第三节免疫检测技术的基本原理ppt课件
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.
单向琼脂扩. 散试验
双向琼脂.扩散试验
对流免. 疫电泳
免疫比浊法原理
抗体 抗原
免疫复合物的 浓度与透射光 的衰减呈正相 关
测吸光度 计算抗原 或抗体的 含量
.
3.中和反应 如抗“O”试验
4.免疫标记技术
概念：用荧光素、酶、同位素等 标记抗体或抗原用以测定相应抗原或 抗体的技术称为免疫标记技术。常用 方法有免疫荧光技术、酶免疫技术、 放射免疫检测技术等。
.
用已知特异性 抗体包被 固相载体
测定管加待测抗原和 一定量的酶标抗原使二者与
固相抗体竞争结合
对照管只加一定量酶标抗原 与固相抗体直接结合
加底物显色
分别测定两管的吸光度值， 根据对照管与测定管吸光度值之比，
计算标本中待测抗原含量
特点：敏感、特异、快速，能定 性、定量、定位。
.
免疫标记技术
• 酶免疫标记技术 • 荧光免疫分析技术 • 放射免疫分析技术 • 免疫金标记技术
.
酶联免疫吸附试验
• 1971年瑞典学者Engvail和Perlmann, 荷兰学者Van Weerman和Schuurs分 别报道将免疫技术发展为检测体液中微量 物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸 附测定法 (enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA)
的复合物
洗涤除去其他 未结合的物质
彻底洗涤 未结合的 酶标抗体
加底物进行 酶催化反应
.
根据颜色反应的 程度进行该抗原 的定性或定量测定
（二）间接法
间接法是检 测抗体最常用的方 法，其原理为利用 酶标记的抗抗体以 检测已与固相结合 的受检抗体，故称 为间接法。
.
酶联免疫吸附试验. (ELISA-间接法)
荧光 黄色
360,450 420
.
• 2、标记方法 • 戊二醛交联法 • 过碘酸盐氧化法
.
戊二醛交联法 (一步法）
抗体-NH2 + COH-（CH2）3-COH + NH2-酶
抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶 抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-抗体 酶-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶
.
酶及其底物
酶结合物是酶与抗体或抗原, 半抗原 在交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败 的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的 免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物 放大作用，但不同的酶选用不同的底物 ， 将得到不同的颜色反应.
.
酶
辣根过氧化物酶
碱性磷酸酯酶 葡萄糖氧化酶
底物
邻苯二胺 四甲替联苯胺 氨基水杨酸 邻联苯甲胺 2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻
唑啉磺酸-6)铵盐 4-硝基酚磷酸盐(PNP) 萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐
ABTS+HRP+葡萄糖 葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰
显色
反应
橘红色 黄色 棕色 兰色 蓝绿色
黄色 红色
黄色 深蓝色
测定波长
492 460 449 425 642
400 500 405 420
β-Ｄ－半乳糖 苷酶
甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG) 硝基酚半乳糖苷(ONPG)
包被固相载体: 用已知抗原包被
固相载体
加待检标本: 使相应抗体与固相抗原结合
洗涤，除去无关的物质
加底物 显色
根据颜色反应的程度进行 该抗原的定性或定量测定
加酶标抗抗体: 与固相载体上抗原抗体 复合物结合；洗涤，除去 未结合的酶标抗抗体
.
（三）竞争法
此法可用于抗原和半抗原的定 量测定，也可用于测定抗体 。
.
.
（一）双抗体夹心法
此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原
.
获得待分析物的未标定抗体
将特异性抗体与固相 载体连接形成固相抗体
加入封闭蛋白溶液以封闭载体 表面残留的蛋白结合位点
洗涤除去未结合的 抗体及杂质
洗涤并除去未结合的封闭蛋白
加受检标本（抗原）形成 固相抗体－抗原复合物
加酶标抗体生成 抗体—待测抗原—酶标记抗体
第三节免疫检测技术的基本原理
• 抗原、抗体反应的原理，利用已知的抗原 检测未知的抗体或利用已知的抗体检测未 知的抗原 .
• 将免疫反应与现代测试技术结合 • 超微量的检测
.
.
免疫学检测技术的优点
• 高度的灵敏性 • 高度的特异性
.
免疫分析技术的应用
• 常用的诊断技术 血凝试验 酶联免疫吸附试验 胶体金免疫技术 放射免疫分析技术
O O
N 抗体
.
H2O
O O
N
OH
OH
抗体
标记免疫物的分离与鉴定
1、分离 目的：去除游离酶 方法：盐析、柱层析
2、鉴定 抗体活性 酶活性 标记物纯度
.
ELISA的种类和变化
（一）双抗体夹心法 （二）间接法 （三）竞争法 （四）双位点一步法 （五）捕获法测IgM抗体 （六）应用亲和素和生物素的ELISA
2.间接凝集法
➢ 先将可溶性抗原或抗体吸附在颗粒载体上 (如RBC, 乳胶颗粒)，再与相应抗体或抗 原反应，出现凝集为阳性结果。
➢ 临床常用的有间接血凝试验、乳胶凝集试 验等。
待检样品
抗原吸附血球 或乳胶颗粒
反应凝集物
+
→
.
3.间接凝集抑制试验
➢ 先将待检抗原与已知的抗体反应，再加入用已知 抗原吸附的载体颗粒，不出现凝集为阳性结果。
例：乳胶凝集抑制试验检测HCG (妊娠诊断)
已知抗体
待检标本
＋
步骤1：将已知抗体 与待检标本混匀
抗原吸附 乳胶颗粒
＋
步骤2：加入抗原 吸附的乳胶颗粒混 匀
结果判断：
.
不凝集为 阳性结果
凝集反应
.
2.沉淀反应
概念：可溶性抗原与相应抗体结合后出 现沉淀物称沉淀反应。
类型：
★单向免疫扩散 ★双向免疫扩散 ★对流免疫电泳 ★免疫比浊法
.
戊二醛交联法（二步法）
COH-（CH2）3-COH + NH2-酶 抗体-NH2 Байду номын сангаас CHO-（CH2）3-CH = NH2-酶
抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶
.
过碘酸盐氧化法
O O
NaIO4
酶-五炭糖环
O O
O
O
+ NH2抗体
O NaBH4 O
OH N
O
抗体
Schiff碱
.
凝集试验
➢概念：颗粒性抗原(细菌、红细胞等)与相应抗 体结合，在一定条件下出现肉眼可见的凝集物， 称为凝集反应。
1.直接凝集反应 ➢抗原与抗体直接混合作用，出现凝集为阳
性结果。 ➢①玻片直接凝集法：定性试验 ➢②试管直接凝集法：半定量试验
.
玻片直接凝集试验
+
试管法半定量试验
.
1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512
单向琼脂扩. 散试验
双向琼脂.扩散试验
对流免. 疫电泳
免疫比浊法原理
抗体 抗原
免疫复合物的 浓度与透射光 的衰减呈正相 关
测吸光度 计算抗原 或抗体的 含量
.
3.中和反应 如抗“O”试验
4.免疫标记技术
概念：用荧光素、酶、同位素等 标记抗体或抗原用以测定相应抗原或 抗体的技术称为免疫标记技术。常用 方法有免疫荧光技术、酶免疫技术、 放射免疫检测技术等。
.
用已知特异性 抗体包被 固相载体
测定管加待测抗原和 一定量的酶标抗原使二者与
固相抗体竞争结合
对照管只加一定量酶标抗原 与固相抗体直接结合
加底物显色
分别测定两管的吸光度值， 根据对照管与测定管吸光度值之比，
计算标本中待测抗原含量
特点：敏感、特异、快速，能定 性、定量、定位。
.
免疫标记技术
• 酶免疫标记技术 • 荧光免疫分析技术 • 放射免疫分析技术 • 免疫金标记技术
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酶联免疫吸附试验
• 1971年瑞典学者Engvail和Perlmann, 荷兰学者Van Weerman和Schuurs分 别报道将免疫技术发展为检测体液中微量 物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸 附测定法 (enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA)
的复合物
洗涤除去其他 未结合的物质
彻底洗涤 未结合的 酶标抗体
加底物进行 酶催化反应
.
根据颜色反应的 程度进行该抗原 的定性或定量测定
（二）间接法
间接法是检 测抗体最常用的方 法，其原理为利用 酶标记的抗抗体以 检测已与固相结合 的受检抗体，故称 为间接法。
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酶联免疫吸附试验. (ELISA-间接法)
荧光 黄色
360,450 420
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• 2、标记方法 • 戊二醛交联法 • 过碘酸盐氧化法
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戊二醛交联法 (一步法）
抗体-NH2 + COH-（CH2）3-COH + NH2-酶
抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶 抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-抗体 酶-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶
.
酶及其底物
酶结合物是酶与抗体或抗原, 半抗原 在交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败 的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的 免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物 放大作用，但不同的酶选用不同的底物 ， 将得到不同的颜色反应.
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酶
辣根过氧化物酶
碱性磷酸酯酶 葡萄糖氧化酶
底物
邻苯二胺 四甲替联苯胺 氨基水杨酸 邻联苯甲胺 2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻
唑啉磺酸-6)铵盐 4-硝基酚磷酸盐(PNP) 萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐
ABTS+HRP+葡萄糖 葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰
显色
反应
橘红色 黄色 棕色 兰色 蓝绿色
黄色 红色
黄色 深蓝色
测定波长
492 460 449 425 642
400 500 405 420
β-Ｄ－半乳糖 苷酶
甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG) 硝基酚半乳糖苷(ONPG)
包被固相载体: 用已知抗原包被
固相载体
加待检标本: 使相应抗体与固相抗原结合
洗涤，除去无关的物质
加底物 显色
根据颜色反应的程度进行 该抗原的定性或定量测定
加酶标抗抗体: 与固相载体上抗原抗体 复合物结合；洗涤，除去 未结合的酶标抗抗体
.
（三）竞争法
此法可用于抗原和半抗原的定 量测定，也可用于测定抗体 。
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（一）双抗体夹心法
此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原
.
获得待分析物的未标定抗体
将特异性抗体与固相 载体连接形成固相抗体
加入封闭蛋白溶液以封闭载体 表面残留的蛋白结合位点
洗涤除去未结合的 抗体及杂质
洗涤并除去未结合的封闭蛋白
加受检标本（抗原）形成 固相抗体－抗原复合物
加酶标抗体生成 抗体—待测抗原—酶标记抗体
第三节免疫检测技术的基本原理
• 抗原、抗体反应的原理，利用已知的抗原 检测未知的抗体或利用已知的抗体检测未 知的抗原 .
• 将免疫反应与现代测试技术结合 • 超微量的检测
.
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免疫学检测技术的优点
• 高度的灵敏性 • 高度的特异性
.
免疫分析技术的应用
• 常用的诊断技术 血凝试验 酶联免疫吸附试验 胶体金免疫技术 放射免疫分析技术
O O
N 抗体
.
H2O
O O
N
OH
OH
抗体
标记免疫物的分离与鉴定
1、分离 目的：去除游离酶 方法：盐析、柱层析
2、鉴定 抗体活性 酶活性 标记物纯度
.
ELISA的种类和变化
（一）双抗体夹心法 （二）间接法 （三）竞争法 （四）双位点一步法 （五）捕获法测IgM抗体 （六）应用亲和素和生物素的ELISA
2.间接凝集法
➢ 先将可溶性抗原或抗体吸附在颗粒载体上 (如RBC, 乳胶颗粒)，再与相应抗体或抗 原反应，出现凝集为阳性结果。
➢ 临床常用的有间接血凝试验、乳胶凝集试 验等。
待检样品
抗原吸附血球 或乳胶颗粒
反应凝集物
+
→
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3.间接凝集抑制试验
➢ 先将待检抗原与已知的抗体反应，再加入用已知 抗原吸附的载体颗粒，不出现凝集为阳性结果。
例：乳胶凝集抑制试验检测HCG (妊娠诊断)
已知抗体
待检标本
＋
步骤1：将已知抗体 与待检标本混匀
抗原吸附 乳胶颗粒
＋
步骤2：加入抗原 吸附的乳胶颗粒混 匀
结果判断：
.
不凝集为 阳性结果
凝集反应
.
2.沉淀反应
概念：可溶性抗原与相应抗体结合后出 现沉淀物称沉淀反应。
类型：
★单向免疫扩散 ★双向免疫扩散 ★对流免疫电泳 ★免疫比浊法
.
戊二醛交联法（二步法）
COH-（CH2）3-COH + NH2-酶 抗体-NH2 Байду номын сангаас CHO-（CH2）3-CH = NH2-酶
抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶
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过碘酸盐氧化法
O O
NaIO4
酶-五炭糖环
O O
O
O
+ NH2抗体
O NaBH4 O
OH N
O
抗体
Schiff碱
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凝集试验
➢概念：颗粒性抗原(细菌、红细胞等)与相应抗 体结合，在一定条件下出现肉眼可见的凝集物， 称为凝集反应。
1.直接凝集反应 ➢抗原与抗体直接混合作用，出现凝集为阳
性结果。 ➢①玻片直接凝集法：定性试验 ➢②试管直接凝集法：半定量试验
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玻片直接凝集试验
+
试管法半定量试验
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