第三节免疫检测技术的基本原理ppt课件
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免疫学检验概论 ppt课件
（Introduction)
免疫学检验 （ immunological test）
湖北中医药高等专科学校医学基础部 （Hubei college of Chinese medicine）
胡慧琼
(HuHuiQiong)
免疫学检验
我们为什么 会感冒 ？
抵抗力低
注射青霉素后休克
未皮试就注射青霉素后的过敏反应
土重来，后世学者估计，共有多达2亿 人死于这场瘟疫。
1820年代，英国发明了预防天花病的牛 痘疫苗。天花病患者的死亡率仍高达三 分之一。后来，发达国家逐步控制了这 种疾病，但非洲农村仍有流行。
（二）典型成就：
1、中国古代医师 创用了“人痘”疫苗预防天花。
• 湖北中医药高等专科学校
• （Hubei college of Chinese medicine）
型
来源：是人在出生以后才产生的。
特异性免疫 特点：只能对某一特定的病原体 （获得性免疫/适 或异物起防御作用，对其它的病
应性免疫） 原体无效。（专一性）
返回章目录
1.固有免疫与适应免疫
• 一、概念
• 非特异性免疫（固有免疫）-----是指机体对异物的无 选择性地阻挡，排斥和清除
• 适应免疫(特异性免疫)-----免疫系统可以准确地识别对自
(HuHuiQiong)
推动现代生命科学前进的三架马车
• 分子生物学（Molecular Biology） • 免疫学（Immunology） • 细胞生物学（Cell Biology）
3、1901年“免疫学”首先出现在Index Medicus
4、1916年Journal of Immunology创刊 标
（二）典型成就
免疫学检验 （ immunological test）
湖北中医药高等专科学校医学基础部 （Hubei college of Chinese medicine）
胡慧琼
(HuHuiQiong)
免疫学检验
我们为什么 会感冒 ？
抵抗力低
注射青霉素后休克
未皮试就注射青霉素后的过敏反应
土重来，后世学者估计，共有多达2亿 人死于这场瘟疫。
1820年代，英国发明了预防天花病的牛 痘疫苗。天花病患者的死亡率仍高达三 分之一。后来，发达国家逐步控制了这 种疾病，但非洲农村仍有流行。
（二）典型成就：
1、中国古代医师 创用了“人痘”疫苗预防天花。
• 湖北中医药高等专科学校
• （Hubei college of Chinese medicine）
型
来源：是人在出生以后才产生的。
特异性免疫 特点：只能对某一特定的病原体 （获得性免疫/适 或异物起防御作用，对其它的病
应性免疫） 原体无效。（专一性）
返回章目录
1.固有免疫与适应免疫
• 一、概念
• 非特异性免疫（固有免疫）-----是指机体对异物的无 选择性地阻挡，排斥和清除
• 适应免疫(特异性免疫)-----免疫系统可以准确地识别对自
(HuHuiQiong)
推动现代生命科学前进的三架马车
• 分子生物学（Molecular Biology） • 免疫学（Immunology） • 细胞生物学（Cell Biology）
3、1901年“免疫学”首先出现在Index Medicus
4、1916年Journal of Immunology创刊 标
（二）典型成就
第三节 免疫检测技术的基本原理
第三章
酶联免疫吸附试验
原理：利用酶与底物反应产生颜色 变化，检测抗原或抗体
应用：广泛应用于临床诊断、科研 等领域
添加标题
添加标题
添加标题
添加标题
特点：灵敏度高，特异性强，操作 简便
局限性：需要专业设备，操作复杂， 成本较高
荧光免疫技术
原理：利用荧光标记抗体与抗原结合，通过荧光信号检测抗原 优点：灵敏度高，特异性强，检测速度快 应用：广泛应用于临床诊断、科研等领域 局限性：需要特殊设备，成本较高
信号放大系统
原理：通过抗体与抗原结合，产生信号 信号放大：通过酶催化反应，放大信号 检测：通过检测信号强度，判断抗原是否存在 应用：广泛应用于医学、生物技术等领域
检测信号的转换和读取
免疫反应：抗原 与抗体结合，产 生特异性结合物
信号转换：通过 酶联免疫吸附试 验（ELIS）、化 学发光免疫分析 （CLI）等方法， 将免疫反应信号 转换为可检测的
免疫检测技术的基 本原理
XX,
汇报人：XX
ห้องสมุดไป่ตู้
目录
CONTENTS
01 添加目录标题 02 免疫检测技术的概述 03 免疫检测技术的分类 04 免疫检测技术的原理 05 免疫检测技术的优缺点
06 免疫检测技术的发展趋势和未来展望
单击添加章节标题
第一章
免疫检测技术的概述
第二章
免疫检测技术的定义
免疫检测技术是一种利用抗原-抗体反应来检测生物样品中特定物质的方法。 抗原-抗体反应是指抗原与抗体结合后产生的特异性反应。 免疫检测技术可以应用于医学、生物学、食品科学等领域。 免疫检测技术的主要类型包括酶联免疫吸附试验（ELIS）、免疫荧光技术、免疫印迹技术等。
酶联免疫吸附试验
原理：利用酶与底物反应产生颜色 变化，检测抗原或抗体
应用：广泛应用于临床诊断、科研 等领域
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特点：灵敏度高，特异性强，操作 简便
局限性：需要专业设备，操作复杂， 成本较高
荧光免疫技术
原理：利用荧光标记抗体与抗原结合，通过荧光信号检测抗原 优点：灵敏度高，特异性强，检测速度快 应用：广泛应用于临床诊断、科研等领域 局限性：需要特殊设备，成本较高
信号放大系统
原理：通过抗体与抗原结合，产生信号 信号放大：通过酶催化反应，放大信号 检测：通过检测信号强度，判断抗原是否存在 应用：广泛应用于医学、生物技术等领域
检测信号的转换和读取
免疫反应：抗原 与抗体结合，产 生特异性结合物
信号转换：通过 酶联免疫吸附试 验（ELIS）、化 学发光免疫分析 （CLI）等方法， 将免疫反应信号 转换为可检测的
免疫检测技术的基 本原理
XX,
汇报人：XX
ห้องสมุดไป่ตู้
目录
CONTENTS
01 添加目录标题 02 免疫检测技术的概述 03 免疫检测技术的分类 04 免疫检测技术的原理 05 免疫检测技术的优缺点
06 免疫检测技术的发展趋势和未来展望
单击添加章节标题
第一章
免疫检测技术的概述
第二章
免疫检测技术的定义
免疫检测技术是一种利用抗原-抗体反应来检测生物样品中特定物质的方法。 抗原-抗体反应是指抗原与抗体结合后产生的特异性反应。 免疫检测技术可以应用于医学、生物学、食品科学等领域。 免疫检测技术的主要类型包括酶联免疫吸附试验（ELIS）、免疫荧光技术、免疫印迹技术等。
第三节免疫检测技术的基本原理
第三节免疫检测技术的基本原理免疫检测技术是一种利用机体免疫系统对抗入侵病原体的能力进行疾病诊断和评估的方法。
该技术主要基于抗原与抗体之间的高度特异性结合反应，通过检测抗体或抗原的存在来确定其中一种疾病是否存在或预测其中一种疾病的发展趋势。
免疫检测技术的基本原理主要包括两大类：免疫层析和免疫荧光。
免疫层析（immunochromatography）是一种利用抗原与抗体反应在试纸上形成可见免疫复合物的技术。
它使用特定的膜或纸质载体，上面含有抗体、抗原或标记物，形成不同测试区域。
当待检样品进入试纸后，如存在目标抗原，则会与试纸上的抗体发生特异性结合。
在试纸上形成特定结合的复合物，被标记物所发出的染色信号或带测结果的线条可见，从而判断是否存在该抗原。
常见的免疫层析方法包括单克隆抗体纸胶片法和双特异性抗体纸胶片法，广泛应用于尿液、血液、唾液等体液的检测。
免疫荧光（immunofluorescence）是一种利用特定的荧光标记物对抗原或抗体进行检测的技术。
它通过将特定标记的抗体与待检样品中的抗原或抗体反应，产生与待检物质特异性结合的荧光信号。
该荧光信号可以使用荧光显微镜或相关设备进行观察和分析。
免疫荧光技术具有高度敏感性和高度特异性的优势，特别适用于寻找病原体感染或自身免疫疾病的抗核抗体、抗DNA抗体等。
除了以上两种基本原理外，免疫检测技术还有其他几种常见的方法。
酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）是一种利用酶作为标记物来检测抗原或抗体的技术。
该方法通过将酶标记的抗体与待检样品中的抗原或抗体进行特异性结合，再加入相关底物产生反应，并通过酶底物产生的染色或荧光信号的强度或颜色来判断待测物的含量或存在与否。
ELISA广泛应用于疾病的诊断、药物检测和食品安全等领域。
免疫印迹（immunoblotting）是一种将待检样品中的蛋白质分离、转移到膜上，然后使用特异性抗体与膜上的蛋白质进行反应的技术。
免疫学检测技术的基本原理及其应用
流式细胞仪工作ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ理
酶免疫测定 (Enzyme Immunoassay, EIA)
用酶（常用辣根过氧化物酶，即HRP或碱 性磷酸酶，即ALP) 标记的抗体与相应抗原 反应。通过酶作用于底物后显色来判定结 果。
常用的方法有酶联免疫吸附试验和酶免疫 组化法，前者测定可溶性抗原或抗体， 后 者测定组织中或细胞表面的抗原。
酶联免疫吸附试验 (Enzyme Linked Immunosorbent
Assay, ELISA)
是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体 （聚苯乙烯微量反应板）表面，使抗原 抗体反应在固相表面进行。用洗涤法将 液相中游离成分洗除。主要有双抗体夹 心法、间接法等。
ELISA 检测抗体
放射免疫测定法 (Radioimmunoassay, RIA)
抗原抗体的检测方法
凝集反应 沉淀反应 中和反应 用标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应
凝集反应 (Agglutination)
细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结 合、凝集的现象。
1、直接凝集：将细菌或红细胞与相应的抗 体直接反应，出现细菌凝集或红细胞凝集 现象。又分为玻片法（定性试验）和试管 法（半定量试验）。
(1)抗凝 静脉血
(2)加等 量NS
(3) 混匀后，缓 慢加于分离液上
(4)密度梯度离心
血浆
PBMC 分离液 PMN RBC
T细胞功能测定
体外法：T细胞增殖试验 形态学检查 3H-TdR掺入法 MTT法
体内法：用生物抗原或化学抗原作皮内试验。 OT-PPD皮试
淋巴细胞增殖试验（3H-TdR掺入法）示意图
间接荧光法：用一抗与标本中的抗原结 合，再用荧光素标记的二抗染色。优点 ：敏感性比直接法高，制备一种荧光素 标记的二抗可用于多种抗原的检测。
医学免疫学全套PPT课件
一、异物性
1.抗原与自身成分相异（异种物质、异体 物质）
2.未与宿主胚胎期免疫细胞接触过的自身 物质。（隔绝的自身成分和修饰的自身 成分）
二、理化状态
(一)化学性质 天然抗原多为大分子有机物。一般蛋白
质是良好的抗原。 多糖及多肽也具有一定的免疫原性。
（二）分子量大小
要求分子量一般在10.0kD以上。 （三）化学结构的复杂性
TD-Ag + TI-Ag
三、半抗原-载体效应
半抗原+蛋白质载体
人工复合抗原 免疫 动物
产生针对半 抗原的抗体
产生针对载体 蛋白的抗体
在免疫应答中，B细胞识别半抗原，T细胞 识别载体表位。并以此将T、B细胞连接起 来，共同发挥效应。
抗原
四、抗原抗体反应的特异性
1.含有不同化学基团的复合抗原只能与相 应抗体特异性结合。
3.作用特点
（thymus independent antigen，TI-Ag）
三、依据抗原是否在抗原提呈细胞内合成 1. 外源性抗原
2. 内源性抗原
三、其他分类方法 1.根据抗原组成不同分 蛋白质抗原、脂蛋白抗原等 2.根据抗原性质分 全抗原、半抗原 3.根据抗原获得方式分 天然抗原、人工抗原和合成抗原等
T细胞表位
B细胞表位
表面受体 TCR
BCR
MHC分子 必需
无需
表位性质 主要是线性短肽 天然多肽,多糖
表位大小 8-12个aa （CD8+Tc） 5-15个aa,核苷酸
12-17个aa(CD4+ Th) 或5-7个单糖
表位类型 线性表位
构象和线性表位
表位位置 抗原分子任意部位 抗原分子表面
1.抗原与自身成分相异（异种物质、异体 物质）
2.未与宿主胚胎期免疫细胞接触过的自身 物质。（隔绝的自身成分和修饰的自身 成分）
二、理化状态
(一)化学性质 天然抗原多为大分子有机物。一般蛋白
质是良好的抗原。 多糖及多肽也具有一定的免疫原性。
（二）分子量大小
要求分子量一般在10.0kD以上。 （三）化学结构的复杂性
TD-Ag + TI-Ag
三、半抗原-载体效应
半抗原+蛋白质载体
人工复合抗原 免疫 动物
产生针对半 抗原的抗体
产生针对载体 蛋白的抗体
在免疫应答中，B细胞识别半抗原，T细胞 识别载体表位。并以此将T、B细胞连接起 来，共同发挥效应。
抗原
四、抗原抗体反应的特异性
1.含有不同化学基团的复合抗原只能与相 应抗体特异性结合。
3.作用特点
（thymus independent antigen，TI-Ag）
三、依据抗原是否在抗原提呈细胞内合成 1. 外源性抗原
2. 内源性抗原
三、其他分类方法 1.根据抗原组成不同分 蛋白质抗原、脂蛋白抗原等 2.根据抗原性质分 全抗原、半抗原 3.根据抗原获得方式分 天然抗原、人工抗原和合成抗原等
T细胞表位
B细胞表位
表面受体 TCR
BCR
MHC分子 必需
无需
表位性质 主要是线性短肽 天然多肽,多糖
表位大小 8-12个aa （CD8+Tc） 5-15个aa,核苷酸
12-17个aa(CD4+ Th) 或5-7个单糖
表位类型 线性表位
构象和线性表位
表位位置 抗原分子任意部位 抗原分子表面
临床免疫检验的质量保证PPT医学课件
Pm=
Pm<5%为失控。此时，阴性标本可以发出报告，所有阳 性标本在查清原因后重做。
根据二项式分布的概率计算
如果一个实验室检测HBsAg，平常病人结果的阳性率为 10%，即p=0.1, 在某一次检测19个样本出现5个阳性结果， 14个阴性结果，则检测过程中是否存在污染的可能性可通 过下述方法计算。即计算在19个样本中出现至少5个阳性结 果的概率，此时的概率为1-（获得0个或1个或2个或3个或4 个阳性结果的概率）即：
本章小结
分析前质量保证包括检验项目的申请、患者的准 备、标本的采集、运送、接收和保存等。
分析中的质量保证包括实验室环境条件、仪器设 备维护校准、试剂方法的性能验证、标准操作程序的 建立、人员培训、标本前处理、室内质量控制、室间 质量评价和实验室间比对等，其中室内质量控制和室 间质量评价是质量保证的重要方面。
本章小结
临床上绝大部分开展的免疫学检验，都是仅能作为 筛查试验或诊断试验，阳性结果仅代表在检测中发生了 抗原抗体的阳性反应，但阳性反应可能是真阳性，也可 能是假阳性，也就是说存在一定比例的假阳性可能。由 于免疫检验方法学的这一局限性，在免疫检验的分析前 、分析中和分析后质量保证中，都涉及到与其他检验项 目不同的特点，突出表现在检验项目的申请（分析前） 和结果的报告与解释（分析后）两个方面。
是对实验室操作和实验方法的回顾性评价，而不是用 来决定实时的测定结果的可接受性。
通过参与EQA，实验室可对自己的实验操作进行纠正， 从而起到自我教育的作用。
第五节 分析后的质量保证
重点提示
结果的报告与解释 检验后标本的保存与处理 咨询服务
结果的报告
基本信息 ①患者的姓名、性别、年龄； ②送检科室或单位名称； ③标本采集时间和实验室接收标本时间；④标本的编号或 条码；⑤检测项目；⑥标本类型；⑦检测方法和主要设备 等。
Pm<5%为失控。此时，阴性标本可以发出报告，所有阳 性标本在查清原因后重做。
根据二项式分布的概率计算
如果一个实验室检测HBsAg，平常病人结果的阳性率为 10%，即p=0.1, 在某一次检测19个样本出现5个阳性结果， 14个阴性结果，则检测过程中是否存在污染的可能性可通 过下述方法计算。即计算在19个样本中出现至少5个阳性结 果的概率，此时的概率为1-（获得0个或1个或2个或3个或4 个阳性结果的概率）即：
本章小结
分析前质量保证包括检验项目的申请、患者的准 备、标本的采集、运送、接收和保存等。
分析中的质量保证包括实验室环境条件、仪器设 备维护校准、试剂方法的性能验证、标准操作程序的 建立、人员培训、标本前处理、室内质量控制、室间 质量评价和实验室间比对等，其中室内质量控制和室 间质量评价是质量保证的重要方面。
本章小结
临床上绝大部分开展的免疫学检验，都是仅能作为 筛查试验或诊断试验，阳性结果仅代表在检测中发生了 抗原抗体的阳性反应，但阳性反应可能是真阳性，也可 能是假阳性，也就是说存在一定比例的假阳性可能。由 于免疫检验方法学的这一局限性，在免疫检验的分析前 、分析中和分析后质量保证中，都涉及到与其他检验项 目不同的特点，突出表现在检验项目的申请（分析前） 和结果的报告与解释（分析后）两个方面。
是对实验室操作和实验方法的回顾性评价，而不是用 来决定实时的测定结果的可接受性。
通过参与EQA，实验室可对自己的实验操作进行纠正， 从而起到自我教育的作用。
第五节 分析后的质量保证
重点提示
结果的报告与解释 检验后标本的保存与处理 咨询服务
结果的报告
基本信息 ①患者的姓名、性别、年龄； ②送检科室或单位名称； ③标本采集时间和实验室接收标本时间；④标本的编号或 条码；⑤检测项目；⑥标本类型；⑦检测方法和主要设备 等。
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用已知特异性 抗体包被 固相载体
测定管加待测抗原和 一定量的酶标抗原使二者与
固相抗体竞争结合
对照管只加一定量酶标抗原 与固相抗体直接结合
加底物显色
分别测定两管的吸光度值， 根据对照管与测定管吸光度值之比，
计算标本中待测抗原含量
2.间接凝集法
➢ 先将可溶性抗原或抗体吸附在颗粒载体上 (如RBC, 乳胶颗粒)，再与相应抗体或抗 原反应，出现凝集为阳性结果。
➢ 临床常用的有间接血凝试验、乳胶凝集试 验等。
待检样品
抗原吸附血球 或乳胶颗粒
反应凝集物
+
→
.
3.间接凝集抑制试验
➢ 先将待检抗原与已知的抗体反应，再加入用已知 抗原吸附的载体颗粒，不出现凝集为阳性结果。
.
单向琼脂扩. 散试验
双向琼脂.扩散试验
对流免. 疫电泳
免疫比浊法原理
抗体 抗原
免疫复合物的 浓度与透射光 的衰减呈正相 关
测吸光度 计算抗原 或抗体的 含量
.
3.中和反应 如抗“O”试验
4.免疫标记技术
概念：用荧光素、酶、同位素等 标记抗体或抗原用以测定相应抗原或 抗体的技术称为免疫标记技术。常用 方法有免疫荧光技术、酶免疫技术、 放射免疫检测技术等。
.
酶及其底物
酶结合物是酶与抗体或抗原, 半抗原 在交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败 的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的 免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物 放大作用，但不同的酶选用不同的底物 ， 将得到不同的颜色反应.
.
酶
辣根过氧化物酶
碱性磷酸酯酶 葡萄糖氧化酶
底物
邻苯二胺 四甲替联苯胺 氨基水杨酸 邻联苯甲胺 2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻
特点：敏感、特异、快速，能定 性、定量、定位。
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免疫标记技术
• 酶免疫标记技术 • 荧光免疫分析技术 • 放射免疫分析技术 • 免疫金标记技术
.
酶联免疫吸附试验
• 1971年瑞典学者Engvail和Perlmann, 荷兰学者Van Weerman和Schuurs分 别报道将免疫技术发展为检测体液中微量 物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸 附测定法 (enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA)
例：乳胶凝集抑制试验检测HCG (妊娠诊断)
已知抗体
待检标本
＋
步骤1：将已知抗体 与待检标本混匀
抗原吸附 乳胶颗粒
＋
步骤2：加入抗原 吸附的乳胶颗粒混 匀
结果判断：
.
不凝集为 阳性结果
凝集反应
.
2.沉淀反应
概念：可溶性抗原与相应抗体结合后出 现沉淀物称沉淀反应。
类型：
★单向免疫扩散 ★双向免疫扩散 ★对流免疫电泳 ★免疫比浊法
荧光 黄色
360,450 420
.
• 2、标记方法 • 戊二醛交联法 • 过碘酸盐氧化法
.
戊二醛交联法 (一步法）
抗体-NH2 + COH-（CH2）3-COH + NH2-酶
抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶 抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-抗体 酶-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶
的复合物
洗涤除去其他 未结合的物质
彻底洗涤 未结合的 酶标抗体
加底物进行 酶催化反应
.
根据颜色反应的 程度进行该抗原 的定性或定量测定
（二）间接法
间接法是检 测抗体最常用的方 法，其原理为利用 酶标记的抗抗体以 检测已与固相结合 的受检抗体，故称 为间接法。
.
酶联免疫吸附试验. (ELISA-间接法)
第三节免疫检测技术的基本原理
• 抗原、抗体反应的原理，利用已知的抗原 检测未知的抗体或利用已知的抗体检测未 知的抗原 .
• 将免疫反应与现代测试技术结合 • 超微量的检测
.
.
免疫学检测技术的优点
• 高度的灵敏性 • 高度的特异性
.
免疫分析技术的应用
• 常用的诊断技术 血凝试验 酶联免疫吸附试验 胶体金免疫技术 放射免疫分析技术
.
戊二醛交联法（二步法）
COH-（CH2）3-COH + NH2-酶 抗体-NH2 + CHO-（CH2）3-CH = NH2-酶
抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶
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过碘酸盐氧化法
O O
NaIO4
酶-五炭糖环
O O
O
O
+ NH2抗体
O NaBH4 O
OH N
O
抗体
Schiff碱
O O
N 抗体
.
H2O
O O
N
OH
OH
抗体
标记免疫物的分离与鉴定
1、分离 目的：去除游离酶 方法：盐析、柱层析
2、鉴定 抗体活性 酶活性 标记物纯度
.
ELISA的种类和变化
（一）双抗体夹心法 （二）间接法 （三）竞争法 （四）双位点一步法 （五）捕获法测IgM抗体 （六）应用亲和素和生物素的ELISA
.
.
（一）双抗体夹心法
此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原
.
获得待分析物的未标定抗体
将特异性抗体与固相 载体连接形成固相抗体
加入封闭蛋白溶液以封闭载体 表面残留的蛋白结合位点
洗涤除去未结合的 抗体及杂质
洗涤并除去未结合的封闭蛋白
加受检标本（抗原）形成 固相抗体－抗原复合物
加酶标抗体生成 抗体—待测抗原—酶标记抗体
唑啉磺酸-6)铵盐 4-硝基酚磷酸盐(PNP) 萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐
ABTS+HRP+葡萄糖 葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰
显色
反应
橘红色 黄色 棕色 兰色 蓝绿色来自黄色 红色黄色 深蓝色
测定波长
492 460 449 425 642
400 500 405 420
β-Ｄ－半乳糖 苷酶
甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG) 硝基酚半乳糖苷(ONPG)
包被固相载体: 用已知抗原包被
固相载体
加待检标本: 使相应抗体与固相抗原结合
洗涤，除去无关的物质
加底物 显色
根据颜色反应的程度进行 该抗原的定性或定量测定
加酶标抗抗体: 与固相载体上抗原抗体 复合物结合；洗涤，除去 未结合的酶标抗抗体
.
（三）竞争法
此法可用于抗原和半抗原的定 量测定，也可用于测定抗体 。
.
凝集试验
➢概念：颗粒性抗原(细菌、红细胞等)与相应抗 体结合，在一定条件下出现肉眼可见的凝集物， 称为凝集反应。
1.直接凝集反应 ➢抗原与抗体直接混合作用，出现凝集为阳
性结果。 ➢①玻片直接凝集法：定性试验 ➢②试管直接凝集法：半定量试验
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玻片直接凝集试验
+
试管法半定量试验
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1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512
用已知特异性 抗体包被 固相载体
测定管加待测抗原和 一定量的酶标抗原使二者与
固相抗体竞争结合
对照管只加一定量酶标抗原 与固相抗体直接结合
加底物显色
分别测定两管的吸光度值， 根据对照管与测定管吸光度值之比，
计算标本中待测抗原含量
2.间接凝集法
➢ 先将可溶性抗原或抗体吸附在颗粒载体上 (如RBC, 乳胶颗粒)，再与相应抗体或抗 原反应，出现凝集为阳性结果。
➢ 临床常用的有间接血凝试验、乳胶凝集试 验等。
待检样品
抗原吸附血球 或乳胶颗粒
反应凝集物
+
→
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3.间接凝集抑制试验
➢ 先将待检抗原与已知的抗体反应，再加入用已知 抗原吸附的载体颗粒，不出现凝集为阳性结果。
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单向琼脂扩. 散试验
双向琼脂.扩散试验
对流免. 疫电泳
免疫比浊法原理
抗体 抗原
免疫复合物的 浓度与透射光 的衰减呈正相 关
测吸光度 计算抗原 或抗体的 含量
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3.中和反应 如抗“O”试验
4.免疫标记技术
概念：用荧光素、酶、同位素等 标记抗体或抗原用以测定相应抗原或 抗体的技术称为免疫标记技术。常用 方法有免疫荧光技术、酶免疫技术、 放射免疫检测技术等。
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酶及其底物
酶结合物是酶与抗体或抗原, 半抗原 在交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败 的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的 免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物 放大作用，但不同的酶选用不同的底物 ， 将得到不同的颜色反应.
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酶
辣根过氧化物酶
碱性磷酸酯酶 葡萄糖氧化酶
底物
邻苯二胺 四甲替联苯胺 氨基水杨酸 邻联苯甲胺 2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻
特点：敏感、特异、快速，能定 性、定量、定位。
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免疫标记技术
• 酶免疫标记技术 • 荧光免疫分析技术 • 放射免疫分析技术 • 免疫金标记技术
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酶联免疫吸附试验
• 1971年瑞典学者Engvail和Perlmann, 荷兰学者Van Weerman和Schuurs分 别报道将免疫技术发展为检测体液中微量 物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸 附测定法 (enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA)
例：乳胶凝集抑制试验检测HCG (妊娠诊断)
已知抗体
待检标本
＋
步骤1：将已知抗体 与待检标本混匀
抗原吸附 乳胶颗粒
＋
步骤2：加入抗原 吸附的乳胶颗粒混 匀
结果判断：
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不凝集为 阳性结果
凝集反应
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2.沉淀反应
概念：可溶性抗原与相应抗体结合后出 现沉淀物称沉淀反应。
类型：
★单向免疫扩散 ★双向免疫扩散 ★对流免疫电泳 ★免疫比浊法
荧光 黄色
360,450 420
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• 2、标记方法 • 戊二醛交联法 • 过碘酸盐氧化法
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戊二醛交联法 (一步法）
抗体-NH2 + COH-（CH2）3-COH + NH2-酶
抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶 抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-抗体 酶-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶
的复合物
洗涤除去其他 未结合的物质
彻底洗涤 未结合的 酶标抗体
加底物进行 酶催化反应
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根据颜色反应的 程度进行该抗原 的定性或定量测定
（二）间接法
间接法是检 测抗体最常用的方 法，其原理为利用 酶标记的抗抗体以 检测已与固相结合 的受检抗体，故称 为间接法。
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酶联免疫吸附试验. (ELISA-间接法)
第三节免疫检测技术的基本原理
• 抗原、抗体反应的原理，利用已知的抗原 检测未知的抗体或利用已知的抗体检测未 知的抗原 .
• 将免疫反应与现代测试技术结合 • 超微量的检测
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免疫学检测技术的优点
• 高度的灵敏性 • 高度的特异性
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免疫分析技术的应用
• 常用的诊断技术 血凝试验 酶联免疫吸附试验 胶体金免疫技术 放射免疫分析技术
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戊二醛交联法（二步法）
COH-（CH2）3-COH + NH2-酶 抗体-NH2 + CHO-（CH2）3-CH = NH2-酶
抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶
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过碘酸盐氧化法
O O
NaIO4
酶-五炭糖环
O O
O
O
+ NH2抗体
O NaBH4 O
OH N
O
抗体
Schiff碱
O O
N 抗体
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H2O
O O
N
OH
OH
抗体
标记免疫物的分离与鉴定
1、分离 目的：去除游离酶 方法：盐析、柱层析
2、鉴定 抗体活性 酶活性 标记物纯度
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ELISA的种类和变化
（一）双抗体夹心法 （二）间接法 （三）竞争法 （四）双位点一步法 （五）捕获法测IgM抗体 （六）应用亲和素和生物素的ELISA
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（一）双抗体夹心法
此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原
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获得待分析物的未标定抗体
将特异性抗体与固相 载体连接形成固相抗体
加入封闭蛋白溶液以封闭载体 表面残留的蛋白结合位点
洗涤除去未结合的 抗体及杂质
洗涤并除去未结合的封闭蛋白
加受检标本（抗原）形成 固相抗体－抗原复合物
加酶标抗体生成 抗体—待测抗原—酶标记抗体
唑啉磺酸-6)铵盐 4-硝基酚磷酸盐(PNP) 萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐
ABTS+HRP+葡萄糖 葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰
显色
反应
橘红色 黄色 棕色 兰色 蓝绿色来自黄色 红色黄色 深蓝色
测定波长
492 460 449 425 642
400 500 405 420
β-Ｄ－半乳糖 苷酶
甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG) 硝基酚半乳糖苷(ONPG)
包被固相载体: 用已知抗原包被
固相载体
加待检标本: 使相应抗体与固相抗原结合
洗涤，除去无关的物质
加底物 显色
根据颜色反应的程度进行 该抗原的定性或定量测定
加酶标抗抗体: 与固相载体上抗原抗体 复合物结合；洗涤，除去 未结合的酶标抗抗体
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（三）竞争法
此法可用于抗原和半抗原的定 量测定，也可用于测定抗体 。
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凝集试验
➢概念：颗粒性抗原(细菌、红细胞等)与相应抗 体结合，在一定条件下出现肉眼可见的凝集物， 称为凝集反应。
1.直接凝集反应 ➢抗原与抗体直接混合作用，出现凝集为阳
性结果。 ➢①玻片直接凝集法：定性试验 ➢②试管直接凝集法：半定量试验
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玻片直接凝集试验
+
试管法半定量试验
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1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512