精子冷冻贮存
实验室常用猪精液的低温保存方法
实验室常用猪精液的低温保存方法【摘要】实验室常用猪精液的低温保存方法对于保障猪种质资源的保存和利用至关重要。
本文首先介绍了猪精液的重要性及保存方法的必要性。
在正文部分分别详细介绍了液氮、干冰和冷冻等常见的低温保存方法，包括保存步骤和注意事项。
还总结了低温保存猪精液的优点，如有效延长精液的保存时间和保持精液的生物活性等。
结论部分强调了猪精液低温保存方法的重要性，指出其对猪种质资源的长期保存和利用具有不可替代的作用。
同时展望了未来研究方向，希望通过技术创新和方法改进，进一步提高猪精液保存的效率和质量，为猪业发展提供更好的支持。
【关键词】实验室猪精液、低温保存方法、液氮保存、干冰保存、冷冻保存、注意事项、优点、重要性、发展方向。
1. 引言1.1 介绍实验室常用猪精液的重要性及保存方法在现代猪生产实验室中，猪精液是一种非常重要的生物材料，它包含着猪的遗传信息，可以通过人工授精的方式传递至下一代猪种。
有效地保存猪精液对于提高猪种质量和数量是至关重要的。
在实验室中，常见的猪精液保存方法有液氮保存、干冰保存和冷冻保存等。
这些方法能够有效延长猪精液的保存时间，保持其质量和活力。
液氮保存猪精液的步骤包括快速冷冻、贮存在液氮罐中等；干冰保存则需将猪精液置于干冰盒中，快速冷冻保存；冷冻保存则需将猪精液置于冷冻离心管中，通过冷冻保存。
在进行低温保存猪精液时，需注意避免冷冻过程中产生的结晶破坏猪精液细胞膜的情况，以及避免冷冻过程中的温度变化对猪精液造成的不利影响。
通过低温保存猪精液能够有效延长其保存时间，保持其质量和活力，为猪生产实验室的科研工作提供了重要支持。
未来，随着科技的发展，猪精液保存技术也将不断提升，为猪生产和繁育工作带来更多便利和效益。
2. 正文2.1 常见的猪精液低温保存方法常见的猪精液低温保存方法主要包括液氮保存、干冰保存和冷冻保存三种方式。
液氮保存是目前应用较广泛的方法，通过将猪精液置于液氮罐中进行保存，可以长期保持其生物活性。
山羊精液冷冻保存技术及保存效果影
livestock science | 畜禽养殖科学34 ·2022.110 引言山羊精液冷冻保存技术是指利用液氮或干冰使山羊精液在超低温环境下进行冷冻处理，冷冻保存的山羊精液中的精子生理活动处于停滞状态。
在发情母羊需配种时，可将冷冻保存的精子进行解冻，从而使精子恢复正常活力，保证发情母羊能正常受孕。
山羊精液冷冻保存过程主要分为精液采集、质量检查、冷冻、解冻等流程。
该技术可提高优良种公羊的种用价值，降低生产成本。
20世纪80年代，我国开始对山羊精液冷冻保存技术进行研究。
由于山羊精子对低温环境较为敏感，抗寒能力差，低温处理后的精子其结构完整性被破坏，精子活力下降。
解冻后的精子活率低，受胎率差。
除低温环境外，山羊精液冷冻保存效果也受稀释剂、抗氧化剂等影响。
1 精液冷冻保存技术山羊精液在冷冻保存前需对精液进行采集。
采集后的山羊精液需通过对气味颜色等进行判别，从而确定其是否达到冷冻保存标准。
对达到冷冻保存标准的山羊精液，可进行下一步冷冻保存处理，对于不适合的精液则需淘汰。
1.1 安装假阴道选择长约30 cm 、内径5 cm 左右的胶皮水管作为假阴道的外壳，外壳中部需保留直径适宜的小孔作为后期气门的安装部位及注水使用。
假阴道外壳内胎通常选用厚约1 mm 的胶皮，安装时可先将内胎放入外壳内，内胎开口端应翻套于外壳，并用绳子进行绑定。
内胎另一端则为集精杯的安装端。
同时使用45 ℃的热水注入假阴道内，最后装上气阀，吹气使内胎膨胀突出。
在假阴道的开口端需涂抹凡士林起到润滑作用。
安装完成后将手指伸入感觉温暖、润滑、有压力即可。
1.2 精液采集采精时，采精人员位于右后侧。
当公羊爬跨时，需作者简介：李振龙（1985-），男，汉族，江苏苏州人，大学本科，兽医师，主要从事动物疫病防控工作。
山羊精液冷冻保存技术及保存效果影响因素李振龙（江苏省苏州市吴中区横泾动物防疫站，江苏 苏州 215103）摘要：随着我国低温和生殖生物学的高速发展，人工授精技术被广泛应用。
实验十五精液的冷冻保存
实验十五精液的冷冻保存一.实验特点实验类型：综合型实验实验类别：专业基础课计划学时：2学时每组人数：3～4人二、实验目的要求精子具有受温度变化直接影响本身活动力和代谢能力力的生物学特性。
利用这一特性，将精液特殊处理后，保存在超低温下，精子代谢活动完全受到抑制，停止能量消耗，处于生命静止状态，长期保存下来。
一旦升温精子又能复苏并维持其原来的受精能力。
要求同学们了解精液冷冻保存的技术操作过程和精液冷冻保存原理，初步学会冷冻保存方法。
三．实验原理冰晶化是水在降温过程中的一定温度下，水分子重新按几何图形排列形成冰晶。
冰晶可造成精细胞（精子）内外的溶质浓度和渗透压增高，引起细胞内脱水、原生质变干、酸碱失去平衡、细胞膜和顶体以及整个组织和结构破坏等致死性伤害，最后导致精子发生不可逆的变化而死亡。
一般精液内含85%～95%的水分，精子内也含有及少量的水分，这些水分在降温过程中在-0.6～-60℃温度区内缓慢降温能形成冰晶。
降温速率越慢，所形成的冰晶越大，其中特别以-15～-25℃时冰晶形成最多。
在冷冻精液过程中只有避开这个有害温度区，才能得以长期保存。
快速升降温度的办法，难以达到完全玻璃化冻结条件。
为此，在制作冷冻精液的稀释液内，要加入一定量的甘油等抗冻害物质。
甘油具有极强的亲水性，可限制水分子形成冰晶而处于过冷状态，降低水形成冰晶的温度，即缩小精子的有害温度的上限。
此外甘油容易渗透精子内，可降低渗透压改变的不良影响及营养作用等，增强精子的抗冻害能力和无冻害生存环境。
精液在冷冻过程中不可避免地要形成冰晶，精子能否生存的关键在于冰晶的大小，冰晶越大对精液伤害越大，反之冰晶越小，伤害越小甚至无损伤。
因此，只要避免大冰晶形成，并使精子稳定在微晶的状态下，一旦升温精子又能复苏并维持其原来的受精能力。
四．实验材料和仪器精液、2.9%的柠檬酸钠溶液、50～100ml烧杯、滴管、10 ml试管、低温温度计、20～80目纱网、漏勺、灭菌纱布袋、液氮罐、液氮、载玻片、盖玻片、显微镜、保温箱。
精子保存操作规程
精子保存操作规程
《精子保存操作规程》
一、目的
为了确保精子保存工作的顺利进行，保证精子质量，制定本规程。
二、适用范围
本规程适用于所有精子保存工作。
三、工作流程
1. 取样：精子保存前，需先进行取样，确保精子的质量和数量。
2. 加工：将取样得到的精子进行加工处理，包括冷冻、保存、标注等操作。
3. 存储：存储精子时，需保证存储环境的稳定和温度的恒定。
4. 管理：对存储精子的信息进行记录和管理，确保精子的跟踪和管理。
5. 检测：定期对存储的精子进行检测，保证其质量。
四、责任分工
1. 取样负责人：负责取样工作，确保取得高质量的精子样本。
2. 加工负责人：负责精子加工处理工作，确保精子的存储质量。
3. 存储负责人：负责存储环境的维护和管理，保证其稳定性。
4. 管理负责人：负责精子信息的记录和管理，确保其跟踪和管理。
5. 检测负责人：负责定期检测存储的精子样本，确保其质量。
五、注意事项
1. 对精子的取样、加工、存储等操作均需在无菌条件下进行，避免外界污染。
2. 存储精子时，需保证存储温度的稳定，避免因温度变化而影响精子质量。
3. 对存储的精子信息需进行详细记录，包括取样时间、处理方法、存储温度等。
4. 如发现存储的精子质量出现异常，需要及时通知相关负责人进行处理。
六、附则
本规程自发布之日起生效，如有需要修改，需经过相关负责人和主管部门的审批。
以上为《精子保存操作规程》，希望所有工作人员能严格按照规程进行操作，确保精子保存工作的顺利进行。
猪精液冷冻保存技术的影响因素及损伤机理
108猪业科学 SWINE INDUSTRY SCIENCE 2019年36卷第10期遗传改良GENETIC IMPROVEMENT 北京顺鑫农业小店种猪分公司协办猪精液冷冻保存技术的影响因素及损伤机理谷圣臣，张兆博，郑丽云，周琳琳，王 双，魏国生，李井春*（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江 大庆 163319）摘 要：猪人工授精技术极大的促进了养猪业的发展，既降低了公猪的饲养数量和引种成本，又方便了对精液品质进行监管。
生产中最常用到的是鲜精，其具有精子活率高，顶体完整性好等优点，但存在保存时间短，运输过程中损伤大等不足。
猪精液冷冻保存技术的出现可以极大的改善上述存在的问题，其具有保存时间长，生产成本低等优点。
文章通过分析影响猪精液冷冻保存的重要因素，探讨冷冻保存过程中猪精液的损伤机理，旨在为猪精液冷冻技术的进一步发展提供科学参考。
关键词：猪精液；冷冻保存；影响因素；损伤机理猪精液冷冻保存是指通过干冰、液氮、液氦等制冷剂的降温作用，将采集到的新鲜精液进行离心、稀释、降温平衡、分装等工序，冷冻保存于超低温环境中，当温度升高后，又可恢复其生理活性，使其具有受精功能的一个过程[1]。
猪精液的冷冻保存不仅提高了优良种公猪的利用率，而且对于我国的一些优秀地方品种遗传资源的保护具有重大意义[2]。
但由于人们对猪精液的冷冻-解冻机理和损伤机理等尚未完全掌握，在一定程度上限制了猪精液冷冻保存技术的发展。
1 猪精液冷冻保存的影响因素1.1 稀释液精子细胞在冷冻的过程中，仅仅依靠精凊的自身保护作用是不够的，还需要向精液中添加稀释液，从而能更好地保护精子，减少低温打击对精子活率、顶体完整性等所造成的不利影响。
稀释液的主要成分有：糖类、蛋白质及脂蛋白、冷冻保护剂、抗氧化剂、缓冲液、其他添加剂等。
1）糖类包括葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、海藻糖等，经基金项目：黑龙江省大学生创新创业训练计划项目（201810223049）；黑龙江省自然科学基金面上项目（C2017053）；黑龙江省农垦总局科研计划项目（HNK135-04-06）；黑龙江八一农垦大学博士启动基金（XYB-2016-04）；黑龙江八一农垦大学创新人才项目（CXRC2017004）作者简介：谷圣臣（1997—），男，本科生，邮箱：gsc151********@ *通信作者：李井春（1979—），男，副教授，博士，研究方向为动物繁殖生物技术， 邮箱：ljchun112@.研究表明，海藻糖能降低精子外周渗透压，减少精子向外流失水分，从而提高精液冷冻保存的效果[3]。
精液冷冻技术
Wolley等人的研究显示，超微结构的变化是发 生在融化期间或融化之后
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精液冷冻的原理（四）
三、精液冷冻的基本原理
冷冻损伤是肯定的 在两种损伤之间寻找平衡点，即最佳的降温速率 使两种损伤的总和达到最小，得到最大的冷冻生存率 实现起来非常困难 冷冻保护剂的出现是一大突破
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5.6
8.0
754
338
6.4
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影响精液冷冻质量的因素
关键因素：冷冻程序、冷冻保护剂 其他因素：
禁欲时间：３-５天 精液取出至冷冻时间：１小时之内 冷冻保护剂的添加方式：室温，缓慢添加 复温方式与时间：３７ ℃水浴１０分钟 精液分析的标准化
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精液冷冻技术的新进展 ---玻璃化冷冻（一）
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冷冻保护剂的种类与配制（二）
二、甘油-卵黄-枸橼酸钠型冷冻保护剂的配制
冷冻保护剂配方(总量=20ml)
CPM：SEMEN 甘油(ml) 卵黄(ml) 枸椽酸钠(mg) 葡萄糖(mg) 纯水(ml)
1：1
2.8
4.0 377
169
13.2
1：2
4.2
6.0 565
250
9.8
1：3
研究方向： 寻找容易实现玻璃化且对精子损伤小的保护剂
设法提高冷却速率
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玻璃化：液体转变为非晶态（玻璃态）的固化过程 优点：快速冷冻，不形成冰晶 实现玻璃化的途径：极大提高冷却速率、增加溶液浓度 技术上的难点：
很难达到实现玻璃化的高冷却速率 添加高浓度冷冻保护剂可降低玻璃化所需的冷却速率， 伴随对精子损害的增加
实验室常用猪精液的低温保存方法
实验室常用猪精液的低温保存方法1. 引言1.1 猪精液的重要性猪精液作为实验室常用的生物样本，在生物研究领域具有非常重要的作用。
猪精液中含有丰富的生物活性成分，包括蛋白质、酶类、激素等，这些成分对于研究猪的生殖生理、繁殖特性、遗传传递等方面具有重要意义。
通过对猪精液的分析和研究，可以帮助科研人员更好地了解猪的生殖机制，指导猪的繁殖管理，提高猪的生产性能和遗传质量。
猪精液还是一种重要的生物材料，用于人工授精、胚胎移植、繁殖技术等方面。
通过对猪精液的保存和利用，可以推动猪繁殖技术的发展，促进畜禽生产的提高。
研究者需要深入了解如何有效保存猪精液，并确保其质量和活力，以满足实验室和生产的需求。
在接下来的内容中，我们将介绍实验室常用的猪精液低温保存方法，以及保存过程中需要注意的关键问题。
【字数：238】1.2 低温保存的必要性低温保存可以有效延长猪精液的保存时间。
猪精液中的活性成分和细胞在常温下容易受到氧化和降解的影响，导致其活力下降甚至失活。
而通过低温保存，可以有效减缓这种氧化和降解的速度，延长猪精液的有效保存时间，保证其在长期保存过程中的质量和活力。
低温保存可以有效降低猪精液的代谢速率。
在低温环境下，细胞和活性成分的代谢速率会显著降低，从而减少其对营养和氧气的需求，延缓细胞死亡和活性成分降解的过程，有利于猪精液的长期保存和使用。
低温保存对于猪精液的保存质量和有效性具有至关重要的作用，是实验室中必不可少的保存方法之一。
对于实验室常用猪精液来说，低温保存不仅可以保证其质量和活力，还可以有效延长其保存时间，为实验研究和生产提供可靠的生物样本支持。
1.3 实验室常用猪精液的意义实验室常用猪精液的意义在于为研究和生产提供了重要的资源。
猪精液中含有丰富的遗传信息，通过对其进行分析和研究，可以帮助科研人员了解猪的遗传特性、生殖生理等方面的知识。
猪精液也是生猪人工授精和繁殖的重要材料，对于提高猪的遗传育种水平具有重要意义。
一种冷冻保存动物精子的方法[发明专利]
![一种冷冻保存动物精子的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/3aa1bdeea0c7aa00b52acfc789eb172dec639951.png)
专利名称：一种冷冻保存动物精子的方法
专利类型：发明专利
发明人：许红喜,卫喜明,宋伟红,甘文平,孙晓玉,张洪涛,韩志强
申请号：CN201910992558.5
申请日：20160629
公开号：CN110742058B
公开日：
20220201
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种冷冻保存动物精子的方法，包括以下步骤：（1）将采集到的动物精液放入保温瓶内，温度保持在20‑35℃；（2）用动物精子稀释液按精子数300‑1000万/mL稀释，灌装并封口，得到细管精液；（3）以0.1‑0.5℃/min的速度降温至0‑4℃；（4）静置1h‑2h；（5）将细管精液放在液氮上方，距离液氮面高度1.0cm‑2.0cm，温度为零下100℃‑120℃，熏蒸5min‑15min，直接投到液氮里，得到细管冻精，在液氮里把细管冻精装到纱布袋里备用。
本发明解决了传统方法在保存动物精子时，观察视野不清晰、易污染、存活时间短和不规范使用抗生素以致超级细菌产生的问题。
申请人：许红喜
地址：150000 黑龙江省哈尔滨市木材东街瑞城小区A6栋1单元205室
国籍：CN
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超低温冷冻技术应用于鱼精子保存的研究进展
超低温冷冻技术应用于鱼精子保存的研究进展超低温冷冻技术是一种将细胞或组织冷冻保存，并在需要时重新恢复其功能的技术。
随着人们对海洋资源的逐渐开发利用，对于鱼类精子保存的需求也日益增加。
鱼类精子是一种重要的遗传资源，能够广泛应用于种质资源保存、育种以及人工繁殖等领域。
研究如何高效保存鱼类精子具有重要的理论和实际意义。
本文将对超低温冷冻技术在鱼精子保存方面的研究进展进行综述。
超低温冷冻技术是目前保存鱼精子最常用的方法之一。
该技术可以将鱼精子的新陈代谢减缓到极低的水平，从而实现鱼精子的长期保存。
超低温冷冻技术的关键在于使用低温介质将鱼精子迅速冷冻至极低温度，并采用适当的保护剂保护鱼精子的完整性与生活力。
目前，业界广泛使用的保存鱼精子的超低温冷冻介质是液氮。
液氮的温度非常低，可以迅速冷冻鱼精子。
添加适当的保护剂，如甘油、DMSO等，可以保护鱼精子的细胞膜完整性和功能。
通过这种方法保存的鱼精子可以在液氮中保存多年，且在需要时可以快速恢复其活力。
超低温冷冻技术在鱼精子保存中还存在一些技术难题。
超低温冷冻过程中鱼精子的冻结速率对保存效果有着重要影响。
过快的冻结速率会导致鱼精子内部的水结晶过程太快，从而导致细胞膜破裂。
而过慢的冻结速率则会导致冰晶生长过程中会损伤鱼精子细胞内部结构。
超低温冷冻过程中鱼精子的解冻过程也会对保存效果产生影响。
解冻过程中，如果温度变化过快或者压力变化过大，都会导致鱼精子细胞膜破裂，从而降低保存效果。
超低温冷冻对鱼精子活力的影响也是一个难题。
超低温冷冻过程中，尽管可以将鱼精子的新陈代谢减缓，但仍然会对鱼精子的细胞膜、染色体和线粒体等结构产生一定的损伤。
为了解决以上问题，国内外学者进行了大量的研究。
他们从不同角度出发，寻找冻结和解冻过程中的适宜条件，并尝试使用不同的保护剂和技术手段来提高鱼精子保存效果。
一些研究表明，在冻结过程中适当增加冷冻杂质的浓度可以提高鱼精子的保存效果。
添加某些保护剂如氨基酸、抗氧化剂等，可以减轻冻结解冻过程对鱼精子的损伤。
人类精子的保存方法
人类精子的保存方法
人类精子的保存方法有多种，其中包括以下几种常见的方法：
1. 冷冻保存：将精子收集后，经过处理和添加冷冻保护剂，然后进行冷冻保存。
一般保存温度为-196的液氮罐内，可以长期保存数十年甚至更久。
这种保存方法通常用于人工授精、体外受精等辅助生殖技术。
2. 冻干保存：将精子经过特殊处理，在低温下进行冻干，然后保存在低温环境下。
这种保存方法适用于需要长时间保存或运输的情况，可以在需要时重新激活精子。
3. 胚胎保存：对于辅助生殖技术中所需的受精卵，也可以先受精后培养发育成胚胎，然后进行低温保存。
一般保存温度为-196的液氮罐内，可以在需要时解冻并使用。
无论采用哪种保存方法，都需要严格控制温度和环境条件，以保证精子的保存质量。
此外，还应该遵守相关法律法规，进行合法保存和使用。
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精子冷冻贮存6.1 引言精子冷冻保存是男科实验室工作中的一个重要组成部分，特别对不孕不育门诊的男科实验室来说。
从19世纪40年代末起，人类就开始研究精子低温生物学。
发现甘油能保护精子免受冷冻损伤，可以将人类精子冷藏在–79℃的干冰上(Polge et al., 1949; Bunge &herman, 1953; Bunge et al., 1954)。
随着液氮广泛应用，人类精子冷冻贮存技术取得快速发展，在许多国家建立起商业用途的精子库和国际间合作服务项目(Perloff et al., 1964; David et al., 1980; Clarke et al., 1997; Leibo et al., 2002)。
由于采用不同的冷冻保护剂和不同冷冻程序，出现许多冷冻贮存实验设计方案。
冻融后细胞存活率主要取决于细胞内冰晶形成量能降低至何种程度，通过选择恰当的冷冻保护剂和采用最适冷冻速率和复融速率来减少细胞内水形成冰晶提高细胞的存活率(Sherman, 1990; Keel & Webster, 1993; Watson, 1995)。
特别在复融过程中，当精子处于–130℃（玻璃化转化状态的关键温度）以上时间太长，细胞内有害的冰晶增多发生重结晶。
人类精子能够耐受一定范围内的冷冻和复融率。
它们对快速冷冻（冷体克）产生损伤不敏感，主要原因可能是精子细胞膜中脂质双分子层结构的不饱和脂肪酸增加细胞膜流动性。
而且因为细胞内水分含量少（约为50%），精子比其它细胞更能耐受低温导致损伤。
但是低温仍对精子功能仍产生不良影响，特别是对精子活力影响比较大。
一般而言，只有大约50%的活动精子能在冻存后复苏保持活力(Keel & Webster, 1993)。
优化精子冷冻保存方法减低对活动精子的损害从而提高妊娠率(Woodset al., 2004)。
影响供精人工授精的妊娠率的因素包括复融后精子质量、人工授精的时机，而最为关键的是受方因素如年龄，前次供精妊娠情况以及与排卵、子宫输卵管相关疾病(Le Lannou & Lansac, 1993)。
如果精子保存方法合适，精子质量不会随着冻存时间的延长而下降。
冷冻保存超过28年的精子仍能使妇女受孕分娩婴儿(Clarke et al., 2006; Feldschuh et al., 2005)。
精子冷冻可适用于很多情况（见表6.1），在某些特殊情况下，冻存过程需要进行一些更改（见章节6.2.2）。
框6.1 精子冷冻保存的适应症供精供精是对具有生育能力的供精者精液进行冷冻保存以便将来使用。
供精者可由精子库或诊所进行招募，他们精子可以匿名使用。
在某些替代的情况，受者也可了解供者的基本情况。
供精可以用于AI、IUI、IVF、或者ICSI。
1．没有活精子或者不适合ICSI使用长头精子不育男性患者的伴侣，或冶疗失败，冶疗费用太高。
2．能传给下一代的遗传疾病。
3．血型不符导致婴儿溶血性贫血。
4．复发性流产，供精能提供成功妊娠。
5．想怀孕的单身育龄女性。
供精受孕需要严格遵守当地和国家关于遗传和传染病筛查的法律法规。
生育力保护男性在进行有可能影响生育能力的活动之前，可以通过精液冷冻保存生殖能力。
具体如下：1．输精管切除（考虑到将来存在婚姻状态改变可能性或想再要一个孩子）。
2．接受有可能永久损害生精功能的细胞毒性药物或者放射治疗。
3．从事危险职业的工作如军队，在允许遗腹子出生的国家。
不孕症治疗在以下情况下，可以进行精子冷冻以备AIH、IUI、IVF、或者ICSI治疗：1. 严重少精子症或者精液中活动精子间断出现。
2．不育症的治疗效果不能持久，如生殖管道堵塞手术再通或者是下丘脑垂体性腺发育不良的促性腺激素治疗。
3．通过辅助方法收集到的精液，如脊髓受损的病人辅助射精，逆行射精病人尿液中收集精子，或者通过手术方式从生精管道中收集精子。
4．在辅助生育治疗过程在取卵日或者AIH日不能留取新鲜的精液。
阻断传染性疾病的传播经抗逆转录病毒治疗的HIV感染患者，没有检出病毒的精液可以冷冻保存，这些精子可用于IUI，IVF，或者ICSI，这样就能够避免妻子在受孕过程中受HIV感染危险。
注1：在保存生育力或者不育症治疗中的精子冷冻，尽可能保存够10次或以上人工受精使用的精子量，这样才能够提高妊娠成功率。
而异常精液为AIH而冻存多份精液并不见得很有用。
注2：在ICSI过程中1个精子就足够让1个卵子受精，所有的活动精子都值得冻存。
注3：在进行有可能造成不育的治疗前，冻存精液有很大的心理意义，因为这样能够让病人对未来充满希望。
病人在接受细胞毒性药物治疗或者放射治疗的之前，应该把精液冻起来，因为这些治疗过程都对精子有害。
所有需要进行放化疗的病人都应尽可能的保存精子。
人类精子冷冻和贮存是一个很复杂的过程，实验室工作人员不仅需要有高度的责任感，而且需要对综合风险进行评估。
框6.2 冻存和贮存人类精子的风险评估在评估人类精子冷冻和贮存过程中危险因素时，应该充分考虑下列内容。
材料1．为了保证冷冻的精子不会被偷盗或者受火灾损害，需实施关于容器、样本、冷冻室的物理安全，同时也要保证液氮的供应。
2．选择合适的器械。
3．液氮存储和转移系统。
人员安全和保护措施1．个人防护用具。
2．检测液氮量不足的警报系统和低氧环境的警报系统。
交叉感染的风险为了减少贮存样本间通过贮存容器交叉感染传染性微生物（如HIV、乙肝、丙肝病毒），需考虑下列几个方面：1．存储器的类型：小瓶或麦管和封口方法。
2．存储介质：液氮或者液氮蒸汽。
3．对高危险的样本（已知感染病毒或怀疑感染病毒样本）使用的存储方法和程序。
冷冻样本的安全：1．为了防止样本全部丢失，把样本分开放在不同的地方。
2．在每一个处理步骤中都进行双人核对。
3．使用明显的标记和识别条码。
对存贮的样品和材料进行定期核查。
注1：用液氮蒸汽取代液氮进行样本保存时能够减少交叉感染的风险。
然而，不同的样本形态和位置可能引起温度梯度。
在个别情况有可能达不到–100 ℃以下(Tomlinson, 2005)。
所以当使用液氮蒸汽来保存样本时，必须确保温度低于–130 °C，尽量避免温度对细胞的损害。
注2：液氮存储中，使用隔热树脂玻璃制备的密封试管可以达到防泄露、防病毒、防细菌，并且可以在–196°C下不变形。
6.2 精液冷冻方法有很多方法都可以进行精子冷冻，下边将列出具体的常用冷冻保护剂和冷冻过程中的机器控制。
6.2.1 标准步骤6.2.1.1 制备冷冻保护剂GEYC1．在65ml的无菌蒸馏水中加入1.5g葡萄糖和1.3二水三羧酸柠檬酸钠。
2．混入15ml的甘油。
3．加入1.3g的甘氨酸，等完全溶解后用0.45-µm的细孔过滤器过滤。
4．加入20ml的新鲜蛋黄（从特制的无菌蛋中提取）：洗净鸡蛋把蛋壳剥去，用注射器穿刺鸡蛋膜取到蛋黄，一般一个鸡蛋取10ml的蛋黄。
5．在56℃水浴箱中孵育40分钟，并且要时不时搅拌一下。
6．检测溶液中的pH值，如果pH值超出6.8-7.2之间范围，这样的溶液是不理想的，应该丢弃重新制备，因为可能加错试剂或试剂量。
7．在此阶段，细菌培养进行无菌检测。
8．在此阶段，也可以进行精子毒性试验检测。
9．把溶液分装到2ml的试管中，并且保存于–70℃下。
10．在3个月内用完。
同GEYC相似的冷冻保护剂已经有商品供应。
6.2.1.2 在精液标本中增加冷冻保护剂1．复苏冷冻保护剂，升温至室温并且混合，升温到37℃的效果最好。
2．在精液中添加冷冻保护剂需要很小心，因为高浓度的甘油会对精子有害。
3．可以一边滴一边旋转，也可以用吸管上下混匀，或者逐渐加入5滴后在室温下搅拌5分钟，最终GEYC与精液的比例是1：2。
4．加完GEYC后，需要在30-35°C的温箱里孵化5分钟。
6.2.1.3 分装精液到试管中1．传热性能好而且便于保存的0.5ml塑料试管比较常用。
塑料小瓶适合存储量比较多的样本。
2．把精液-GEYC混合液放入精液管或者冷冻管中。
应该应用真空装备或者适配器进行分装。
6.2.1.4 密封麦管在棉花和羊毛之间有若干聚乙烯乙醇粉末塞子的试管能够在精液装满时自动聚合粉末。
1．轻拍试管的一侧让试管底层有1cm的空气。
2．通过沾湿无菌聚乙烯酒精密封粉末对试管进行密封，并且放置在1cm的水中。
3．因为密封粉末可能会被某些病菌感染，所以加热密封法似乎比较受欢迎。
4．此外，可以把样本存储在塑料管或者安培中，常常不会超多90%的体积。
5．把试管外面的水擦干，然后用70%的酒精或者其它清洁剂。
6.2.1.5 应用程序冷冻仪冷冻精子程序冷冻仪控制流进冷冻室的液氮蒸汽量来冷冻精子。
1．把麦管或者冷冻管放到程序冷冻仪中，并按照操用说明激活程序。
2．最常用的程序是按照每分钟1.5℃的速率从20℃降到–6℃，然后以每分钟6℃的速度降到–100℃，整个过程大概需要40分钟。
在转到液氮之前，需要在–100℃下放置30分钟。
3．不同实验室根椐自身经验有可能会使用更复杂的方法(Pérez-Sánchez et al., 1994)。
6.2.1.6 手工冷冻法手工冷冻法不像程序冷冻仪易于控制，但也能得到良好的结果。
在这个过程中有很多方法可以选择。
1．麦管应先在–20℃的冰箱中放置30分钟，然后在–79℃的干冰中放30分钟。
最后放入–196℃的液氮。
2．麦管从-20℃冰箱移入另一个-70℃冰箱，或移入-80℃至-100℃的小容器颈部的液氮蒸气和空气的混合气体内篮子放置10-15分钟后投入液氮中，也可以通过放置在大容器的液氮上方10-20cm悬挂支架，放置1小时形成温度梯度层。
6.2.1.7 冷冻精液贮存1．把冷冻麦管放入塑料存储管内，并插入更大的存储筒里。
2．把冷冻管用夹子加到固定的存储罐中，这个方法使用于在气体中，因为冷冻管没有非常密封。
3．在液氮中保存这些冷冻小管。
6.2.1.8 冷冻精液运输目前市场上已经存在用于转运冷冻精子的商用托运罐，这些托运罐通过液氮汽化可以让保持低温几天到几个星期不等。
注：在转运过程中需要严格遵循当地的、国家的、以及国际上关于液氮和人类生物样本的转运条例。
6.2.1.9 冷冻精子复苏1．在使用前，从液氮或者氮气罐中拿出需要用的试管然后放在薄纸或者试管架上，这样在6分钟内就可以达到室温。
而冷冻管需要花比较多时间。
2．在10分钟内，用无菌剪刀把麦管尾部去掉，并放入受精管中备用，或者检测复苏后精子活动率。
3．如果是用快冻法进行冷冻则复苏时用快复苏法(Verheyen et al., 1993)。
4．应用小剂量多步骤稀释法把冷冻保护剂除开，这样能够避免不恰当渗透压并且能够提高妊娠率。