总磺胺类快速检测试剂盒说明书(2011-5修改版)

总磺胺类药物（Total Sulfonamides）快速检测试剂盒

1.简介

本试剂盒是利用竞争酶联免疫分析的方法对牛奶、肉类和蜂蜜、血液、尿液中的总磺胺类药物进行定量分析。试剂盒中包括所有酶联免疫分析试剂。本试剂盒有96个实验孔（包括标准孔）。如果进行定量分析，必须有酶标仪。

检测下限：牛奶：2ppb

肉类：1ppb

蜂蜜：1ppb

检测时间：约1.5小时

样品前处理时间：肉类：约2小时

蜂蜜：约1.5小时

本试剂盒与各种磺胺类药物的交叉反应率：

磺胺氯哒嗪＞300%

磺胺多辛＞300%

磺胺甲氧哒嗪＞300%

磺胺甲基硫代二嗪＞300%

磺胺噻唑＞300%

磺胺氯吡嗪钠200%

磺胺甲恶唑120%

磺胺间甲氧嘧啶100%

磺胺喹恶啉100%

磺胺吡啶90%

磺胺对甲氧嘧啶85%

磺胺甲基嘧啶80%

磺胺间二甲氧基嘧啶40%

磺胺嘧啶20%

磺胺二甲嘧啶20%

磺胺林10%

磺胺-4‘5’-二甲基异噁唑9%

磺胺-3‘4’-二甲基异噁唑7%

磺胺苯吡唑4%

磺胺醋酰3%

磺胺胍2%

氨苯磺胺0.1%

磺胺苯甲酰胺0.05%

2.原理

本试剂盒的测定基础是抗原抗体的免疫反应。微孔板包被有抗磺胺类药物的抗体。加入磺胺类药物的标准品或样品溶液，酶标记磺胺类药物抗原。加入的磺胺类药物标准品与酶标记磺胺类药物抗原同时竞争包被板上的抗体结合位点。温育一段时间后，洗涤、拍干。加入显色液温育，最后加入终止液后颜色由蓝色转变为黄色，测定O.D.450nm值。O.D.450nm值与样品中的磺胺类药物的浓度成反比。

3.试剂盒组成：

1．）96孔酶标板（包被有抗体）96孔1块2．）磺胺类药物标准品(1ml/瓶) 溶液

7瓶（A:0、B: 1、C: 3、D: 10、E: 30、F: 100 ng/ml）3．）酶标记抗原 6 ml 溶液1瓶4．）显色底物A液7 ml 溶液1瓶5．）显色底物B 液7 ml 溶液1瓶6．）3×浓缩提取液50 ml 溶液1瓶7．）10×浓缩洗涤液30 ml 溶液1瓶8．）终止液：2M硫酸7 ml 溶液1瓶4．需要的仪器、试剂

4.1仪器

——酶标仪450nm

——离心机

——均质器

——氮气吹干仪

——微量移液器20μl～200μl，100μl～1000μl

——刻度移液管

——天平：感量0.01g

4.2试剂

——正己烷

——乙腈

——乙酸乙酯

——甲醇

——Carrez I：0.36M氰亚铁酸钾

——Carrez II：1.04M ZnSO4·7H2O 5．样品处理

样品应冷藏保存且避光

5.1牛奶样品的预处理方法

1）取5mL牛奶样品到离心管中，每管加入250μL CarrezⅠ及250μL CarrezⅡ彻底混合（旋涡振荡2分钟），4—12℃ 2500g离心10分钟。

2）转移出2.2mL上层液（相当于2mL奶样）至一个新离心管中。用稀释好的提取液以1：4稀释（1份上层液＋3份稀释的提取液）。

3）取50μL进行分析。

稀释倍数：4

5.2肉类及水产品（鱼、虾）样品处理方法

1) 用均质器均质一定量的样品（100g）。

2) 称1g均质过的样品，加入3mL乙腈-水溶液（84:16）中，涡旋振荡5分钟。

3)室温（20—25℃）2500g离心10分钟。

4) 移取1.5mL上清液（相当于0.5g样品）至另一个新试管中，60℃下氮气吹干。残留物用1mL稀释好的提取液复溶，涡旋振荡1分钟。再加入1ml正己烷，涡旋振荡1分钟。

5) 室温（20—25℃）2500g离心10分钟。取50μL下层水相进行分析。

稀释倍数：2

5.3蜂蜜样品处理方法

1）称取蜂蜜样品1±0.05g，置于离心管中，加入0.5mL 1M HCl，37℃温育半小时。

2）加入0.5mL 1M NaOH，混合均匀。再加入0.5mL 0.2M 磷酸盐缓冲液振荡均匀。

3）加入1mL 乙腈，再加入3mL乙酸乙酯，振荡均匀。

4）2500g离心15分钟，取上层2mL有机相，60℃氮气吹干。

5）加入1mL提取液复溶。取50μL用于分析。

稀释倍数：2

5.4鸡蛋的预处理过程如下：

1）称1g均质过的样品，加入2mL甲醇中，涡旋振荡2分钟。

2）室温（20—25℃）2500g离心10分钟。

3）移取1mL上层的甲醇（相当于0.5g样品）至另一个新试管中，60℃下氮气吹干。用1mL提取液溶解干燥的残留物。涡旋振荡1分钟。加入1mL正己烷，涡旋振荡1分钟。

4）室温（20—25℃）2500g离心10分钟。取50μL下层水相进行分析。

稀释倍数：2

6.酶联免疫分析程序

6.1测定之前注意事项

1. 使用前将所有试剂平衡至室温(20-25℃)。

2. 使用之后迅速将试剂放入2-8℃冷藏。

3. 在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA测定程序中的要点。

4. 所有孵育过程应避免阳光直射，并按要求用盖板覆盖住酶标板。

6.2洗涤液配制

将浓缩洗涤液用去离子水稀释10倍后使用(1份浓缩洗涤液加9份去离子水)。

6.3测定程序

1. 将足够标准和样品所用数量的孔条插入酶标板架，记录下标准和样品的位置。没有使用的酶标板

用铝箔袋封好置2-8℃冷藏保存。

2. 将50μl标准品、样品加入相应的微孔中。每孔

中加入50μl酶标记抗原。轻摇、振荡充分混匀，37℃条件下温育1小时。

3. 倾去微孔中反应液，用洗涤液洗涤五次（每次150μl /孔），每次洗涤都须甩尽微孔中的水珠，并将

洗净的微孔板在吸水纸上拍干。

4. 将显色底物液A和B按1:1（体积比）混匀（临

用前新配）。分别向每个微孔中加入100μl显色底物

溶液，37℃避光温育15分钟。室温如果过低，可

适当延长显色时间2-5分钟。

5. 向每个微孔中加入50μl 2M H2SO4终止反应，轻

摇混匀确保蓝色完全转变为黄色。

6. 在酶标仪上（波长450nm）测定光密度OD值。

7.结果计算：

所获得标准品或样品的吸光度值的平均值（B）除以第一个标准（0标准）吸光度值的平均值（B0）再乘以100。因此0标准等于100%，并且以百分比给出吸光度值。

根据每一个标准品B/B0的值做出一条拟合曲线，相对应每一个样品的浓度就可从拟合直线上读出。8.标准曲线

9.试剂盒的质量指标

1.本试剂盒的灵敏度为0.2μg/kg(0.2ppb)。

2. 精密度：批内变异系数<15%（n=10），批间变异

系数<20%(n=10)。

3.准确性：样品回收率在60%~120%之间。