基因克隆步骤完整版
克隆基因的方法
克隆基因的方法随着生物技术的不断发展，克隆基因的方法已经成为分子生物学和基因工程领域中不可或缺的工具。
克隆基因的方法可以用来研究基因的结构、功能和调控机制，也可以用来制备重组蛋白、疫苗和基因治疗药物等。
本文将介绍克隆基因的方法，并探讨其在生物学和医学领域中的应用。
一、克隆基因的方法克隆基因的方法包括以下步骤：1. DNA提取：从目标生物体中提取DNA，可以使用化学方法或商业化的DNA提取试剂盒。
2. PCR扩增：使用聚合酶链式反应（PCR）扩增目标基因序列。
PCR是一种体外DNA合成技术，可以在短时间内扩增目标序列，具有高灵敏度和高特异性。
3. 限制性内切酶切割：使用限制性内切酶切割PCR产物，得到两端具有粘性末端的DNA片段。
限制性内切酶是一种特异性的DNA酶，可以切割DNA的特定序列，从而产生具有特定末端的DNA片段。
4. 连接：将两端具有粘性末端的DNA片段连接起来，形成重组DNA分子。
连接可以使用DNA连接酶或T4DNA连接酶等酶催化的反应。
5. 转化：将重组DNA分子导入到宿主细胞中，使其在宿主细胞中复制和表达。
转化可以使用化学方法或电穿孔法等。
6. 筛选：筛选带有目标基因的克隆。
筛选可以使用选择性培养基、荧光标记、PCR等方法。
二、克隆基因的应用1. 基因研究克隆基因的方法可以用来研究基因的结构、功能和调控机制。
例如，可以克隆和表达目标基因蛋白，研究其生物学功能和相互作用关系。
还可以使用基因敲除和转基因技术，研究基因在生物体发育、代谢和疾病等方面的作用。
2. 蛋白制备克隆基因的方法可以用来制备重组蛋白。
例如，可以克隆并表达具有生物活性的蛋白，如生长因子、激素、抗体等。
重组蛋白可以用于药物研发、生物制剂生产和科学研究等方面。
3. 疫苗研究克隆基因的方法可以用来研制和生产疫苗。
例如，可以克隆和表达病原体的抗原蛋白，制备亚单位疫苗或基因工程疫苗。
基因工程疫苗具有高效、安全、经济等优点，已经成为疫苗研究和生产的重要手段。
同源序列法克隆目的基因
同源序列法克隆目的基因同源序列法克隆是一种常用的基因克隆方法，用于获取目的基因的DNA序列。
同源序列法克隆的主要步骤如下：1. 设计引物：根据已知目的基因的序列，设计一对引物（即寡核苷酸片段），其中一个引物具有与目的基因的5'端相互匹配，另一个引物具有与目的基因的3'端相互匹配。
2. 提取模板DNA：从包含目的基因的源生物体中提取总DNA 或特定组织/细胞中的DNA作为模板。
3. 聚合酶链反应（PCR）扩增：在PCR反应中使用设计的引物和模板DNA来扩增目的基因的DNA序列。
PCR反应通过多次循环加热和冷却来产生大量DNA复制品。
4. 凝胶电泳分析：将PCR扩增产物与分子量标记物一起加载在琼脂糖凝胶上进行电泳分离。
通过比较扩增产物与标记物在凝胶上的迁移距离，可以确定是否成功扩增了目的基因。
5. 纯化目的基因：从PCR反应中纯化目的基因的扩增产物，一般使用凝胶切片、DNA纯化试剂盒等方法。
6. 连接到载体：将纯化的目的基因DNA与适当的载体（如质粒）进行连接。
这通常涉及酶切目的基因和载体的DNA，然后使用连接酶将它们连接在一起。
7. 转化宿主细胞：将连接的DNA导入宿主细胞中，使其自行复制和表达。
这可以通过转染、电穿孔或热激冲等方法实现。
8. 筛选与鉴定：通过对转化后的细胞进行选择性培养或检测，筛选出带有目的基因的克隆。
常用的筛选方法包括抗生素筛选、荧光筛选等。
9. 验证目的基因：最终需要验证克隆中是否成功插入了目的基因。
这可以通过DNA测序、限制性酶切、PCR等方法来进行。
同源序列法克隆是一种有效的基因克隆技术，可用于获得感兴趣的基因序列并进一步研究其功能、表达和调控机制等。
8-3-基因克隆的基本过程
1. 制备目的基因和相）PCR扩增特定基因 （四）人工合成
5
1. 制备目的基因和相）PCR扩增特定基因 （四）人工合成
6
1. 制备目的基因和相b + + -
8
2.DNA分子的体外连接
黏性末端 人工接头（linker）的使用 加入同聚物（homopolymer）尾 平端连接
9
2.DNA分子的体外连接
黏性末端 人工接头（linker）的使用 加入同聚物（homopolymer）尾 平端连接
10
2.DNA分子的体外连接
常用方法： 遗传学方法 免疫学方法 核酸杂交法 PCR技术 酶切鉴定
20
4.DNA重组体的筛选和鉴定
常用方法： 遗传学方法 免疫学方法 核酸杂交法 PCR技术 酶切鉴定
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思考题：
如 何 克 隆 p53 基 因 的 部 分 序 列 （GenBank登录号:AF136270.1）？
基因克隆的基本过程
1
基因克隆主要步骤： 制备目的基因和相关载体； 将目的基因和有关载体进行连接； 将重组的DNA导入受体细胞； DNA重组体的筛选和鉴定； DNA重组体的扩增、表达和其他研究。
3
1. 制备目的基因和相）PCR扩增特定基因 （四）人工合成
黏性末端 人工接头（linker）的使用 加入同聚物（homopolymer）尾 平端连接
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2.DNA分子的体外连接
黏性末端 人工接头（linker）的使用 加入同聚物（homopolymer）尾 平端连接
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2.DNA分子的体外连接
黏性末端 人工接头（linker）的使用 加入同聚物（homopolyme人工合成
DNA合成过程示意图
基因克隆技术的基本步骤
基因克隆技术的基本步骤随着科技的不断发展，基因克隆技术越来越成为生命科学研究的重要手段。
在生命科学、医学等领域，基因克隆技术的应用十分广泛。
本文将介绍基因克隆技术的基本步骤。
一、选择载体DNA在基因克隆中，载体DNA是将外源DNA（待克隆DNA）转化进细胞的基础。
目前主要的载体DNA是质粒，其一般大小在1至20 kb之间。
质粒的选择应遵循以下几个原则：1. 合适的选体标识。
大多数载体都有一些明显的特征，例如特定的抗生素抗性或颜色，因此选择能够用于筛选的选体标识是基本原则之一。
2. 合适的克隆位点。
载体DNA上应具有克隆位点，以便将待克隆DNA插入到其中。
3. 可重复复制。
质粒必须带有在细胞内自我复制所必需的序列。
二、切割DNA通过限制性内切酶切割将待克隆DNA和载体DNA裂解成短的DNA片段。
这些片段在电泳时可以按照大小区分开，以便以后的克隆工作。
三、将外源DNA插入载体DNA外源DNA和载体DNA的连接需要使用DNA连接酶，如DNA ligase。
方法是将两个DNA片段的末端和连接起来形成一个完整的DNA分子。
连接成功后，形成了一个混合DNA。
由于载体的复制和传递，待克隆DNA也可以被大量复制。
四、将混合DNA转化进宿主细胞将混合DNA转化进宿主细胞是整个克隆过程中至关重要的一步，因为宿主细胞受到质粒的干扰，催化质粒遗传信息的传递与表达。
大多数质粒都需要在易感受性细胞中才能存在并复制。
宿主细胞的选择是非常重要的，有些宿主细胞对外源DNA的吸收和扩增效率非常高，充分利用每一个获得的外源DNA分子。
五、筛选克隆基因最后一步是克隆基因的筛选，筛选克隆基因需要具有合适的筛选方法。
常用的筛选方法是使用抗生素抗性，因为载体上通常带有抗生素基因，能够筛选那些携带载体克隆块的细胞。
克隆基因的筛选方法不止于抗生素抗性，还可以根据不同的克隆目标进行选择。
例如，当克隆目标是蛋白质时，可以使用融合蛋白法克隆兴趣的编码DNA，并利用其蛋白质结构的特点分离出融合蛋白。
基因克隆的顺序
基因克隆的顺序
基因克隆的顺序通常包括以下步骤：
1. 选择目标基因：确定需要克隆的基因，可以是某个特定的基因，也可以是一段DNA序列。
2. 提取DNA：从源生物体中提取目标基因的DNA，通常使用DNA提取试剂盒来提取。
3. 制备质粒：选择一个适当的质粒，将其准备好作为目标基因的载体。
质粒通常是一段环状的DNA分子，可以自复制并在细胞中稳定存在。
4. 执行DNA切割：使用限制性内切酶将目标基因和质粒切割成相应的DNA片段。
内切酶是能够识别特定DNA序列并在其特定的位置进行切割的酶。
5. 连接DNA片段：将目标基因的DNA片段与质粒的DNA片段连接起来。
这可以通过DNA连接酶来实现，DNA连接酶能够催化两个DNA片段的连接。
6. 转化宿主细胞：将连接好的质粒转化到宿主细胞中，通常使用细菌作为宿主细胞。
转化可以通过电穿孔、化学方法或热激转化等方式进行。
7. 筛选重组细胞：利用筛选性培养基或标记基因等方法筛选出含有重组质粒的
细胞。
8. 纯化重组质粒：从筛选出的重组细胞中提取重组质粒。
9. 分析重组质粒：对提取出的重组质粒进行测序、限制性酶切等分析，确认克隆基因的准确性。
10. 表达目标基因：如果希望表达克隆的基因，可以将重组质粒转化到表达宿主细胞中，例如真核细胞或类似细胞。
需要注意的是，基因克隆的具体步骤可能会因实验目的、实验方法和克隆体的复杂性而有所不同。
利用同源序列法克隆基因的基本步骤
利用同源序列法克隆基因的基本步骤一、概述基因克隆是现代生物学研究中的重要技术手段之一，其主要目的是在体外构建包含目标基因的DNA分子。
同源序列法是一种常用的基因克隆方法，通过在一个已知基因的上下游区域找到相同的DNA序列，然后利用PCR或限制酶技术将目标基因从细胞中扩增、截取并插入到适当的质粒载体中。
本文将介绍利用同源序列法克隆基因的基本步骤。
二、材料与设备准备1. 目标基因的DNA序列- 确定目标基因的DNA序列，并设计引物2. PCR试剂盒3. DNA酶- 包括限制酶和连接酶4. DNA纯化试剂盒5. DNA电泳仪器6. 质粒载体及相关试剂7. 载体宿主细胞三、PCR扩增目标基因1. 初始步骤- 设计适当的引物，确保引物的序列与目标基因的同源序列相匹配 - 准备PCR试剂盒和PCR仪器2. PCR扩增- 按照试剂盒说明书的操作步骤，进行PCR扩增反应- 调节PCR反应条件，使扩增得到高特异性和高产量的目标DNA片段四、DNA片段纯化1. 提取PCR产物- 使用DNA纯化试剂盒，将PCR产物从反应混合物中纯化出来2. 纯化后的DNA片段检测- 使用DNA电泳仪器，检测纯化后的DNA片段是否符合预期大小五、限制酶切与质粒载体处理1. 限制酶切- 根据预先设计好的限制酶切位点，对目标基因DNA片段和质粒载体进行限制酶切2. 质粒载体处理- 在限制酶切反应后，使用连接酶将目标基因DNA片段连接到质粒载体上六、DNA片段转化与宿主细胞处理1. DNA片段转化- 将连接好的质粒载体转化到适当的宿主细胞中2. 宿主细胞处理- 处理转化后的宿主细胞，筛选带有目标基因的正反应克隆子七、目标基因测序确认1. 选取克隆子- 从宿主细胞中分离带有目标基因的正反应克隆子2. 目标基因测序- 对克隆子进行测序确认，确保目标基因的序列正确无误八、结语利用同源序列法克隆基因是一项关键而复杂的实验技术，需要准备充分的材料与设备，严格按照步骤进行操作。
整个基因克隆实验规程完整
整个基因克隆实验规程完整Document serial number【KK89K-LLS98YT-SS8CB-SSUT-SST108】一、组织总RNA的提取相关试剂：T rizol；氯仿；苯酚；异丙醇；75%乙醇；RNase-free水相关仪器：制冰机；液氮&研钵/生物样品研磨仪；高速离心机；移液器（1ml、200μl、100μl/50μl）；涡旋振荡仪；恒温金属浴。
相关耗材：解剖工具，冰盒，离心管，离心管架，吸头（1ml，200μl/300μl），一次性手套，实验手套。
实验步骤1.取暂养草鱼，冰上放置一段时间，然后解剖，剪取肠道50~100mg，放入研钵中，加入液氮迅速研磨，然后加入1ml 预冷TRIzol试剂，充分研磨至无颗粒物存在。
2.转移到离心管中，室温放置5min，使细胞充分裂解；3.按1ml Trizol加入200μl氯仿，盖上盖子，迅速充分摇匀15s，然后室温放置3min；4.4℃，,12000g 离心15min；此时混合物分为三层，下层红色的苯酚氯仿层，中间层和上层无色水相；RNA存在于无色水相中；5.小心吸取上清液，千万不要吸取中间界面，否则有DNA污染；转移至一个新的离心管，加入等体积的异丙醇，轻轻混匀；6.室温放置10min；4℃，,12000g 离心10min；7.弃上清，加入1ml 75%乙醇洗涤；涡旋，悬浮沉淀；4℃，,12000g 离心5min；8.弃上清；可以再次用75%乙醇洗涤沉淀；9.弃上清；用移液器轻轻吸取管壁或管底的残余乙醇，注意不要吸取沉淀；室温放置5min晾干沉淀；（RNA样品不要过于干燥，否则极难溶解）10.沉淀中加入30μl RNase-free水，轻弹管壁，使RNA溶解。
RNA质量检测相关试剂：溴酚蓝， TEB/TAE电泳缓冲液，溴乙锭（EB）相关仪器：（超微量分光光度计，移液器（2.5μl 或2μl 规格，10μl规格），电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，制冰机）相关耗材：（无菌无绒纸，吸头，离心管架，PCR管，PCR管架，锥形瓶，烧杯，一次性手套，实验手套，冰盒）（1）RNA纯度的检测：测定其OD260和OD280的值，根据其OD260/ OD280的比值，当其比值在1.9~2.1之间，说明提取的总RNA纯度比较高，没有蛋白质和基因组的污染。
cdna基因克隆的基本原理和流程
一、CDNA基因克隆的基本原理CDNAplementary DNA）是DNA的互补序列，通过反转录酶将mRNA作为模板合成的一种DNA。
CDNA基因克隆是利用逆转录酶将mRNA逆转录合成cDNA，并通过PCR或其他方法将cDNA插入到质粒载体中，实现对目标基因的克隆。
二、CDNA基因克隆的流程1. RNA提取：首先需要从细胞中提取出总RNA，可以使用TRIzol等试剂进行RNA的提取纯化工作。
2. 反转录合成cDNA：将提取得到的RNA作为模版，利用逆转录酶进行cDNA的合成。
反转录反应通常包括RNA模版、随机引物、dNTPs、逆转录酶和缓冲液，并经过一系列温度循环反应，将mRNA 逆转录成cDNA。
3. cDNA纯化：为了避免反转录反应中产生的非特异性产物和杂质，需要对反转录反应产物进行纯化。
4. cDNA扩增：对cDNA进行PCR扩增，以获得目标基因的cDNA 片段。
PCR反应体系包括cDNA模板、引物、dNTPs、Taq聚合酶和缓冲液，通过一系列温度循环反应，扩增目标基因cDNA片段。
5. 酶切与连接：将PCR扩增得到的cDNA片段与质粒载体进行酶切，并在两者的黏端上连接。
6. 转化：将连接得到的质粒转化入大肠杆菌等细菌中，使其进行复制。
7. 筛选与鉴定：通过筛选和鉴定，选出携带目标基因cDNA片段的质粒，进行测序和分析，最终确定目标基因序列。
三、CDNA基因克隆的应用CDNA基因克隆技术已广泛应用于基因克隆、基因表达等多个领域。
在科研领域中，通过CDNA基因克隆技术可以方便快捷地获得目标基因的cDNA，实现对目标基因的研究和功能分析；在医药领域，CDNA基因克隆技术也被应用于基因治疗、蛋白表达等方面。
总结：CDNA基因克隆是一种重要的基因工程技术，通过反转录酶合成cDNA并将其插入到质粒中，可以方便地获取目标基因序列，具有广泛的应用前景。
掌握CDNA基因克隆的基本原理和流程对于开展相关实验研究具有重要意义。
基因克隆、假病毒操作步骤
实验名称：基因克隆实验器材:荧光定量PCR仪、摇床、离心机、生工PCR产物纯化试剂盒、恒温加热器、NEB连接体系、灭菌纯水、JM109感受态、冰、LB培养基、酒精灯、涂棒、氨苄、氨苄抗性平板、甘油等；操作步骤：1、可通过PCR进行拼接获得目的基因的，过柱纯化（生工试剂盒根据说明书进行纯化，在最后一步的洗脱可以用预热的灭菌纯水洗脱，在加灭菌纯水洗脱的时候一定要加在纯化柱子的膜中间）；2、选择合适的载体（EZ-T）用连接酶进行连接，NEB体系，16℃过夜连接T4lages 1.010×T4buffer 2.0EZ-T 1.0目的基因8.0DdH2O 8.0＿＿＿＿＿＿＿＿＿20ul3、取100µl摇匀后的JM109感受态细胞悬浮液（如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面的操作），加入10µl连接产物，轻轻摇匀，冰上放置30min后，于42度水浴中保温90s，然后迅速在冰上冷却2min；4、加入500µl LB液体培养基，混匀于37℃振荡培养45min使受体菌恢复正常生长状态并使转化体产生抗药性；5、将恢复培养的菌体5000rpm离心3min，移去上层LB培养基，用余下的200µl重悬菌体，并用灭菌玻璃推子(酒精灯上烧后冷却)，均匀涂布于琼脂凝胶表面（氨苄抗性），37℃倒置培养12~16小时；6、挑取多个单克隆菌落分别接种到1ml含有抗生素（氨苄）的LB液体培养基中，37℃振荡培养3h；7、培养1-2小时即可以利用PCR（定量或定性）进行鉴定；8、选取初步鉴定阳性的菌液送测序，测序正确后甘油保存（甘油的浓度为30%-50%），充分混匀，-80℃保存；实验名称：假病毒的制备实验器材：荧光定量PCR仪、摇床、离心机、生工小剂量抽提试剂盒、生工胶回收试剂盒、恒温加热器、NEB连接体系、灭菌纯水、冰、LB培养基、氨苄、卡那、卡那抗性平板、甘油等；操作步骤：1、选取测序结果正确的菌种以1：100 的比例接种到含氨苄（1：1000）的5ml LB 培养基中过夜培养中，37℃，200r/min；2、收集菌体抽提质粒，用生工小剂量抽提质粒试剂盒跟据说明书进行抽提，在抽提过程中要注意防污染（在最后一步的洗脱可以用预热的洗脱液洗脱，在加洗脱液的时候一定要加在纯化柱子的膜中间）；3、用抽提好的质粒做双酶切用NEB公司的体系，同时做一管PET28-MS2的双酶切20ulBamH 1 2.5ul BamH 1 1.0ul HindIII 2.5ul HindIII 1.0ulBSA 5.0ul BSA 2.0ulBuffer2 5.0ul Buffer2 2.0ul产物20ul PET28-MS2 8.0H2O 15ul H2O 15ul＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿50.0 ul20.0ul37度3小时，4、配置1%的大空胶，将双酶切产物跑胶，割胶（在割胶的时候要注意产物不要在紫外灯光下暴露太久），用生工胶回收试剂盒进行回收根据说明书进行纯化；PET28-MS2直接用生工PCR产物回收试剂盒进行纯化；5、将回收好的酶切产物进行连接用NEB的连接体系，16℃，过夜连接T4lages 1.0ul10×T4buffer 2.0ulPET28-MS2 4.0ul目的片段8.0ulDdH2O 6.0ul＿＿＿＿＿＿＿＿＿20ul6、取100µl摇匀后的BL21感受态细胞悬浮液（如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面的操作），加入10µl连接产物，轻轻摇匀，冰上放置30min后，于42度水浴中保温90s，然后迅速在冰上冷却2min；7、加入500µl LB液体培养基，混匀于37℃振荡培养45min使受体菌恢复正常生长状态并使转化体产生抗药性；8、将恢复培养的菌体5000rpm离心3min，移去上层LB培养基，用余下的200µl重悬菌体，并用灭菌玻璃推子(酒精灯上烧后冷却)，均匀涂布于琼脂凝胶表面（卡那抗性），37℃倒置培养12~16小时；9、挑取多个单克隆菌落分别接种到1ml含有抗生素（卡那）的LB液体培养基中，37℃振荡培养，培养1-2小时即可以利用PCR（定量或定性）进行鉴定；10、选取初步鉴定阳性的菌液送测序，测序正确后甘油保存（甘油的浓度为30%-50%），充分混匀，-80℃保存；11、选取测序结果正确的菌种以1：100 的比例接种到含卡那霉素的5ml LB 培养基中过夜培养，37℃，200r/min；12、将1ml 过夜培养的菌液接种到100ml 含卡那青霉素的LB 培养基中，37℃，200r /min 振荡培养4 -6h 至OD 600值大约在0.6-0.8；13、加入终浓度为1mmol/L (IPTG)，在37℃条件下，200 r /min诱导表达16h；14、10,000 rpm，4℃，离心10min，收集菌体，加入1×超声buffer 5 ml重悬菌体；<摇床一小时>15、超声处理：置于冰上超声，功率300W，超声时间2<5>s，间隔时间3<5>s，全程3min，超声12<10>个循环；16、将破碎完全的表达产物12,000 rpm，4℃，离心30min，沉淀细胞碎片，收集上清到另一干净的离心管中，得到含病毒样颗粒的表达产物，分装保存-80℃保存；17、将得到的病毒样颗粒的双酶消化验证实验分别取4 份用NEB公司的DNaseI、生工的RNaseA 进行消化37℃消化1h-2h18、1.0％琼脂糖凝胶电泳检测酶消化结果；19、去第1次消化产物进行第2次消化37℃1h-2h（用NEB公司的DNaseI）DNaseI 40ul10×DNaseIBuffer100ul消化产物10ulTE 850ul＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿1ml20、DNaseⅠ消化后，加入终浓度为5mM的EDTA终止反应，然后65度10分钟使DNaseⅠ失活；21、提取RNA标本后上荧光定量，检验病毒颗粒的浓度和质粒的消化情况。
基因克隆实验报告
基因克隆实验报告摘要：本实验旨在通过基因克隆技术，将特定基因从一个细胞中复制并插入到另一个细胞中，以实现基因的传递和表达。
实验采用了大肠杆菌作为模型生物，利用质粒载体和限制酶切技术完成了基因的克隆和转移。
通过本实验的操作，成功地将目标基因从一个细胞复制并转移到另一个细胞中，验证了基因克隆技术的有效性。
一、实验材料和方法1. 实验材料：- 大肠杆菌菌种- 目标基因DNA样本- 质粒载体- 限制酶- DNA连接酶- 抗生素培养基2. 实验步骤：步骤一：菌液制备1. 取一支滤漏筒，加入适量的LB培养基，用移液管取一小部分大肠杆菌菌种，接种于LB培养基中，静置在37℃恒温摇床中培养过夜。
步骤二：DNA提取1. 取LB培养基中的大肠杆菌菌液，用离心机进行离心分离，将上清液去除，留取沉淀。
步骤三：DNA酶切1. 取目标基因DNA样本和质粒载体，分别加入限制酶，按照限制酶切反应的条件进行反应。
步骤四：DNA连接1. 取等体积的酶切后的目标基因DNA和质粒载体，加入DNA连接酶，按照连接酶反应条件进行反应。
步骤五：转化1. 将连接后的DNA溶液加入已经制备好的培养基中，用恒温摇床静置培养。
步骤六：筛选1. 取一块含有抗生素的琼脂平板，将转化后的菌液均匀涂布在平板上，放入恒温箱培养。
步骤七：分离1. 从琼脂平板上挑选抗生素抵抗的单个菌落，进行培养。
二、实验结果与分析通过本实验的操作，成功地将目标基因从一个细胞复制并转移到另一个细胞中。
在转化后的琼脂平板上，观察到一些菌落的形成，这些菌落对抗生素具有抗性。
说明转化后的细胞成功地表达了目标基因，并能产生相应的蛋白质。
三、讨论与总结基因克隆技术是现代生物学研究中常用的实验手段之一。
通过限制酶切和DNA连接，可以实现基因的克隆和转移。
本实验结果表明，大肠杆菌是一个有效的模型生物，可用于基因克隆实验。
通过对转化菌落的筛选和培养，可以得到具有抗生素抵抗能力的菌落，进一步验证了实验结果的有效性。
1.基因克隆的步骤
基因克隆的步骤一、RNA的提取1. 提取RNA前将洗净干燥的瓷研钵放入-70℃预冷10 min；2. 从液氮罐中取出样品组织放入预冷的研钵中，加液氮淹没后立即研磨，边研磨边加液氮，整个过程都不要使液氮挥干；3. 趁冷，将样品粉末50-80 mg加入1.5 mL离心管后再加入1 mL Trizol，样品体积应不超过所使用Trizol体积的10%，然后按照Trizol试剂盒说明操作；4. 室温静止5-15 min。
对于某些蛋白、多糖或脂含量很高的细胞或组织Trizol裂解后可能会有不溶物或油脂状漂浮物，需12000g、4℃离心10 min，然后吸取澄清的Trizol裂解产物至一新的离心管中；5. 每mL Trizol中加0.2 mL氯仿。
小心盖上离心管，剧烈地涡旋振荡15 sec，室温（24℃）静置3-5 min；（必需步骤）6. 12000 g、4℃离心15 min，此时混合物分成三部分：底层为苯酚-氯仿层，中间层，上层水相层，RNA完全存在水相中；7. 把小于80%的水相层（每mL Trizol约可吸0.5-0.55 mL）转移至一新的离心管中，并弃去下面的有机相（小心避免吸到中间层）。
往水相中加入异丙醇来沉淀RNA，每使用1 mL Trizol，便加500 uL的异丙醇，颠倒混匀，室温下孵育样品10 min；8. 4℃、12000 g离心样本10 min弃去上清，每mL Trizol加入1 mL 75%乙醇，涡旋混匀，室温沉淀10 min后，7500 g、4℃离心5 min，弃上清。
再用离心机甩一下（5000rpm，离心1 s）；9. 小心吸走乙醇，短暂地在室温下置2-5 min，让RNA团风干，不要用离心干燥装置或真空干燥装置，因为过度干燥会导致很难用水重新溶解RNA，然后在55-60℃温浴10 min，然后-70℃保存。
[RNA]（ng/uL）=A260×40×稀释倍数[DNA]（ng/uL）=A260×50×稀释倍数纯DNA：OD260/OD280≈1.8（＞1.9，表明有RNA污染；＜1.6，表明有蛋白质、酚等污染）纯RNA：1.7＜OD260/OD280＜2.0（＜1.7时表明有蛋白质或酚污染；＞2.0时表明可能有异硫氰酸残存）二、M-MLV RT反转录1. oligo dT 1 uL + dNTP（2.5 mM）4 uL + 1-5 ug total RNA + 水= 12 uLHeat mixture to 65℃ for 5 min and quick chill on ice；2. 上述12 uL液体+ 5×Buffer 4 uL + 0.1 M DTT 2 uL + RNase OUT 1 uLMix contents of the tube，incubate at 37℃for 2 min3. 上述19 uL液体加M-MLV RT 1 uLIncubate tube at 25℃for 10 min；Incubate 50 min at 37℃；70℃for 15 min。
基因克隆步骤完整版
基因克隆步骤完整版基因克隆是一项复杂的生物技术，可以用于生物研究、药物开发和农业改良等领域。
下面是基因克隆的完整步骤：1.设计克隆实验方案：首先，确定要克隆的基因序列。
这可以是来自同一物种的已知基因，或者是从其他物种中提取的基因。
然后，设计适当的引物（引物是专门设计用来扩增特定DNA序列的短片段）用于PCR扩增。
2.DNA提取：提取目标组织或细胞中的DNA。
常用的DNA提取方法包括酚/氯仿法、盐法和商业DNA提取试剂盒等。
3.PCR扩增：使用引物和DNA模板进行多轮PCR扩增，从而产生大量目标基因的复制。
4.凝胶电泳：将PCR产物进行凝胶电泳分析，以确认扩增是否成功，并确定目标基因的大小。
5.DNA纯化：将目标基因的PCR产物从凝胶中切割并纯化。
这通常通过使用商业DNA凝胶提取试剂盒来完成。
6.多重限制性内切酶切割和连接：根据克隆方案中的设计，使用适当的限制性内切酶切割DNA。
然后，将目标基因连接到一个载体DNA中，这个载体DNA称为克隆载体。
克隆载体通常是一个圆形的质粒DNA。
7.转化：将克隆载体插入到宿主细胞中。
这可以通过热激冷转化、电转化或化学转化等方法实现。
8.筛选转化子：使用适当的筛选方法筛选转化子。
这可以通过选择性培养基，例如含有抗生素的培养基，或者通过对转化子进行荧光筛选等方法。
9.扩增：从筛选出的阳性克隆中提取DNA，并使用PCR或其他方法进行扩增。
10.序列分析：对扩增的DNA进行序列分析，以确认克隆是否成功。
这可以通过将DNA提交给商业实验室进行测序，或者使用自动测序设备进行测序。
11.功能分析：对克隆所得基因进行功能分析。
可以通过转基因生物的研究，观察基因对生物表型的影响。
12.存储和应用：将克隆所得的基因保存在冷冻库中，以备后续研究或应用。
总结：基因克隆是一项复杂的过程，包括基因序列设计、DNA提取、PCR扩增、凝胶电泳、DNA纯化、限制性内切酶切割和连接、转化和筛选转化子、扩增、序列分析、功能分析和存储等步骤。
基因克隆 操作步骤原理及注意事项
一：提质粒1：提取ml的菌液放到EP管中，12000r/s 30s离心，去除菌液，加入100微升的TE 振荡混匀后加入200微升裂解液二，轻轻混匀，是使细胞破碎，同时使蛋白变性和保持其高碱性，再加入150裂解液三轻轻混匀是鞋包裂解开（最佳的效果是上层是蛋白，下层是透明的液体），离心10min，将液体转移到另一个EP管中，加入等体积的异丙醇，静置10min或更长（一般以析出的DNA为主蛋白次之），离心10min 12000rpm/s ，除去上清液，加入400微升的70%的乙醇洗（去除里面的有机溶剂，同时使DNA 沉淀），去除乙醇，室温下开口放置5-10min或放到烘箱中使乙醇挥发干，再加入20微升的水，跑胶看浓度溶液I：Tris-Cl控制PH；葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉，抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。
溶液II：NaOH裂解细胞的作用；SDS主要是变性蛋白，也有溶解细胞的作用。
溶液III：3 M 醋酸钾钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。
SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，同时大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了；2 M 醋酸中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和之。
25/50酚+24/50氯仿+1/50异戊醇的作用：酚抽提蛋白的作用；氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；异戊醇的添加，其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。
乙醇---100%沉淀质粒的作用；70%洗质粒去离子的作用；RNase水：消化所提质粒中的RNA。
2：消化补到50微升体系，再加入5微升的RNase 放入37℃ 2-3个小时3：抽提加入150微升的TE补到200微升体系加入100微升的氯仿 100微升的苯酚充分混匀 12000rpm/s 10min 离心将上层液体转到新EP管中再像其中加入200微升的氯仿充分混匀，12000rpm/s 离心，取上层液体到新EP管中，加入1/4体积的5mol/L的NaCl 两倍体积的无水乙醇，放入-20℃ 3小时沉降后离心 12000rpm/s 10min ，70%的乙醇洗干，再晾干或烘干加20微升的水跑胶检测补充：酚氯仿法提取DNA的原理用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。
基因克隆实验流程
基因克隆实验流程基因克隆技术，又称重组 DNA 技术，是将目的基因与具有自主复制能力的载体DNA 进行体外重组，获得新的重组DNA后导入受体细胞中表达相应蛋白，以研究蛋白结构与功能及其与其他分子的相互作用。
一、获取目的基因目的基因就是需要研究的特定基因或DNA片段。
获取目的基因的主要方法： 1、用限制性内切酶解染色体DNA，构建基因组文库，再从基因组文库中筛选目的基因。
该法的优点是获得的目的基因的组织结构与天然基因完全相同，在结构基因中也含有内含子序列，但是也正因为这一点构成了该法最大缺点，即含有内含子的基因在原核细胞中不能表达。
原因是原核细胞不能识别并剪切插入顺序(内含子)，因而也不能表达出正确的基因产物。
2、分离纯化细胞中的mRNA，以mRNA为模板，在反转录酶作用下生成cDNA第一链，再以cDNA第一链为模板在DNA聚合酶作用下生成双链cDNA,构建cDNA文库，从中筛选所需的目的基因。
此法仅用于筛选为蛋白质编码的结构基因。
因成熟的mRNA分子中已经切除了内含子序列，具有完整的阅读框架，可在原核细胞中正确表达。
3、人工体外合成基因：由于当前人工体外合成DNA的长度有限，此法仅用于制备小分子生物活性多肽基因和小分子量蛋白基因。
在基因较大情况下，常需先合成多个DNA片段，然后拼接成完整的基因，此法还要求目的基因的全部碱基顺序已被阐明。
4、PCR法扩增基因：PCR(聚合酶链式反应)技术的出现和发展，为目的基因的寻找提供了有力技术工具。
用PCR法可选择性扩增基因组中所要研究的个别基因或DNA片段，或用反向PCR技术，先将特定mRNA反转录为cDNA第一链，然后再进行扩增。
用PCR法筛选基因，需要对目的基因的DNA序列至少有部分了解。
二、选择适当的载体按上述方法制备的目的基因如果没有合适的载体协助，很难进入受体细胞，即使能进入，往往也不能进行复制和表达，因为这些外源性DNA一般不带有复制调控系统。
为了保证目的基因或外源DNA片段能在细胞内克隆，必须将它们与适当的载体连接。
基因克隆步骤完整版
1总RNA提取(1) 液氮研磨或冰上匀浆实验材料；先将1ml Trizol加到离心(7) 弃上清，加1 mL75%乙醇，漂浮洗涤沉淀，振荡充分；再用100%乙醇清洗(8) 4o C，7,500g，离心5 min；(9) 弃上清，离心，用枪吸取多余液体，放在超净台里干燥后，加50 μL DEPC水，－80o C保存。
此操作中所用到的器皿均需经过DEPC灭活RNA酶处理。
提取的2反转录/cDNA第一链的合成RNA纯化后，即可进行反转录。
其体系为：5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time） 4μLPrimeScript RT enzyme mix Ⅰ1μL RT Primer Mix 1μL上一步的反应液10μLO 补齐至20μL RNase Free dH2 Array模板5μL 引物1 (10 μM) 1 μL引物2 (10 μM) 1 μLddHO 18μL2PCR反应条件为：94°C预变性5min；94°C变性30s，53°C退火30s，72°C延伸30s，循环36次；72°C延伸10min。
(3) 将样品倒入一个吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中），室温下13,400×g离心1 min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CB2重新套回收集管中；(4)向吸附柱CB2中加入600μL漂洗液PW（加乙醇），室温下13,400×g离心1 min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CB2重新套回收集管中；(5) 重复上一步骤；(6) 将吸附柱CB2放入收集管中，室温下13,400×g离心2 min，尽量除去漂洗液，将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干；(2) 16o C反应30分钟，所得产物保存于－4o C冰箱备用。
4.3连接产物转化E.coli DH5α(1) 将5 µL连接产物加入到100µL E.coli DH5α感受态细胞中，轻轻旋转离心管混匀内容物，冰上静置30 min；(2) 42o C水浴热激转化90 sec，立即放回冰上，放置3 min；(3) 每管加入500 µL LB培养基（室温放置），37o C 160-180 rpm振荡培养45-60 min，使菌体复苏并表达抗性基因；(4) 在含有Amp（100 µg/m L）的选择性平板上加入60-100 µL 菌液，用无菌涂布棒轻轻涂布均匀后，用Parafilm膜封好；。
基因克隆方法步骤
克隆步骤一、目的片段的回收纯化1．柱平衡步骤：向吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中）加入500ul 平衡液BL,12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
（请使用当天处理过的柱子）。
2．将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取重量。
3．向胶块中加入加入溶液PC(0.1g加入100ul，注意没过胶块)，50℃水浴放置10min左右，期间不断温和地上下翻转离心管，已确保胶块充分溶解。
4．将上一步所得溶液加入一个吸附柱（吸附柱放入收集管中），12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
5．向吸附柱CB2中加入600ul漂洗液（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
6．重复步骤5.7．将吸附柱CB2放入收集管中，12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干。
8．将吸附柱CB2放入一个干净的1.5ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加40ul的无菌水。
室温放置2min，12000rpm离心2min，收集DNA溶液。
(可以将离心后的溶液重新加到柱子中再回收一次) 9．取2ulDNA加入loading buffer点样，电泳检测是否回收出来样品。
二、目的片段与载体的连接1. 将回收的目的片段与T 载体连接，反应体系如下：目的片段 4 .5µLpMD19-T simple Vector 0.5µLSolutionⅠ 5 µLTotal 10 µL按上述体系依次加入各组分后，旋涡混匀，稍加离心后置于16℃连接过夜。
2.转化1)从-80 ℃冰箱中取50 µL 感受态细胞在冰上解冻。
2)在超净工作台上，加入10 µL 连接产物，轻轻混匀，冰上放置30 min 。
简述基因克隆主要过程
基因克隆主要过程一、基因克隆概述基因克隆是指将一个细胞中的某个基因序列复制并转移到另一个细胞中，从而使目标基因得以表达。
基因克隆的过程包括：选择适当的宿主细胞、构建载体、将目标基因插入载体中、转化宿主细胞、筛选转化成功的细胞并培养、分离纯化目标基因等步骤。
本文将对这些过程进行详细的介绍。
二、选择适当的宿主细胞选择适当的宿主细胞是基因克隆的第一步。
通常情况下，常用的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母等。
选择宿主细胞的标准主要包括以下几个方面：1.易于培养：宿主细胞应具备简单、廉价、高效的培养条件，以便进行大规模的培养和筛选。
2.安全性：宿主细胞不应具备对人体有害的特性，以免对生物安全造成威胁。
3.生长速度：宿主细胞应具备较快的生长速度，以便加快基因克隆的进程。
三、构建载体在基因克隆中，常用的载体有质粒、病毒和人工染色体等。
构建载体的主要目的是将目标基因插入到载体中，并确保其能够被宿主细胞所识别和复制。
构建载体的步骤如下：1.获取载体：从自然界或者实验室中获取合适的载体，并通过酶切和连接等技术进行改造。
2.插入目标基因：将目标基因与载体进行连接，一般通过限制性酶切和连接酶的作用，将目标基因与载体的开放的端部连接。
3.反选：通过选择适当的标记（如抗生素耐药性基因）进行反选，以筛选出成功插入目标基因的载体。
四、将目标基因插入载体中将目标基因插入载体中是基因克隆的核心步骤，常用的方法有PCR扩增插入法、限制性内切酶法和电泳法等。
1. PCR扩增插入法PCR扩增插入法是目前常用的一种方法。
具体步骤如下：1.PCR扩增：使用PCR技术将目标基因的DNA序列扩增得到线性DNA片段。
2.载体切割：使用限制性内切酶将载体切割成开放的线性片段。
3.连接：将扩增得到的目标基因片段与载体线性片段进行连接，需注意连接时选择合适的限制性内切酶。
2. 限制性内切酶法限制性内切酶法是较为传统的方法，也是基因克隆中常用的一种方法。
具体步骤如下：1.载体切割：使用限制性内切酶将载体切割为开放的线性片段。
转录组序列基因克隆
转录组序列基因克隆
转录组序列基因克隆是一种用于从转录组数据中克隆基因的方法。
以下是一般的步骤：
1. 获得转录组数据：通常通过 RNA 测序（RNA-seq）技术获得转录组数据。
这些数据提供了有关细胞或组织中表达的所有 RNA 分子的信息。
2. 筛选目标基因：根据研究的目的，从转录组数据中筛选出感兴趣的目标基因。
这可以基于特定的表达模式、功能注释或其他相关的生物信息学分析。
3. 设计引物：针对目标基因的序列，设计特异性的引物用于 PCR 扩增。
4. PCR 扩增：使用设计的引物，从转录组数据对应的 cDNA 文库中进行 PCR 扩增。
这将产生目标基因的特定片段。
5. 克隆和测序：将 PCR 扩增的产物克隆到适当的载体中，并进行测序以确认所克隆的序列的准确性。
6. 功能分析：对克隆的基因进行进一步的功能分析，例如表达分析、蛋白质表达和功能研究等。
需要注意的是，转录组序列基因克隆的成功与否取决于许多因素，包括转录组数据的质量、引物的设计、PCR 条件等。
在进行该方法之前，建议对相关技术和实验步骤有一定的了解，并根据具体情况进行优化和调整。
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1总RNA提取
令狐采学
(1) 液氮研磨或冰上匀浆实验资料；先将1mlTrizol加到离心管中待用
(2) 将研磨好的样品加到离心管中混匀，室温放置5 min；掀开离心机预冷
(3) 加200 µL氯仿，振荡15 sec，室温放置3 min，分层；
(4) 4oC，12,000g，离心15 min；
(5) 取上清，加500 μL异丙醇，混匀，室温放置10 min；
(6) 4oC，12,000g，离心10 min；
(7) 弃上清，加1 mL75%乙醇，漂浮洗涤沉淀，振荡充分；再用100%乙醇清洗
(8) 4oC，7,500g，离心5 min；
(9) 弃上清，离心，用枪吸取过剩液体，放在超净台里干燥后，加50 μL DEPC水，－80oC保管。
此操纵中所用到的器皿均需经过DEPC灭活RNA酶处理。
提取的总RNA需经RNA电泳检测质量，并用紫外分光光度计测定浓度。
OD260值为核酸的吸收值，OD280值为卵白的吸收值，OD260/280值在1.82.0间一般说明该核酸卵白含量在允许的规模内，可正常使用；另外还有OD230值为多糖和酚类的吸收值，比较干净的核酸OD260/230值能达到2.2左右。
RNA浓度计算公式：总RNA 浓度
（µg/mL）=A260×稀释倍数×40。
2反转录/cDNA第一链的合成
纯化RNA以去除基因组DNA，操纵按TaKaRa公司的PrimeScript RT reagent with gDNA Eraser(Perfect Real Time)说明书进行。
其体系为：
Total RNA 1μg
5× gDNA Eraser Buffer 2μL
gDNA Eraser 1μL
RNase Free dH2O 补齐至10μL 条件为：42oC，2min；
RNA纯化后，即可进行反转录。
其体系为：
5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time）4μL PrimeScript RT enzyme mix Ⅰ1μL
RT Primer Mix 1μL
上一步的反响液10μL
RNase Free dH2O 补齐至20μL 操纵条件为：
(1) 37oC放置15 min； (2) 85oC，5 sec； (3) 4oC保管。
3 PCR
按TaKaRa公司的Premix Taq Version 2.0操纵，，PCR反响体系如下：
Premix Taq 25μL
模板5μL
引物1 (10 μM)1μL
引物2 (10 μM)1μL
ddH2O 18μL PCR反响条件为：94°C预变性5min；94°C变性30s，53°C 退火30s，72°C延伸30s，循环36次；72°C延伸10min。
PCR反响完毕，取5μL反响产品进行1%琼脂糖凝胶电泳（若割胶回收则用10μL反响产品）。
4 基因克隆及测序
4.1 PCR产品切胶回收
将PCR产品用1%琼脂糖凝胶进行电泳，在紫外灯下观察并切下预期年夜小的DNA片段。
使用TIANGEN公司的Universal DNA Purification Kit割胶回收试剂盒进行纯化，步调如下：
(1)平衡吸附柱：向吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中）加入500μL平衡液BL，13,400×g离心1 min，倒失落收集管中的废液，吸附柱CB2重新套回收集管中；
(2) 按100 mg agarose胶加入100μL溶液PC，置于50oC中10 min左右，中途混匀几次，至胶完全融化；
(3) 将样品倒入一个吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中），室温下13,400×g离心1 min，倒失落收集管中的废液，吸附柱CB2重新套回收集管中；
(4)向吸附柱CB2中加入600μL漂洗液PW（加乙醇），室温下13,400×g离心1 min，倒失落收集管中的废液，吸附柱CB2重新
套回收集管中；
(5) 重复上一步调；
(6) 将吸附柱CB2放入收集管中，室温下13,400×g离心2 min，尽量除去漂洗液，将吸附柱置于室温放置数分钟，完全晾干；
(7) 将柱子套入一新的灭菌1.5 mL离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50µL洗脱缓冲液，室温放置2分钟，13,400×g室温离心2 min，收集到的洗脱液即为回收的DNA纯化液；
(8) 取5µL的纯化液体进行1%琼脂糖凝胶电泳，以检查纯度，并丈量溶液中DNA含量。
4.2目的片段与载体连接
(1) 胶回收产品与T载体连接体系，参考Takara公司pMD18T 载体的试剂盒说明书。
在灭菌的0.5 mL 离心管中配制如下溶液（10 μL）：
回收DNA 4μL
Ligation Solution 5μL
pMD18T Vector 1μL
(2) 16oC反响30分钟，所得产品保管于－4oC冰箱备用。
4.3连接产品转化E.coli DH5α
(1) 将5 µL连接产品加入到100µLE.coli DH5α感受态细胞中，轻轻旋转离心管混匀内容物，冰上静置30 min；
(2) 42oC水浴热激转化90 sec，立即放回冰上，放置3 min；
(3) 每管加入500µL LB培养基（室温放置），37oC 160180 rpm 振荡培养4560 min，使菌体苏醒并表达抗性基因；
(4) 在含有Amp（100 µg/mL）的选择性平板上加入60100µL 菌液，用无菌涂布棒轻轻涂布均匀后，用Parafilm膜封好；
(5) 将培养皿正放，37oC约50 min，待液体全部吸收后，倒置平板继续培养1016 h。
4.4转化子的筛选及鉴定
(1) 用无菌枪头挑取LB平板上35个单菌落，辨别接种到3.5 mL LB液体培养基中（含100 µg/mL Amp），37oC，165rpm振荡培养1012 h；
(2) 用5µL菌液做模板，进行PCR鉴定（50 µL 体系），操纵步调同3。
阳性菌液由Invitrogen生物公司测序鉴定，余下的菌液4oC保管备用；
(3) 测序结果在Genbank数据库中进行比对阐发。