植物生物学实验(植物生理)教案

实验一多酚氧化酶活性测定（3学时）

一、实验目的：

掌握测定多酚氧化酶活性的方法；了解多酚氧化酶的特性

二、实验原理：

多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，能使一元酚和二元酚氧化生成醌。醌有颜色，在525nm下有最大光吸收，通过分光光度法测定反应体系颜色变化可测定酶活性。

三、器材与试剂

低温离心机、s22pc分光光度计、儿茶酚、pH 7.2磷酸缓冲液

四、实验内容：

1．称取马铃薯0.5克，加入2.5mL pH 7.2磷酸缓冲液，少许PVP，研磨匀浆，转移到离心管，再用2.5mL pH 7.2磷酸缓冲液冲洗研钵，合并提取液。4℃ 4000rpm离心15分钟，上清液即为粗酶液。

2．在试管中，加入2.5mL pH 7.2磷酸缓冲液，1.5mL 儿茶酚以及1mL 粗酶液，空白调零以1mL磷酸缓冲液代替粗酶液。

3．A值测定：加入粗酶液后迅速混匀，立刻于525nm下测定反应体系的A值，每隔30秒记录一次，共记录5次。

4．计算酶活力。按下式计算

PPO活性＝U/min gFW

A值增加0.001定义为一个酶活力单位。

五、实验报告：

计算所测材料的PPO活性。选择A值变化均匀的三组数值求平均值。

实验二植物耐盐生理指标测定（9学时）

一、实验目的：

1、了解盐胁迫的机理以及植物的耐盐机制

2、了解植物盐处理的方法

3、掌握植物体内脯氨酸含量测定的原理和方法

4、掌握过氧化物酶活性的测定原理和方法

5、掌握丙二醛含量的测定方法

6、掌握基本的数据统计方法

二、实验原理

植物在盐胁迫下,植物可通过积累一定量的脯氨酸降低水势, 维持植物体内的水分平衡, 保证植物的正常生长。脯氨酸本身是一种水溶性最大的氨基酸，它可以防止原生质体的水分散失，在植物细胞生理干旱时，它的增加有助于细胞或组织保持水分。用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色，从标准曲线上查出脯氨酸的含量。

植物在盐胁迫下，活性氧含量会明显增加，对植物体产生毒害，而过氧化物酶会清除植物体内多余的活性氧。过氧化物酶广泛存在于植物的各个组织器官中。在有过氧化氢存在的条件下，过氧化物酶可以使愈创木酚氧化，产生茶褐色物质，在470nm处有最大吸收峰，可根据单位时间内A470的变化值，计算POD活性大小。

植物在盐胁迫下，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛是其产物之一，通常将其作为脂质过氧化指标，用于表示细胞膜脂过氧化程度和植物对逆境条件反应的强弱。丙二醛（MDA）是常用的膜脂过氧化指标，在酸性和高温度条件下，可以与硫代巴比妥酸（TBA）反应生成红棕色的三甲川（3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮），其最大吸收波长在532nm。但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在450nm，532nm处也有吸收。植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中MDA—TBA反应物质含量时一定要排除可溶性糖的干扰。

三、实验主要仪器和试剂

仪器: 离心机；分光光度计；恒温水浴锅

试剂：酸性茚三酮溶液；冰醋酸；标准脯氨酸溶液；3％磺基水杨酸；过氧化物酶测定反应液；pH6.0磷酸缓冲液10％TCA；0.6％TBA

四、实验步骤

（一）实验材料的培养

小麦种子吸胀8h后消毒、4℃下春化30天，采用砂培法种植，至三叶期，作为供试材料。

（二）盐胁迫处理

用200 mmol/L NaCl对小麦进行盐胁迫，以未进行盐胁迫为对照，以进行盐胁迫为处理，盐胁迫3d后分别测定脯氨酸含量、过氧化物酶活性和丙二醛含量，对照和处理分别重复3次。

（三）脯氨酸含量测定

1.标准曲线的制作

用100μg/ml脯氨酸配制成0.4、0.8、1.2、1.6、2.0μg/ml的标准溶液。取标准溶液各2ml,加2ml3% 磺基水杨酸，2ml冰醋酸和4ml2.5% 茚三酮试剂于具塞试管中，置沸水浴中显色1h，冷却后与波长520nm测定A值，以A 值为纵坐标，脯氨酸浓度（μg/ml）为横坐标绘制标准曲线。

2.脯氨酸的提取

称取小麦叶片0.2g（每个处理设3个重复），加3%磺基水杨酸5ml研磨提取，匀浆移至试管中，在沸水浴中提取10min，冷却后，4000rpm离心20min，上清液即为脯氨酸粗提液。

3.反应体系

取上清液2ml，并加入1ml冰醋酸，2ml酸性茚三酮，混匀置于沸水浴中显色0.5h。以2ml磺基水杨酸，1ml 冰醋酸，2ml酸性茚三酮为对照。在可见分光光度计下520nm处测得A值。

4. 脯氨酸的含量的计算

从标准曲线查得脯氨酸浓度，计算出样品中脯氨酸的含量，以每克材料鲜重含脯氨酸的微克数表示（μg/g）。（四）过氧化物酶活性的测定

1.过氧化物酶的提取

称取小麦叶片0.2g（每个处理设3个重复），加5ml pH 6.0的磷酸缓冲液，再加入0.02g PVP-30（除去酚类物质的毒害，防止醌类物质的干扰）及少量石英砂研磨。4℃，4000rpm离心15分钟，上清液为酶粗提取液

2.反应体系

25μl酶粗提取液加入4ml反应液，在可见分光光度计下470nm处测A值，放入后立即记时，每隔20s记一次数值，连续记录三次，取平均值。

3.酶活力定义

过氧化物酶活性以每克鲜重每分钟在470nm下A值的变化值，设每变化0.01A为一个酶活力单位。过氧化物酶活性=U/min·g

（五）丙二醛含量测定

1.丙二醛提取

小麦叶片0.2g（每个处理设3个重复），加入10﹪三氯乙酸(TCA)5mL(分两次加)和少量石英砂充分研磨，匀浆液以4000r/min离心20min，上清液即为样品提取液。

2.反应体系

取2mL提取液，分别加入2mL 0.6﹪TBA液，混匀，在试管上加盖塞，置于沸水浴中沸煮15min，迅速冷却，离心。

取上清液测定532nm和450nm下的A值。以2mL水代替提取液调零。

3.MDA含量计算：

根据C＝6.45×A532－0.56×A450，计算出样品提取液中丙二醛的浓度C，然后再计算出每克样品中丙二醛的含量(μmol/g（FW)）。

五、思考问题

1.为什么设定重复处理？

2.分光光度法要求A值在多大范围内，数据才可靠，如何调整？

六、实验报告

主要内容包括：1.实验目的及要求 2.实验主要仪器和试剂 3.实验原理 4.实验步骤 5.实验结果 6.结果分析 7.回答问题

实验三植物的元素缺乏症——砂培法（3学时）

一、实验目的：

熟悉植物营养缺乏症的典型症状，熟悉砂培法。

二、实验原理：

除了水分，植物还需要各种矿质元素来维持正常的生理活动。缺乏矿质元素植物就不能很好的生长，同时还会表现出相应的症状。应用砂培法可以观察矿质元素对植物生活的必需性，并避免土壤里的各种复杂因素。

三、器材与试剂：

塑料盆、大烧杯、量筒试剂见实验指导