基因克隆步骤完整版

1总RNA提取

令狐采学

(1) 液氮研磨或冰上匀浆实验资料；先将1mlTrizol加到离心管中待用

(2) 将研磨好的样品加到离心管中混匀，室温放置5 min；掀开离心机预冷

(3) 加200 µL氯仿，振荡15 sec，室温放置3 min，分层；

(4) 4oC，12,000g，离心15 min；

(5) 取上清，加500 μL异丙醇，混匀，室温放置10 min；

(6) 4oC，12,000g，离心10 min；

(7) 弃上清，加1 mL75%乙醇，漂浮洗涤沉淀，振荡充分；再用100%乙醇清洗

(8) 4oC，7,500g，离心5 min；

(9) 弃上清，离心，用枪吸取过剩液体，放在超净台里干燥后，加50 μL DEPC水，－80oC保管。

此操纵中所用到的器皿均需经过DEPC灭活RNA酶处理。提取的总RNA需经RNA电泳检测质量，并用紫外分光光度计测定浓度。OD260值为核酸的吸收值，OD280值为卵白的吸收值，OD260/280值在1.82.0间一般说明该核酸卵白含量在允许的规模内，可正常使用；另外还有OD230值为多糖和酚类的吸收值，比较干净的核酸OD260/230值能达到2.2左右。RNA浓度计算公式：总RNA 浓度

（µg/mL）=A260×稀释倍数×40。

2反转录/cDNA第一链的合成

纯化RNA以去除基因组DNA，操纵按TaKaRa公司的PrimeScript RT reagent with gDNA Eraser(Perfect Real Time)说明书进行。其体系为：

Total RNA 1μg

5× gDNA Eraser Buffer 2μL

gDNA Eraser 1μL

RNase Free dH2O 补齐至10μL 条件为：42oC，2min；

RNA纯化后，即可进行反转录。其体系为：

5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time）4μL PrimeScript RT enzyme mix Ⅰ1μL

RT Primer Mix 1μL

上一步的反响液10μL

RNase Free dH2O 补齐至20μL 操纵条件为：

(1) 37oC放置15 min； (2) 85oC，5 sec； (3) 4oC保管。

3 PCR

按TaKaRa公司的Premix Taq Version 2.0操纵，，PCR反响体系如下：

Premix Taq 25μL

模板5μL

引物1 (10 μM)1μL

引物2 (10 μM)1μL

ddH2O 18μL PCR反响条件为：94°C预变性5min；94°C变性30s，53°C 退火30s，72°C延伸30s，循环36次；72°C延伸10min。

PCR反响完毕，取5μL反响产品进行1%琼脂糖凝胶电泳（若割胶回收则用10μL反响产品）。

4 基因克隆及测序

4.1 PCR产品切胶回收

将PCR产品用1%琼脂糖凝胶进行电泳，在紫外灯下观察并切下预期年夜小的DNA片段。使用TIANGEN公司的Universal DNA Purification Kit割胶回收试剂盒进行纯化，步调如下：

(1)平衡吸附柱：向吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中）加入500μL平衡液BL，13,400×g离心1 min，倒失落收集管中的废液，吸附柱CB2重新套回收集管中；

(2) 按100 mg agarose胶加入100μL溶液PC，置于50oC中10 min左右，中途混匀几次，至胶完全融化；

(3) 将样品倒入一个吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中），室温下13,400×g离心1 min，倒失落收集管中的废液，吸附柱CB2重新套回收集管中；

(4)向吸附柱CB2中加入600μL漂洗液PW（加乙醇），室温下13,400×g离心1 min，倒失落收集管中的废液，吸附柱CB2重新

套回收集管中；

(5) 重复上一步调；

(6) 将吸附柱CB2放入收集管中，室温下13,400×g离心2 min，尽量除去漂洗液，将吸附柱置于室温放置数分钟，完全晾干；

(7) 将柱子套入一新的灭菌1.5 mL离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50µL洗脱缓冲液，室温放置2分钟，13,400×g室温离心2 min，收集到的洗脱液即为回收的DNA纯化液；

(8) 取5µL的纯化液体进行1%琼脂糖凝胶电泳，以检查纯度，并丈量溶液中DNA含量。

4.2目的片段与载体连接

(1) 胶回收产品与T载体连接体系，参考Takara公司pMD18T 载体的试剂盒说明书。在灭菌的0.5 mL 离心管中配制如下溶液（10 μL）：

回收DNA 4μL

Ligation Solution 5μL

pMD18T Vector 1μL

(2) 16oC反响30分钟，所得产品保管于－4oC冰箱备用。

4.3连接产品转化E.coli DH5α

(1) 将5 µL连接产品加入到100µLE.coli DH5α感受态细胞中，轻轻旋转离心管混匀内容物，冰上静置30 min；

(2) 42oC水浴热激转化90 sec，立即放回冰上，放置3 min；

(3) 每管加入500µL LB培养基（室温放置），37oC 160180 rpm 振荡培养4560 min，使菌体苏醒并表达抗性基因；

(4) 在含有Amp（100 µg/mL）的选择性平板上加入60100µL 菌液，用无菌涂布棒轻轻涂布均匀后，用Parafilm膜封好；

(5) 将培养皿正放，37oC约50 min，待液体全部吸收后，倒置平板继续培养1016 h。

4.4转化子的筛选及鉴定

(1) 用无菌枪头挑取LB平板上35个单菌落，辨别接种到3.5 mL LB液体培养基中（含100 µg/mL Amp），37oC，165rpm振荡培养1012 h；

(2) 用5µL菌液做模板，进行PCR鉴定（50 µL 体系），操纵步调同3。阳性菌液由Invitrogen生物公司测序鉴定，余下的菌液4oC保管备用；

(3) 测序结果在Genbank数据库中进行比对阐发。