免疫学检测技术(课堂PPT)
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医学免疫学免疫学检测技术ppt课件
14
双抗体夹心法、间接法ELISA
15
间接法ELISA
16
ELISA操作图
可调移液器
8孔道可调移液器 17
3. 放射免疫测定（RIA）
常用 125I，测定微量物质 4. 化学发光免疫分析
常用 鲁米诺，测定超微量物质 5. 免疫印迹法（Western Blotting）
先做凝胶电泳将蛋白质分区 再将蛋白质转移至固相载体 后用酶免疫、放射免疫等技术加以测定
1. 免疫荧光法（IFA ）
荧光素可双色；使免疫复合物呈荧光；可定性、定位
（1）直接荧光法 荧光素一抗 对每种抗体作标记 特异 测Ag
（2）间接荧光法： 荧光素二抗 不必标记每种抗体 敏感 测Ag/Ab
12
免疫荧光法
13
2. 酶免疫测定（EIA）: ELISA与酶免疫组化
（1）双抗体夹心法ELISA：查抗原
10
II ) Precipitation （二）沉淀反应
可溶性抗原 + 相应抗体肉眼可见的沉淀物 使用半固体琼脂凝胶为介质——琼脂扩散/免疫扩散
1. 单向免疫扩散：抗原 的定量（Ig、C3 ）
2. 双向免疫扩散：抗原/抗体的定性、组成及Ag相关性分析 3. 免疫电泳： 电泳 + 双向免疫扩散 （抗原分析）
21
3. 细胞因子检测
（1）免疫学检测法—— 夹心法ELISA FCM
（2）生物学检测法—— 细胞增殖（或细胞增殖抑制）试验 细胞毒（或细胞毒抑制）试验
（3） 分子生物学检测法 RT-PCR测定mRNA
4. 皮肤试验： 测试IV型超敏反应能力
22
（二）B细胞功能测定
1. B细胞增殖试验 小鼠：LPS 人： SPA；抗IgM
双抗体夹心法、间接法ELISA
15
间接法ELISA
16
ELISA操作图
可调移液器
8孔道可调移液器 17
3. 放射免疫测定（RIA）
常用 125I，测定微量物质 4. 化学发光免疫分析
常用 鲁米诺，测定超微量物质 5. 免疫印迹法（Western Blotting）
先做凝胶电泳将蛋白质分区 再将蛋白质转移至固相载体 后用酶免疫、放射免疫等技术加以测定
1. 免疫荧光法（IFA ）
荧光素可双色；使免疫复合物呈荧光；可定性、定位
（1）直接荧光法 荧光素一抗 对每种抗体作标记 特异 测Ag
（2）间接荧光法： 荧光素二抗 不必标记每种抗体 敏感 测Ag/Ab
12
免疫荧光法
13
2. 酶免疫测定（EIA）: ELISA与酶免疫组化
（1）双抗体夹心法ELISA：查抗原
10
II ) Precipitation （二）沉淀反应
可溶性抗原 + 相应抗体肉眼可见的沉淀物 使用半固体琼脂凝胶为介质——琼脂扩散/免疫扩散
1. 单向免疫扩散：抗原 的定量（Ig、C3 ）
2. 双向免疫扩散：抗原/抗体的定性、组成及Ag相关性分析 3. 免疫电泳： 电泳 + 双向免疫扩散 （抗原分析）
21
3. 细胞因子检测
（1）免疫学检测法—— 夹心法ELISA FCM
（2）生物学检测法—— 细胞增殖（或细胞增殖抑制）试验 细胞毒（或细胞毒抑制）试验
（3） 分子生物学检测法 RT-PCR测定mRNA
4. 皮肤试验： 测试IV型超敏反应能力
22
（二）B细胞功能测定
1. B细胞增殖试验 小鼠：LPS 人： SPA；抗IgM
《免疫学检测技术》课件
免疫荧光技术（IFT）
原理：利用荧 光标记的抗体 与抗原结合， 通过荧光显微 镜观察荧光信
号
应用：检测细 胞表面抗原、 细胞内抗原、
细胞因子等
优点：灵敏度 高、特异性强、
可定量分析
缺点：操作复 杂、成本较高、 需要专业设备
免疫沉淀技术（IP）
原理：利用抗原-抗体特异性结 合，沉淀出目标蛋白
应用：蛋白质相互作用研究、 蛋白质组学研究等
细胞因子 检测：用 于诊断免 疫系统疾 病、肿瘤 等
免疫组化 检测：用 于诊断肿 瘤、感染 性疾病等
流式细胞 术：用于 检测免疫 细胞亚群、 细胞因子 等
免疫荧光 检测：用 于检测抗 原、抗体 等
免疫印迹 法：用于 检测蛋白 质、抗体 等
在生物制品检测中的应用
疫苗检测：检 测疫苗的有效
性和安全性
抗体检测：检 测抗体的浓度
检测方法：开发新 型检测方法，提高 检测灵敏度和准确 性
自动化：实现检测 过程的自动化，提 高检测效率
便携化：开发便携 式检测设备，方便 现场检测和快速诊 断
THANKS
汇报人：
例
Part One
单击添加章节标题
Part Two
免疫学检测技术概 述
免疫学检测技术的定义和分类
免疫学检测技术的发展历程
19世纪末，免疫 学检测技术开始 萌芽
20世纪初，免疫 学检测技术逐渐 成熟
20世纪中叶，免 疫学检测技术快 速发展
21世纪初，免疫 学检测技术进入 分子水平
免疫学检测技术的应用领域
优点：灵敏度高、特异性强、 操作简便
注意事项：选择合适的抗体、 控制反应条件、避免非特异性 结合等
流式细胞术（FC）
免疫学检测技术的基本原理及其应用PPT
免疫反应链
了解单克隆和多克 隆抗体在免疫反应 中的作用。
信号放大
揭示检测技术如何 利用信号放大机制 来增强检测敏感性。
检测方法
介绍常见的免疫学 检测方法，如 ELISA、免疫印迹 和流式细胞术。
免疫学检测技术的主要应用领域
探索免疫学检测技术在医学领域中的主要应用领域，包括诊断疾病、疫苗开发和药物监测。
1 定义
免疫学检测技术是一组用于检测和测量免疫反应的实验细胞生物学的深入研究。
免疫学检测技术的基本原理
深入了解免疫学检测技术的基本原理和机制，包括抗原-抗体相互作用、免疫反应链、信号放大和检测 方法。
抗原-抗体相 互作用
抗原与特定抗体之 间的相互作用是这 些技术的基础。
诊断疾病
了解免疫学检测技术在早期疾病诊断和监测中的重要作用。
疫苗开发
探索免疫学检测技术在疫苗研发和效力评估中的应用。
药物监测
了解如何利用这些技术来监测药物治疗的有效性和副作用。
免疫学检测技术的具体方法和步骤
深入了解免疫学检测技术的具体方法和步骤，包括样本收集、试剂准备、标记和检测分析。
1
样本收集
收集样本是免疫学检测的第一步，通常涉及血液、尿液或组织样本。
免疫学检测技术在医学领域的应用案例
探索免疫学检测技术在医学领域中的实际应用案例，包括癌症诊断、自身免疫疾病和传染病。
癌症诊断
了解如何利用免疫学检测技术 来识别和分类不同类型的癌症 细胞。
自身免疫疾病
探索免疫学检测在自身免疫疾 病诊断和治疗中的关键作用。
传染病
了解免疫学检测技术在传染病 预防、控制和治疗中的应用。
免疫学检测技术的基本原 理及其应用
本演示文稿将介绍免疫学检测技术的基本原理及其在医学领域中的应用。了 解这些关键概念和案例将有助于您更好地理解和应用免疫学检测技术。
免疫检测技术ppt课件
(RIA)
示
测定Ag*-Ab和游离Ag*放射性
意
图
从标准曲线上读知含量
33
RIA法原理Leabharlann 标准曲线/结 合75
未
结 合 50
的
放 射
30
活
性 10
（
0
）
Ag*-Ab Ag*
1
10
100
未标记抗原浓度（ng/mL)
1000
34
%
2. 免疫荧光技术
将荧光素（异硫氰酸荧光素或罗丹明等）标记抗体， 制成荧光抗体诊断试剂。 用荧光显微镜观察荧光的产生或荧光强度，以此判断 抗原的存在、定位和分布情况。 免疫荧光技术有直接法和间接法等。
52
ABS-ELISA法
①：固相支持物； ②：样品； ③：特异性IgG； ④：生物素化抗小鼠IgG （Biotin）； ⑤：辣根过氧化物酶HRP-酶标链亲和素（Avidin）； ⑥：DAB显色液； ⑦：显色；
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35
免疫荧光技术——直接法
荧光素标记的 特异性抗体
Ag 组织切片
36
免疫荧光技术——间接法
待测抗体
荧光素标记 的抗抗体
Ag 组织切片
37
免疫荧光染色显示细胞骨架
人皮肤角化细胞免疫荧光染色
免疫荧光染色是利用抗原－抗体特异性结 合的原理，用经荧光染料标记的抗体对细胞 或组织内的蛋白质进行定性或定量研究的方 法。该技术与荧光显微镜观察相结合，可对 特定的蛋白质进行细胞或组织内的精确定位。
①特异性：抗原抗体反应具有高度的特异性。 ②可逆性：抗原抗体反应所形成的复合物较稳定，
但在一定条件下可解离。（低酸、高盐） ③比例性：抗原抗体的比例合适，才可出现可见的
第三章免疫学检测技术精品PPT课件
第二节 免疫组织化学检测技术
抗原＋抗体（特异性）＋酶标记抗体，通过酶与 底物作用生成有色反应物，定位组织或细胞内抗 原的一门技术。 免疫组织化学：用带标记物的抗体或抗原在组织细 胞原位通过抗原抗体反应或组织化学反应，对相 应抗或抗体进行定性、定量、定位测定的技术。
免疫组化分类
免疫组织化学技术按照标记物的种类可分为： 免疫荧光法 免疫酶法 免疫铁蛋白法 免疫金法 放射免疫自显影法 按标记抗体的方式分： 标记抗体IHCT法 非标记抗体IHCT法
抗原（多价）抗体（2价或以上）不等价性，使 抗原抗体反应时存在比例关系，生成物的量与 反应物的量（浓度）有关。
比例性：抗原抗体结合生成复合物的量与反应 物浓度的关系。
只有2者分子比例合适，结合价相互饱和，才生 成可见的复合物。
在等价带区的溶液中几乎不存在游历的抗原和 抗体。
滴度（效价）指抗原或抗体与一定量的对应物 产生明显可见的反应所需的最小量。
• 可作为抗原的物质有 酶、 受体、 抗体、 细 胞外基质 激素、 细胞结构蛋白、病原体。
二、免疫标记物显色原理
① 免疫酶测定法 ② 免疫荧光技术 ③ 放射免疫测定法 ④ 免疫胶体金技术
①免疫酶测定法
a) 夹心法ELISA
b) 间接ELISA
a）
c) BAS—ELISA 利用生物
素和抗生物素蛋白为桥梁
单向免疫扩散 Ab in gel
用于确定 抗原浓度
Ag
Ag
Ag
Ag
免疫比浊
过量Ab Ab
Ab
Ab
双向免疫扩散
Ag1 Ag2
Ag3
Ag4
Ab
鉴定多种抗原是完全相同、 部分相同或完全不同
沉淀反应—免疫电泳
免疫学检测技术PPT课件
单核细胞（monocyte）。 Ficoll分离液法主要用于分离外周血中的单个核细
胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。
41
细胞分离基本原理
不同细胞密度不同 不同细胞表面生物学特性不同 不同细胞表面分化抗原不同
42
不同细胞密度不同
人的红细胞密度为1.093 粒细胞密度为1.092 单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为 1.075-1.090
将发光分析系统和免疫测定相结合而建立的一种新的超微量 免疫分析技术。
优点：该方法既具有免疫反应的高度特异性又有发光分析的 高灵敏度。
30
化学发光免疫测定 吖啶酯、鲁米诺 生物发光免疫测定 萤火虫、发光水母
化学发光酶免疫测定 辣根过氧化物酶（HRP） 碱性磷酸酶（AP） 电化学发光免疫测定
37
第三节 免疫细胞功能的检测
38
39
免疫细胞的分离
外周血单个核细胞分离 淋巴细胞的分离 T细胞和B细胞的分离 T细胞亚群的分离
40
(一)外周血单个核细胞分离
外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）包括淋巴细胞和
66
应用与方法学评价：
该方法既可检测抗体分泌细胞，又可检 测抗体分泌量。 优点：
稳定、特异、抗原用量少； 可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量； 可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。
67
ELISPOT技术简介
酶联免疫斑点试验( Enzyme linked immunospot assay) 80 年代，国外的科研工作者根据 ELISA 技术的基本原理，
非遗传控制的的意外的细胞 坏死（accidental cell death）
胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。
41
细胞分离基本原理
不同细胞密度不同 不同细胞表面生物学特性不同 不同细胞表面分化抗原不同
42
不同细胞密度不同
人的红细胞密度为1.093 粒细胞密度为1.092 单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为 1.075-1.090
将发光分析系统和免疫测定相结合而建立的一种新的超微量 免疫分析技术。
优点：该方法既具有免疫反应的高度特异性又有发光分析的 高灵敏度。
30
化学发光免疫测定 吖啶酯、鲁米诺 生物发光免疫测定 萤火虫、发光水母
化学发光酶免疫测定 辣根过氧化物酶（HRP） 碱性磷酸酶（AP） 电化学发光免疫测定
37
第三节 免疫细胞功能的检测
38
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免疫细胞的分离
外周血单个核细胞分离 淋巴细胞的分离 T细胞和B细胞的分离 T细胞亚群的分离
40
(一)外周血单个核细胞分离
外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）包括淋巴细胞和
66
应用与方法学评价：
该方法既可检测抗体分泌细胞，又可检 测抗体分泌量。 优点：
稳定、特异、抗原用量少； 可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量； 可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。
67
ELISPOT技术简介
酶联免疫斑点试验( Enzyme linked immunospot assay) 80 年代，国外的科研工作者根据 ELISA 技术的基本原理，
非遗传控制的的意外的细胞 坏死（accidental cell death）
相关主题
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.
36
一、凝聚反应(Agglutination)
二、沉淀反应
1、溶液中的沉淀反应
2、凝胶扩散沉淀
3、免疫电泳Biblioteka 血清免疫电泳火箭电泳
对流免疫电泳
三、补体参与的反应
四、免疫标记的抗原抗体技术
酶联免疫吸附（ELISA）
.
37
一、凝集反应
凝集反应是指颗粒抗原与相应抗体结合 反应出现的可见性现象。颗粒抗原如完整 的细菌、红细胞等与相应抗体相混合，在 一定条件下出现凝集。凝集反应中抗原称 为凝集原，抗体称为凝集素。
. Equivalence – Lattice formatio6 n
抗原或抗体检测原理
.
7
• 免疫学（Immunology）：
是研究抗原性物质、免疫系统、免疫应 答的规律及免疫应答的调节的一门科学。
• 免疫的定义（Immunity）：免疫是机体识 别自我与非自我的过程。排除异己，维护 自身稳定的生理反应。
体细胞会因物理、化学和病毒等生物因素的影响，使
细胞发生癌变，形成肿瘤等，机体可识别、清除这些
细胞，这是免疫系统的第三个功能。当这一功能低下
或失调时，会导致肿瘤或癌. 症。
9
抗原 （Antigen）
抗原概念 凡能刺激机体产生特异性抗体和致敏淋巴细胞，
并能与相应抗体或致敏淋巴细胞在体内或体外发生 反应的物质。
亲缘关系越远，差异越大，抗原性越强。
自身抗原：自身组织发生异常变异、免疫功能紊乱、眼球晶体 蛋白、精子蛋白、甲状腺蛋白
2. 大分子胶体：一般在10 kD以上 。
3. 具有复杂的立体结构或空间构象.
如明胶分子量虽然为100 kD，但结构简单，免疫原性差。
.
11
抗原如何被识别
抗原的特异性
抗原决定簇：抗原分子表面具有免疫活 性的化学基因,是抗原与抗体结合的部位。
抗原性（Antigenicity）：包括免疫原性和反应原性
二个方面
• 免疫原性：抗原能刺激机体产生抗体和致敏淋巴细 胞的性能。
• 反应原性：抗原与特异性抗体或致敏淋巴细胞在体 内或体外发生反 应的性能。
.
10
抗原 （Antigen）
构成抗原的条件
1. 异物性：机体免疫细胞能识别自身和异己物质，只
有外源性的物质才具有免疫原性，产生免疫反应。
体,Ab2 ），所以既是抗体又是抗原。
Ag
Ab1
Ab2
.
19
.
20
抗体（Antibody，Ab)
• 免疫球蛋白的双重性 • 免疫球蛋白的功能
1. 与抗原结合 2. 激活补体 3. 组织结合 4. 调理作用 5. 抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC）
.
21
免疫球蛋白的功能
.
22
抗体（Antibody) 的产生与功能
抗原分子中抗原的特异性由抗原决定簇
决定。
.
12
.
13
一种细菌可以刺激多少种抗体产生？
抗原
.
14
一种细菌可以刺激多少种抗体产生？
根据抗原的化学性质分：
• 天然抗原：微生物及其产物抗原如
• 菌体抗原（O 抗原）
• 鞭毛抗原（H 抗原）
• 表面抗原（如大肠杆菌的K 抗原）
• 细菌的毒素抗原
• 病毒抗原（V 抗原）
根据抗原抗体形成的免疫复合物的浓度进 行定量检测。 P 312
.
33
第一节 免疫学检测技术原理
可作为抗原进行检查的物质：
微生物及其大分子产物 人和动物细胞 人和动物体内的各种大分子 各种半抗原
.
34
抗原或抗体检测原理
.
35
较早的抗原抗体反应检测方法
1、凝集反应 （Agglutination) 2、沉淀反应 (Precipitation) 3、补体结合试验 (Complement fixation test ) 4、中和试验 (Neutralization test)
• 抗原或抗体检测原理：
抗原抗体的结合具有高度专一性
借助抗原和抗体在体外特异结合后出现的各种
现象，对标本中的抗原或抗体进行定性或定量的
检测。
.
31
对抗原或抗体进行定性或定量的检测的原理
Ab excess
Ag excess
Equiv.alence – Lattice formation 32
对抗原或抗体进行定性或定量检测的原理
• 人工抗原：人工合成多肽、蛋白等
.
15
抗体（Antibody)
一、概念 是抗原刺激B淋巴细胞, 使之增殖分化成
浆细胞而产生的能与抗原发生特异性反应 的免疫球蛋白(Immunoglobulin, Ig)
.
16
抗体（Antibody)
一、概念
二、免疫球蛋白的基本结构 免疫球蛋白：在人和动物血液、组织液及其
.
8
免疫的功能： 1. 抵抗感染（Defense）：机体能抵抗病原微生物 侵袭的能力。又称免疫防御。
抗菌、抗病毒、抗真菌、抗寄生虫免疫
2. 自身稳定（Homeostasis）：机体在新陈代谢过 程中，产生大量的衰老死亡细胞，免疫的第二个功能 就是清除这些细胞，维持机体的生理平衡。
3. 免 疫监视（Immunological surveillance）：机
.
27
多克隆抗体与单克隆抗体
.
28
多克隆抗体与单克隆抗体的制备
.
29
单克隆抗体的制备
骨髓瘤细胞
脾脏淋巴细胞
（ HGPRT-TK- )
（HGPRT+TK+）
在HAT中不能生长
体外培养过程中死亡
↓←PEG
杂交瘤细胞
(HGPRT+、TK+)
↓
在HAT中大量长期繁殖
↓
克隆化
↓
产生. 单抗
30
第一节 免疫学检测技术原理
.
23
抗体产生的主要过程
抗体
.
24
.
25
抗体的制备
注射
抗原（如类毒素）
抗体？ 抗原？
血清
.
26
抗体的制备 • 抗血清：指抗原人工免疫实验动物，获得含
特异性抗体的血清。 • 多克隆抗体 (PAb)： 多个抗原决定簇免疫机体
所产生的多种抗体的混合物。 • 单克隆抗体（monoclonal antibody，MAb） ： 只针对某一特定的抗原决定簇，纯度高的抗体。
他分泌液中的一类结构相似的球蛋白。 1. 由4 条肽链组成： 2 条重链， 2 条轻链 2. 一个抗体单分子： 2 个抗原结合位点
.
17
抗体（Antibody)
.
18
抗体（Antibody，Ab)
• 免疫球蛋白的双重性 免疫球蛋白是一种蛋白质，是抗体
( Ab1 )；同时又可引起机体产生抗体（抗抗
第十四章 免疫学检测技术
.
1
.
2
抗原和抗体可以发生高度专一性的结合
.
3
抗原和抗体可以发生高度专一性的结合
.
4
抗原和抗体可以发生高度专一性的结合
.
5
抗原和抗体可以发生高度专一性的结合
• 抗原或抗体检测原理： 借助抗原和抗体在体外特异结合后出现的
各种现象，对标本中的抗原或抗体进行定 性或定量的检测。