探讨其是否可逆及影响因素对于减 少神经功能的损伤有意义 。细胞骨架的变化与神经 元的损伤是否可逆密切相关 ,其中的微管相关蛋白 2(MAP2) ,在动物实验中可用来确定脑梗死的坏死 区 。为了探讨细胞骨架在人脑脑梗死中的变化及其 暗神经元对脑梗死进展的意义 ,我们进行了此项研 究 ,现报道如下 。
0 区的 NF200 、MAP2 均消失 ,梗死 12 d 时胞体 内 MAP2 呈强阳性显色 ;1 区 MAP2 消失或胞体显色 强 ,2 d 时呈球拍样 ,NF200 断裂 、弯曲 ,缺血 2 天内 NF200 有变形 ,但仍纤细 ,呈螺丝样或轻度变形 ,排 序紊乱 (图 2) ;2 d 后明显增粗者多见 ,重度变形者 呈线头状及碎点状 (图 3) ,暗神经元部分同样变化 ; 2 区的 NF200 和 MAP2 表现异常 ,但程度轻 ,NF200 有变形 ,增粗不明显 ,排序尚可 (图 4) ,MAP2 突起弯 曲 ,呈类串珠样或增粗 (图 5 ,6) ,胶质纤维酸性蛋白 ( GFAP) 显示Fra Baidu bibliotek形细胞有增生 (图 7) ,但暗神经元部 分偶见轻度 NF200 变化 ,不伴 MAP2 改变 ;3 区及对 侧的 MAP2 、NF200 均正常 。对侧 MAP2 突起细直显 色明显 ,胞体显色略淡 ;NF200 细直排列有序 ,偶有 断裂和弯曲 ; GFAP 显示有星形细胞的簇样增生 。只 有 1 个病例在 1 区的暗神经元部分有 FAS 阳性表达 (图 8) 。TUNEL 在暗神经元部分无阳性反应 。
作液浓度为 1∶100 。用 TUNEL 方法 ,按细胞死亡检 测试剂盒说明书操作 。
结果
按神经元变化分为 4 个区 (0～3 区) 。0 区出现 嗜伊红神经元或组织结构消失 ,也可以有血管增生 和红细胞渗出 。1 区低倍镜下显示结构分层紊乱 , 细胞密度低 ,以暗神经元为主 ( 图 1) ; 神经元有缺 失 ,缺血 10 h 以上者无形态正常神经元 。2 区可见 充血或血管增生 ,细胞周围水肿 ,有暗神经元 ,40 % 以上细胞形态正常 。3 区 HE 染色显示细胞形态正 常 ,免疫组化显示星形细胞增生和肿瘤坏死因子α 阳性表达增加 。关于分区的依据另文详述 。
【关键词】 脑梗塞 ; 神经元 ; 细胞支架
A study of the dark neurons and cytoskeleton changes of seven infarcted brains GAO Jing 3 , GUO Yupu , ZHAO Qingjie. 3 Department of Neurology , PUMC Hospital , Beijing 100730 , China
【 Key words】 Cerebral infarction ; Neurons ; Cytoskeleton
脑梗死治疗的目的 ,一是使处于可逆性损伤阶 段的细胞恢复功能 ,二是减少神经元的继续损伤 ,如 炎性损伤 、兴奋性氨基酸损伤及氧化应激等 。因而 , 判定可逆性神经元损伤的存在范围及存在时间 ,对
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脑梗死后细胞骨架和暗神经元的变化
高晶 郭玉璞 赵庆杰
【摘要】 目的 通过研究细胞骨架的变化 ,探讨脑梗死后神经元及暗神经元损伤的程度 。方法
【Abstract】 Objective By observing the cytoskeleton changes of seven infarcted human brains on autopsies ,it was designed to find wheather the ischemic neurons and the dark neurons were reversible. Methods We selected 7 autopsy brains of the cerebral infarction patients. We devided each infarcted brain into four areas on the large section for each whole infarcted brain. We then examined the microtube associated protain 2 (MAP2) and 200 kd neurolfilaments(NF200) by immunohistochemistry. Results The area 0 with disappearance of MAP2 and NF200 represented a necrotic area. The area 1 with of NF200 and MAP2 dramatic abnormal changed of NF200 , disclosed an irreversible area. The area 0 together with area 1 formed the central necrosis area. The area 2 with gently changes of MAP2 and NF200 and GFAP positive astrocyte hyperplasia , represented the possible penumbra in the reversible area. The area 3 with normal cytoskeleton and astrocyte hyperplasia disclosed the reflecting area and possible chronic penumbra. The dark neurons consisted of 80 %～90 % in the area 1 ,there were 40 %～50 % in area 2 , a few of them were positive with fuschin ,alizerin and safracin staining ( FAS positive) and all of them were TUNEL negative. Conclusions The dark neurons might be considered one of the major neuronal changes following ischemia. A few of the irreversible dark neurons had FAS positive staining in the early apoptosis stage. Most of the dark neurons had no apoptosis. One part of the ischemic neuron with dramatic cytoskeleton changes was irreversible , whereas the other part of them with gentle changes of cytoskeleton was reversible.