08@碘淀粉比色法

【原理】
血清中α淀粉酶催化淀粉分子中α-1，4 糖苷键水解，产生葡萄糖、麦芽糖及含有 α-1，6糖苷键支链的糊精。在底物过量的 条件下，反应后加入碘液与未被水解的淀 粉结合成蓝色复合物，其蓝色的深浅与未 经酶促反应的空白管比较，从而推算出淀 粉酶的活力单位。
【器材】 试管、微量加样器、恒温水浴箱、离心机、分
1个卡门氏单位的定义是：在温度25℃，pH7.4，波长 340nm，光径1cm的条件下，1ml血清使NADH的吸光度下 降0.001的转氨酶活性。可见卡门氏单位不是用物质的量浓 度，而是用物质的吸光度表示酶的活性单位的。
3、血清碱性磷酸酶的磷酸苯二钠法测定
碱性磷酸酶在碱性环境中作用于磷酸苯二 钠，使之水解释放出酚和磷酸。酚在碱性 溶液中与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾 氧化形成红色醌类化合物，根据红色的深 浅确定ALP活性。
单位定义 100ml血清中的淀粉酶，在37度15min水解淀粉5mg为1个单位。
【计算】
淀粉酶＝空白管吸光度－测定管吸光度/空白管吸光度 *0.4/5*15/7.5*100/0.02
如进行时间进程曲线其相应的时间应取不同的值。
1、比色法测乳酸脱氢酶
正向反应生成的丙酮酸与溶于酸的2，4二 硝基苯肼作用生成丙酮酸－二硝基苯腙， 后者在酸性环境中呈草黄色，在碱性溶液 中显棕红色，颜色的深浅与丙酮酸的浓度 成正比，与标准浓度的丙酮酸生成的苯腙 进行比色，可推算LDH的活力。
单位定义：以100ml血清，37度，作用底物 15min，产生1umol丙酮酸为一个金氏单位。
2、血清谷—丙转氨酶活性的测定（改良赖氏法）
血清中的谷-丙转氨酶（ALT），在37℃、pH7.4的条件 下，可催化基质（底物）液中的丙氨酸与α-酮戊二酸生成 谷氨酸和丙酮酸，丙酮酸可与起终止和显色作用的2,4二硝 基苯肼发生加成反应，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，进而 在碱性环境中生成红棕色的苯腙硝醌化合物，其颜色的深 浅在一定范围内与丙酮酸的生成量，亦即与ALT活性的高 低成正比关系。据此与同样处理的丙酮酸标准液相比较， 便可算出或通过标准曲线查出血清中ALT的活性。
吸光度应在0.4以上。 5，缓冲淀粉溶液若出现混浊或絮状物，表示缓冲淀粉溶液
受污染或变质，不能再用，应重新配制。 6，本法亦适用于其他体液淀粉的测定，尿液先作20倍稀释
后测定。
【评价】
本法线性范围＜400U，批内3.1-9.0%，批间 12.4-15.1%，与对-硝基苯麦牙庚糖苷法比较，在 酶活性低时相关性较好，但酶活性较高时相关性 差，因此，该法不能认为是淀粉酶测定的理想方 法，但由于该法简单，易行，不需特殊设备，试 剂价廉，仍然为我国目前应用较为广泛的方法。
血清淀粉酶=
×1000 尿液淀粉酶=
×2000
【正常参考范围】 血清：80～180u/L，尿液：100～1200u/L
【临床意义】
增高：淀粉酶主要由唾液腺和胰腺分泌。流行性腮腺炎， 特别是急性胰腺炎时，血和尿中的AMS(淀粉酶)显著
增高，急性胰腺炎发病后8-12小时血清AMS开始增高， 12-24小时达高峰，2-5天下降至正常。如超过500U有意 义，350达U时应怀疑此病。而尿AMS约于发病后12-24 小时开始升高，下降也比血清AMS慢，因此，在急性胰
1,酶活性在400U以下时，与底物的水解量成线性，如测定管 吸光度小于空白管吸光度一半时，应加大血清稀释倍数或 减少稀释血清加入量，测定结果乘以稀释倍数
2,草酸盐、枸椽酸盐、EDTA-NA2及氟化钠对AMY活性有抑 制作用，肝素无抑制作用。
3，唾液含有高浓度淀粉酶，须防止带入。 4，淀粉产品不同，其空白吸光度可有明显差异，一般空白
光光度计等
[操作]取2支试管，按表进行淀粉酶操作
加入物(ul)
血清
尿液
试 剂 ul 标本(血 清或尿液)
测定管 空白管 测定管 空白管 （u） （B） （u） （B）
20ul
—
20ul
—
淀粉酶缓冲液
500ul 500ul 1000ul 1000ul
充分混匀后， 置与37℃水浴箱中，保温7.5min
显色终止液ml
【操作】
1.血清先用生理盐水作10倍稀释。0.1ml血清＋0.9ml蒸馏水。
加入物(ml)
测定管
对照管
缓wk.baidu.com淀粉溶液
(37度预温5min)
1.0
1.0
血清
－
0.2
37度水浴7.5min
碘应用液
1.0
1.0
蒸馏水
6.2
6.0
2.混匀，以波长660nm，蒸馏水调零，读取各管吸光度。
腺炎后期测定尿AMS更有价值。如急性阑尾炎、肠梗阻、
胰腺癌、胆石症、溃疡病穿孔及吗啡注射后等均可见血 清AMY增高，但常低于500U。
降低：由于正常人血清中AMS主要由肝产生，故血清与 尿中AMS同时减低主要见于肝炎、肝硬化、肝癌及急性 和慢性胆囊炎等。肾功能障碍时，血清AMS也可降低。
【注意事项】
实验 血清淀粉酶测定 碘淀粉比色
[目的] 了解临床测定血清淀粉酶的意义。 掌握本法测定血清淀粉酶的基本原理和方法。
临床生化淀粉酶测定
淀粉酶又称α－1，4葡聚糖水解酶，作用于多糖分子中的 1，4糖苷键，生成麦芽糖和葡萄糖。可由肾脏排泄，淀粉酶 在人体内的分布很广，但主要存在于胰腺，唾液腺及其分泌 液中，对食物中多糖化合物的消化起重要作用。血清淀粉酶 主要有两种同工酶，即同工酶P（来源于胰腺），及同工酶S （来源于唾液腺及其它组织）。血清淀粉酶增高对急性胰腺 炎有诊断价值。多年来，由于它的测定方法简单，快速，一 直被用于胰腺炎的诊断和急腹症的鉴别诊断，但其总酶活力 测定缺乏灵敏性和特异性，而其同工酶分析则有助于克服这 些缺点。淀粉酶活性测定方法大致分为粘度测量法、比浊法、 碘量法、糖化法和染料释放法5种，其中碘淀粉比色法操作简 便，结果可靠在临床上得到广泛的应用。
3.0
3.0
5.0
5.0
测血清AMS时，向空白管补加20ul血清（目的是使其颜色与测
定管相近）
再充分混匀后，波长630nm ，以蒸馏水调零。
试剂空白管溶液作拟标准液定标，测定 标准和测定管溶液的吸光度值，按公式计 算测定结果。 【计算公式】
血清淀粉酶＝空白管吸光度－测定管吸 光度/空白管吸光度 ×1000