有关物质方法学--专属性

液相进样针数

液相进样针数一、含量方法学研究所需图谱（流动相、检测限和定量限参照有关物质，如有关物质和含量方法一致，可以只做进样精密度、溶液稳定性）1、线性：包含60%、80%、100%、120%、140%，通常是5~7针，要求r.0.999。

2、进样精密度：用对照品做，单样连续进六针，要求RSD<2.0%。

3、重复性试验：双样双针，一个样进两针，六个样，两个对照，总共16针，要求RSD<2.0%。

4、回收率（准确度）：总共22针，分别做三个80%、三个100%、三个120%，一个样两针，两个对照四针，九个样18针，要求回收含量在98%~102%之间，RSD<2.0%。

5、含量测定：总共28针，方法验证—两个对照品四针，仿制品两个样四针，小试样品两个样四针。

中试样品三批—两个对照四针，一批双样四针，三批六个样十二针。

6、溶液稳定性：单样单针，分别0h、1h、2h、4h、6h、8h，RSD<2.0%。

7、专属性：空白辅料、空白溶剂、正常样、热破坏样、酸破坏样、酸液空白样、碱破坏样、碱液空白、光破坏样、氧化破坏样、双氧水空白样。

共九针，需达到降解约20%，该杂质峰与其它峰应能完全分离，分离度不得小于2.0(已知杂质)。

8、稳定性试验：包括加速0、1、2、3、6月30、40℃，长期3、6、9、12、24月，均做含量测定和有关物质。

含量测定双样双针，一样两针，一批两样，三批六样十二针，两个对照四针。

有关物质做空白溶剂，单样单针，100%样品、1%自身对照，共七针。

二、有关物质方法学研究所需图谱1、波长扫描和流动相的选择：参照国家标准并根据欧洲药典、USP 英国药典以及日本药典中收载的流动相做，取样品，配成一定浓度进样，进行比较确定，选取其中最合适的。

确定流动相后，并驱样品、对照品以及国外上市样品，配成参考文献中的浓度，进样；要求：分离度达1.5以上，分析时间通常为主身份保留时间的2-3倍，分析时间长可考虑采用梯度洗脱，共n+3张图谱系统适用性试验：配制6份相同浓度的杂质溶液进行分析，该杂质峰峰面积的相对标准差应不大于 2.0%，保留时间的相对标准差应不大于1.0%。

浅议有关物质分析方法验证的接受标准

浅议有关物质分析方法验证的接受标准李正邦(杭州民生药物研究院有限公司，杭州311121)摘要目的：阐述HPLC有关物质分析方法各验证项目的接受标准。

方法与结果：介绍HPLC有关物质分析方法各验证项目的目的和操作，参阅文献并结合实际工作经验，通过对比分析提出其接受标准。

结论：正确理解有关物质分析方法验证的目的，是制定合理接受标准的基础；规范的方法验证需要一个较为公认的接受标准。

关键词：HPLC；有关物质；方法验证；接受标准Discussion on Acceptance Criteria of Analytical Method Validation of Related SubstancesLi Zhengbang (Hangzhou Minsheng Institute for Pharma Research Co., Ltd., Hangzhou 311121 )Abstract Objective: To elaborate the acceptance criteria for each validation subject of HPLC analytical method for related substances. Methods and Results: Introduce the purpose and operation of method validation for HPLC related substances, combining literature research with actual work experience, and propose the acceptance criteria by comparative analysis. Conclusion: Formulating reasonable acceptance criteria is based on understanding correctly the purpose of method validation of related substances. It is necessary to establish more recognized acceptance criteria for standardizing method validation.Key words: HPLC; related substances; method validation; acceptance criteria有关物质主要是指药品在生产过程中带入的起始原料、中间体、反应副产物，以及贮藏过程中的生成降解产物等。

药审中心：有关物质分析方法学验证的项目及可接受标准

有关物质分析方法学验证的项目及可接受标准药审中心黄晓龙药品中的有关物质泛指在药品的生产与储存过程中产生的工艺杂质或降解产物。

本文结合国外一些大型药品研发企业在此方面的要求，提出了在对有关物质检查方法进行验证时的可接受标准，供国内的药品研发单位在进行研究时参考。

1．准确度该指标主要是通过回收率来反映。

验证时一般要求根据有关物质的定量限与质量标准中该杂质的限度分别配制三个浓度的供试品溶液各三份（例如某杂质的限度为0.2%，则可分别配制该杂质浓度为0.1％、0.2％和0.3％的杂质溶液），分别测定其含量，将实测值与理论值比较，计算回收率，并计算9个回收率数据的相对标准差（RSD）。

该项目的可接受标准为：各浓度下的平均回收率均应在80%-120%之间，如杂质的浓度为定量限，则该浓度下的平均回收率可放宽至70%-130%，相对标准差应不大于10%。

2．线性线性一般通过线性回归方程的形式来表示。

在定量限至一定的浓度范围内配制6份浓度不同的供试液，分别测定该杂质峰的面积，计算相应的含量。

以含量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归分析。

可接受的标准为：回归线的相关系数（R）不得小于0.990，Y轴截距应在100％响应值的25％以内，响应因子的相对标准差应不大于10%。

3．精密度1）重复性配制6份杂质浓度（一般为0.1%）相同的供试品溶液，由一个分析人员在尽可能相同的条件下进行测试，所得6份供试液含量的相对标准差应不大于15%。

2）中间精密度配制6份杂质浓度（一般为0.1%）相同的供试品溶液，分别由两个分析人员使用不同的仪器与试剂进行测试，所得12个含量数据的相对标准差应不大于20%。

4．专属性可接受的标准为：空白对照应无干扰，该杂质峰与其它峰应能完全分离，分离度不得小于2.0。

5．检测限杂质峰与噪音峰信号的强度比应不得小于3。

6．定量限杂质峰与噪音峰信号的强度比应不得小于10。

另外，配制6份最低定量限浓度的溶液，所测6份溶液杂质峰保留时间的相对标准差应不大于2.0%，峰面积的相对标准差应不大于5.0%。

有关物质分析方法验证技术指导原则

摘要：本文介绍了在对有关物质检查所用的分析方法进行方法学验证时，各项指标的可接受标准，以利于判断该分析方法的可行性。

关键词：有关物质检查分析方法验证可接收标准药品中的有关物质泛指在药品的生产与储存过程中产生的工艺杂质或降解产物。

由于这些有关物质的存在会影响到药品的纯度，进而可能会产生毒副作用，所以有关物质的控制是药品研发的一个重要方面，也是我们在药品审评中一直重点关注的要点之一。

而要对有关物质进行严格的控制，就离不开专属性强、灵敏度高的分析方法，这就涉及到分析方法的筛选与验证。

从现有的申报资料看，药品研发单位已基本上意识到分析方法验证的重要性，但是对验证时各具体指标是否可行尚没有一个明确的可接受标准，从而难以对验证结果进行评判。

为解决这一问题，本文结合国外一些大型药品研发企业在此方面的要求，提出了在对有关物质检查方法进行验证时的可接受标准，供国内的药品研发单位在进行研究时参考。

1．准确度该指标主要是通过回收率来反映。

验证时一般要求根据有关物质的定量限与质量标准中该杂质的限度分别配制三个浓度的供试品溶液各三份（例如某杂质的限度为0.2%，则可分别配制该杂质浓度为0.1％、0.2％和0.3％的杂质溶液），分别测定其含量，将实测值与理论值比较，计算回收率，并计算9个回收率数据的相对标准差（RSD）。

该项目的可接受的标准为：各浓度下的平均回收率均应在80%-120%之间，如杂质的浓度为定量限，则该浓度下的平均回收率可放宽至70%-130%，相对标准差应不大于10%。

2．线性线性一般通过线性回归方程的形式来表示。

具体的验证方法为：在定量限至一定的浓度范围内配制6份浓度不同的供试液，分别测定该杂质峰的面积，计算相应的含量。

以含量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归分析。

可接受的标准为：回归线的相关系数（R）不得小于0.990，Y轴截距应在100％响应值的25％以内，响应因子的相对标准差应不大于10%。

有关物质检验方法概述

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限量检测的适用范围： 1）对准确性要求不高，稳定性中不易发生明显变化，例如API的工艺杂质。 2）虽然要求不高，但也应有一定的要求，比如在方法制定上称取的样品量应规定为“取0.20g” 而不是“取0.2g”，这是因为隐含的规定，前者的取样量应为0.195g～0.205g，而后者是 0.15g～0.25g；而由于限度检查一般限度较低，所以标准往往也是只有一位有效数字，这时由于方法的准确性较低，例如像滴定液的校正因子（ChP0.95-1.05之间）也是可以不考虑的。
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3）ICH Q3A 和Q3B 两部分均有描述，定量限不得高于报告阈值，即需要报告的杂质具备定量的条件。ICH Q3A 和Q3B 两部分对于杂质的描述，对于数据的最终报告（这部分的将在后面进行阐述），均采用数据的方式，应为定量计算而得出的。
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4）USP 等国外药典中要求未知杂质的限度为不得过0.1%，ICH Q3A 和Q3B 也要求超过鉴定阈值（一般为0.10%）的杂质必须鉴定，检验时必须采取先修约后判定（0.10%和 0.1%的意义是完全不同的），这是限量法所不需要而且也做不到的。 5）USP<621>（色谱法）和EP2.2.46（色谱分离技术）对于有关物质的积分、计算和报告，也说明了其检验方法应为定量的。
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鬼峰案例（摘自小木虫网友提问）：液相条件：agilent 二元泵，梯度洗脱，其中缓冲液配制方法如下：缓冲液＝（7.8g NaH2PO4+4ml 三乙胺+1.2g 十二烷基硫酸钠，加水至1000ml，调pH3.0）/乙腈（90/10）乙腈：缓冲液 0min 28 72 5min 28 72 45min 58 42 50min 28 72 60min 28 72 该条件下，在约30.5min出现鬼峰，且一直出现（进空白溶剂、样品等均出现），如图，波长260nm，流速：1.0ml/min，柱温 35摄氏度，色谱柱：C18 5 um 250×4.6mm。

有关物质方法验证

有关物质方法验证（以HPLC法为例）（1）系统适用性试验系统适应性试验主要是考察主成分与杂质的分离情况以及主峰参数信息，如理论塔板数、拖尾因子、分离度等，均应符合测定要求。

空白溶液、自身对照溶液、供试品溶液各进1针。

系统精密度自身对照溶液连续进样6次，峰面积RSD不大于2%，保留时间RSD不大于1% 。

（2）专属性专属性系指在其它成分可能共存的情况下，采用的方法能准确测定出被测杂质的特性。

对于原料药，可根据其合成工艺，采用各步反应的中间体（尤其是后3步反应的中间体）、非对映异构体、特定杂质、粗品等作为测试品进行系统适用性研究，考察产品中各杂质峰及主成分峰相互间的分离度是否符合要求，从而验证分析方法对工艺杂质的分离能力。

对于制剂，重点控制降解杂质。

专属性试验（用二极管阵列检测器）1、原料药溶剂自身对照供试品起始原料合成中间体特定杂质（可能会与起始原料和合成中间体重复）混合样：将起始原料、合成中间体、特定杂质加到供试品溶液中。

特定杂质的浓度一般同限度浓度，起始原料和合成中间体的浓度一般同自身对照的浓度（如果浓度过高，可能会有杂质峰干扰）。

以上样品各进一针，主要考察色谱条件能不能有效检出杂质，以及各个峰之间的分离情况，特别是主峰和特定杂质峰与相邻杂质峰的分离情况。

注：在现有标准的色谱条件下，如果有的起始原料和合成中间体的峰与主峰的分离度不符合要求或者保留时间过长，只要起始原料和合成中间体不是降解产物，可以用其它合适的色谱条件单独控制，如果粗品中未检出，以后可以不在控制。

破坏试验酸、碱、高温、光照、氧化、金属离子（选做。

一般用铁离子，因为最有可能接触到）。

为了便于比较，同时进未破坏的样品。

空白：酸碱空白、氧化空白，处理过程与样品的最终破坏条件相同。

热破坏：一般将样品溶液水浴加热或固体样品高温放置。

光照破坏：如果已经做过影响因素试验，可用光照10天的图谱代替。

氧化破坏：双氧水由于响应值较强，一般浓度不必太高，一般用几滴即可，必要时可以加热。

方法学验证培训资料完整版

方法学验证（LC、GC）123分析方法学验证的类型分析方法学验证的内容分析方法学验证中的其他问题各类型方法学验证的具体内容和要求4关于分析方法验证类型分为以下几类：A 杂质的定量试验----有关物质B 杂质的限度检查----残留溶剂C 原料药、制剂或者药品组分样品中选定的活性成分或选定组分的定量检测----含量、溶出度等D 鉴别试验1分析方法学验证的类型内标法外标法面积归一化法含量外标法：有杂质对照品自身对照法：没有杂质对照品或未知杂质的测定内标法：可能带入杂质或内标与杂质重叠，很少使用面积归一化法：杂质量大，且主成分量与峰面积成线性有关物质（残留溶剂）常用验证类型1、专属性（方法摸索）2、系统适用性3、精密度（重复性、中间精密度、重现性）4、准确度（回收率）5、检测限6、定量限7、线性及范围8、耐用性（含稳定性）分析方法学验证的内容2分析方法学验证的内容3方法学验证的具体内容和要求3.1含量方法学(外标法)ICH 定义为“当预料到一些组分可能存在时，准确无误地检测被分析物的能力。

通常这些可能存在的组分有杂质、降解产物、基质等”。

含量测定和杂质检查试验比较目标成分与杂质、降解产物及辅料等的实验结果（即目标成分与杂质、降解产物及辅料中的色谱峰互不干扰），强制破坏试验。

一、专属性检测要求内容①溶剂1针；②阴性空白（制剂）1针；③对照品溶液1针；④供试品溶液1针；进样单样单针结果溶剂、阴性空白应无干扰分离度≥2.0（黄晓龙）；拖尾因子：0.8—1.5之间（EP）；保留时间拖尾因子理论塔板数分离度***的峰面积溶剂阴性空白对照品溶液供试品溶液数据结果表格一、专属性[1]黄晓龙，含量测定分析方法验证的可接受标准简介. 国家食品药品监督管理局药品审评中心电子刊物. 2006年检测要求内容①溶剂1针；②系统适用性溶液（如标准中有要求）1针；③对照品溶液×6针结果峰面积的RSD （n=6）＜1.5%(≤2.0% CHP)主峰保留时间的RSD＜1.0%（n=6）（CDE审评原则、黄晓龙）分离度＞1.5（CHP）拖尾因子：0.8—1.5 （EP）（≤2.0黄晓龙）二、系统适用性系统重复性：S/N ＞1000，RSD ＜1.5%1000＜S/N ＞100，RSD ＜2.0%[1]黄晓龙，有关物质/含量测定分析方法验证的可接受标准简介. 国家食品药品监督管理局药品审评中心电子刊物. 2006年表2---系统适用性（对照品溶液）保留时间***的峰面积理论塔板数分离度拖尾因子123456RSD(%)///二、系统适用性表1 ---系统适用性溶液（如标准中有要求）保留时间分离度理论塔板数拖尾因子峰面积系统适用性溶液检测要求内容①溶剂1针；②阴性空白溶液1针；③对照品溶液1针；④验证---含量相近的测试溶液（阴性溶液+检出限对照品），三样单针；结果♦信噪比（S/N)一般要求2-4:1；♦峰面积RSD＜15%(n=3）♦结果---本测定条件下检测限为***ng/ml,相当于供试品溶液进样量***%(检测限浓度/供试品溶液浓度）。

紫外可见分光光度法测定总黄酮含量的方法学考察要点

紫外可见分光光度法测定总黄酮含量的方法学考察要点一、本文概述紫外可见分光光度法是一种基于物质对紫外和可见光的吸收特性进行定量分析的方法。

在生物化学和药物分析中，这种方法被广泛应用于测定各类化合物的含量，其中包括黄酮类化合物。

黄酮类化合物，也称为黄酮或黄碱素，是一类具有广泛生物活性的天然产物，它们广泛存在于植物中，并具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多种生物活性。

因此，对黄酮类化合物进行准确、快速的定量分析具有重要意义。

本文旨在探讨紫外可见分光光度法在测定总黄酮含量中的应用，并对其方法学进行考察。

我们将详细介绍紫外可见分光光度法的基本原理、实验操作步骤，以及影响测定结果的各种因素。

我们还将讨论该方法的优点和局限性，以及在实际应用中可能遇到的问题和解决方案。

通过对这些内容的全面探讨，我们希望能够为相关领域的研究人员和技术人员提供有益的参考和指导，推动紫外可见分光光度法在黄酮类化合物分析中的应用和发展。

二、紫外可见分光光度法的基本原理紫外可见分光光度法（UV-Vis spectrophotometry）是一种基于物质对紫外和可见光区域内特定波长光的吸收特性进行定量分析的方法。

该方法基于朗伯-比尔定律（Lambert-Beer Law），即溶液对光的吸收与溶液的浓度成正比，与光通过溶液的路径长度也成正比。

在紫外可见分光光度法中，当一束单色光通过被测溶液时，部分光能会被溶液中的吸光物质吸收，导致光强减弱。

吸光度（A）与吸光物质的浓度（c）和光程长度（l）之间的关系可以表示为 A = εlc，其中ε为摩尔吸光系数，它表示单位浓度、单位光程长度下的吸光度。

对于总黄酮含量的测定，黄酮类化合物在紫外可见光区域内有特定的吸收峰，通过测量这些吸收峰处的吸光度，并结合标准品的工作曲线，可以实现对总黄酮含量的定量分析。

紫外可见分光光度法还具有操作简便、灵敏度高、重现性好等优点，因此在黄酮类化合物含量测定中得到了广泛应用。

需要注意的是，紫外可见分光光度法只能测定那些具有吸光特性的物质，且受到溶液的颜色、浊度以及其它共存物质的影响。

加校正因子的主成分自身对照法

加校正因子的主成分自身对照法一、定义及适用范围加校正因子的主成分自身对照法，即以主成分作为对照的内标法，校正因子可以在检测时测定，但需提供杂质对照品，也可在建立方法时将测得的校正因子载入质量标准，供以后常规检验使用，无需长期提供杂质对照品，但也仅适用于杂质的控制。

建议：校正因子在0.8-1.2时可不予校正。

校正因子计算公式：f= As×Cr Cs×Ar式中：f—校正因子；As—杂质对照品峰面积或峰高；Cs—杂质对照品浓度；Ar—待测成分对照品峰面积或峰高；Cr—待测成分对照品浓度。

二、校正因子的测定在校正因子的研究和使用中，标准物质、色谱条件、溶剂、检测波长等均是重要的影响因素，研究中需要予以关注。

2.1 校正因子的测定需要用到特定杂质及主成分的标准物质，这些标准物质应具备量值准确的特点，符合标准物质〔对照品〕的相关要求；其次，确定校正因子的分析方法应与最终确定的质量标准方法一致，色谱条件等需经筛选优化后确定，如有变更，需考虑对校正因子的影响，必要时重新确定；第三，要关注影响待测物UV吸收的各种因素，如溶液制备所用溶剂最好与最终确定的流动相相同，检测波长最好在特定杂质及主成分UV曲线的峰或谷处，避开吸收值急剧变化波段，以保证测定方法具有较好的耐用性，并保持测定结果的恒定。

2.2 一般情况下，校正因子可视具体情况通过如下几种方法确定：〔1〕单浓度点测定：制备适当浓度的特定杂质对照品溶液和主成分对照品溶液，分别进样测定，照上式计算，得到校正因子。

〔2〕多浓度点测定：制备适当的高、中、低三水平浓度的特定杂质对照品溶液和主成分对照品溶液〔涵盖定量限、标准限度〕，分别进样测定，照上式计算各校正因子，计算RSD，求平均值，得到校正因子。

〔3〕标准曲线法测定：精密称取杂质对照品和主成分对照品，分别制备系列溶液〔涵盖定量限、标准限度〕，分别进样后，按最小二乘法以进样量对响应值〔峰面积等〕进行线性回归，求得两条标准曲线，两曲线斜率之比即为校正因子。

有关物质方法研究思路

有关物质方法学研究l 主要内容1、有关物质检查方法建立的研发思路2、有关物质方法的建立和方法学验证2.1、原料药和制剂的相关理化性质2.2、有关物质分析方法的选择2.3、有关物质分析方法的验证2.4、有关物质杂质的定量方法3、有关物质杂质的分析4、有关物质杂质限度的制订有关物质检查方法建立的研发思路研发思路：有关物质检测方法的建立重点是测定方法的先进性、准确性、可行性。

⑴首先有关物质的方法选择，对于仿制药有EP、BP、USP等质量标准的药品，首选以上的色谱条件进行筛选，尤其关注的离子对试剂的使用。

⑵选用不同色谱条件进行对比研究，如果方法一是等度测定的，方法二最好选用梯度色谱条件，比较两种方法测定结果的杂质个数及杂质含量等。

确证有关物质测定方法的准确性。

⑶对所筛选的方法进行系统的方法学研究，比较不同检测方法的优劣，选择较好的色谱条件作为本品有关物质检查的测定方法。

⑷对于仿制药同时要将自制样品与市售原研样品进行全面的质量比较，分析其杂质的种类和含量，确保自制样品与市售原研样品的杂质在同一水平。

原料药和制剂的相关理化性质在建立有关物质检查方法前，需首先了解原料药和制剂的相关理化性质。

⑴对于原料药，了解原料药的基本性质和结构特点。

了解原料药合成工艺过程中的起始原料、副产物、副产物产生的杂质、中间产物或可能产生的降解产物等。

结合相关已知的杂质来确定有关物质检测的条件。

⑵对于制剂，可能影响药物有关物质的重要因素有辅料、剂型、存储条件等，主要了解辅料对有关物质检测的干扰情况，不同剂型在不同存贮条件下可能产生的杂质等。

对于复方制剂，同时要考虑到复方中原料的相互作用可能产生的杂质等。

有关物质分析方法的选择有机杂质的检测方法包括化学法、光谱法、色谱法等，因药物结构及降解产物的不同采用不同的检测方法。

通过合适的分析技术将不同结构的杂质进行分离、检测，从而达到对杂质的有效控制。

目前普遍采用的杂质检测方法主要有：⑴高效液相色谱法（HPLC）目前采用的分析方法主要以高效液相色谱法为主，为常用的分析方法。

方法学验证中各项指标的深度剖析-谢沐风讲解

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强力破坏试验
● 水破坏取原料适量，加水溶解后，在90℃放置24小时。 ● 氧化破坏取原料适量，用5%过氧化氢溶液溶解后，在 90℃放置24小时。 ● 强碱破坏取原料适量，用1mol/L氢氧化钠溶液溶解后，在90℃放置24小时。 ● 强酸破坏取原料适量，加1mol/L盐酸溶液溶解后，在 90℃放置24小时。 ● 高温破坏取原料适量，依据各自品种的熔点不同，在高温下破坏至外观性状改变 ● 强光破坏取原料适量，置紫外灯下照射48小时。
发性强的溶剂；同时应保证对照溶液的主成分峰面积精密度良好。
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质量标准中制订有关物质的原则 ● 采用杂质对照品法、用于降解产物的准确测定，如氢氯噻嗪、对乙酰氨
基酚等。 ● 采用强破坏试验破坏出杂质。如中国药典中的氧氟沙星所有品种，均在
HPLC法的色谱条件下拟定了：取供试品溶液，置紫外灯下（254nm）照射4小时以上，使产生的紧邻主峰前的杂质峰与主峰的分离度应符合规定。 ● 不采用任何方式。
在100％浓度的主成分溶液中加入1%浓度的杂质对照品，以模拟样品中有可能存在的状态。
介绍配制方法 —— 先配制杂质贮备液，再用供试品溶液（或浓的对照品溶液）来稀释，简便、易行！
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专属性试验验证图谱
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存在问题 —— 配制相同浓度，测定样品时，主成分峰骤然加大，将杂质峰覆盖。
强破坏试验的目的：验证药品在遭遇了极端的气候环境条件下产生的杂质，在所建立的色谱条件下是否能够分离、测定。
柺愊曐帩帪娫柺愊 %
1 4 0
1 3 0
1 2 0
1 1 0
1 0 0
9 0
8 0
7 0
6 0 0
2

有关物质检查方法学验证标准操作规程

有关物质（包括已知杂质）检查方法验证标准操作规程1.目的为保证检测工作的可靠性和可重现性，在未知样品的检测前必须对检测方法进行验证以证明所采用的检测方法适合于相应的检测要求。

2.范围建立药品质量标准时、药品生产工艺变更时、制剂组分发生变更时、原分析方法修订时均应进行有关物质检测的方法学的验证。

3.责任人检测员、项目负责人、各级项目经理：要求系统、全面验证含量测定方法并记录整理验证数据。

4.程序4.1验证内容：杂质检测方法的建立基于方法学研究，主要包括专属性试验、检测限试验、溶液稳定性试验等内容，如果定量检测杂质则需进行线性、精密度、稳定性、重现性及回收率等试验，从不同的角度、层面验证分析方法的可行，从而保证药品中的杂质能够有效地检测。

4.2杂质检测方法建立验证及可接受标准1）专属性试验主要通过破坏性实验实现。

破坏性试验，也称为强制降解试验（stressingtest）,它是在人为设定的特殊条件下，如酸、碱、氧化、高温、光照等，引起药物的降解，通过对降解产物的测定,验证检测方法的可行性,分析药物可能的降解途径和降解机制。

每项破坏性试验通常包括以下内容：酸降解一般采用0.1mol/L－1mol/L盐酸或硫酸；碱降解采用0.1mol/L－1mol/L的氢氧化钠溶液；氧化降解采用合适的过氧化氢溶液。

以上三种试验,为了加快反应或者提高降解强度,必要时可以加热或提高浓度；高温试验通常温度高于加速试验温度的10°C，如50°C、60°C等，对于原料药有时需考虑水溶液或混悬液的降解,或者考虑在不同的pH值条件下的降解；光照试验条件可采用4500LX。

破坏性试验的具体条件，与具体药物密切相关，需结合具体药物的特点，选择合适的条件，使药物有一定量的降解，并对可能的降解途径和降解机制进行分析，保证实验的意义。

药物经强力破坏产生的降解产物通常采用色谱法测定，需结合药物和可能降解产物的理化性质，选择不同的色谱方法（HPLC、GC、TLC）或检测器，有时可采用不同分离机理的色谱系统。

含量及有关物质分析方法验证的可接受标准

溶出介质体积的选择
漏槽条件即做溶出的最佳条件，是指药物所处释放介质的浓度远小于其饱和浓度，生理学解释为药物在体内被迅速吸收，制剂的体外包括释放度等测定需要模仿体内生理条件的，满足药物溶解-吸收的过程，漏槽条件起到了修正作用，一般释放介质的体积为药物饱和溶液所需介质体积的3～5倍。
（3）转篮法与桨法的选择
含量及有关物质分析方法验证的可接受标准
文章来源：药审中心审评二部黄晓龙
本文介绍了在对含量及有关物质测定所用的分析方法进行方法学验证时，各项指标的可接受标准，以利于判断该分析方法的可行性。
内容包括：准确度、线性、精密度、专属性、检测限、定量限、耐用性和系统适应性。
1.准确度
含量：该指标主要是通过回收率来反映。验证时一般要求分别配制浓度为80％、100％和120％的供试品溶液各三份，分别测定其含量，将实测值与理论值比较，计算回收率。可接受的标准为：各浓度下的平均回收率均应在98.0%-102.0%之间，9个回收率数据的相对标准差（RSD）应不大于2.0%。
3.精密度
含量： 1）重复性配制6份相同浓度的供试品溶液，由一个分析人员在尽可能相同的条件下进行测试，所得6份供试液含量的相对标准差应不大于2.0%。 2）中间精密度配制6份相同浓度的供试品溶液，分别由两个分析人员使用不同的仪器与试剂进行测试，所得 12个含量数据的相对标准差应不大于2.0%。
化学药品溶出度方法研究
文章来源：审评二部唐素芳
化学药品普通口服固体制剂溶出度方法验证易忽视的几个问题
文章来源：审评四部审评八室郑国钢
溶出度研究试验主要包括以下内容：
（1）溶出介质的选择（2）溶出介质体积的选择（3）溶出方法（转篮法与桨法）的选择（4）转速的选择（5）溶出度测定方法的验证（6）溶出度均一性试验（批内）（7）重现性试验（批间）

有关物质分析方法验证的可接受标准简介

有关物质分析方法验证的可接受标准简介（CDE网站2006年2月8号发表的电子刊物）摘要：本文介绍了在对有关物质检查所用的分析方法进行方法学验证时，各项指标的可接受标准，以利于判断该分析方法的可行性。

关键词：有关物质检查分析方法验证可接收标准药品中的有关物质泛指在药品的生产与储存过程中产生的工艺杂质或降解产物。

由于这些有关物质的存在会影响到药品的纯度，进而可能会产生毒副作用，所以有关物质的控制是药品研发的一个重要方面，也是我们在药品审评中一直重点关注的要点之一。

而要对有关物质进行严格的控制，就离不开专属性强、灵敏度高的分析方法，这就涉及到分析方法的筛选与验证。

从现有的申报资料看，药品研发单位已基本上意识到分析方法验证的重要性，但是对验证时各具体指标是否可行尚没有一个明确的可接受标准，从而难以对验证结果进行评判。

为解决这一问题，本文结合国外一些大型药品研发企业在此方面的要求，提出了在对有关物质检查方法进行验证时的可接受标准，供国内的药品研发单位在进行研究时参考。

1．准确度该指标主要是通过回收率来反映。

验证时一般要求根据有关物质的定量限与质量标准中该杂质的限度分别配制三个浓度的供试品溶液各三份（例如某杂质的限度为0.2%，则可分别配制该杂质浓度为0.1％、0.2％和0.3％的杂质溶液），分别测定其含量，将实测值与理论值比较，计算回收率，并计算9个回收率数据的相对标准差（RSD）。

该项目的可接受的标准为：各浓度下的平均回收率均应在80%-120%之间，如杂质的浓度为定量限，则该浓度下的平均回收率可放宽至70%-130%，相对标准差应不大于10%。

2．线性线性一般通过线性回归方程的形式来表示。

具体的验证方法为：在定量限至一定的浓度范围内配制6份浓度不同的供试液，分别测定该杂质峰的面积，计算相应的含量。

以含量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归分析。

可接受的标准为：回归线的相关系数（R）不得小于0.990，Y轴截距应在100％响应值的25％以内，响应因子的相对标准差应不大于10%。

药物分析名词解释

1.药物标准：根据药物自身的理化与生物学特性，按照批准的来源、处方、生产、工艺、贮藏运输条件等所制定的，用以检验药品质量是否达到用药要求并衡量其质量是否稳定均一的技术规定。

2.性状：是对药物的外观、嗅味、溶解度以及物理常数等的规定，反映了药物特有的物理性质。

3.熔点：一种物质按规定方法测定，由固体熔化成液体的温度熔融同时分解的温度或在熔化时自初熔到全熔的一段温度。

4.比旋度：在一定波长和温度下，偏振光透过长1dm且每1ml中含有旋光性物质1g的溶液时测得的旋光度。

5.吸收系数：在给定的波长、溶剂和温度等条件下，吸光物质在单位浓度、单位液层厚度时的吸收度称为吸收系数。

6.一般鉴别试验：依据某一类药物的化学结构或者理化性质的特性，通过化学反应来鉴别药物的真伪。

7.专属鉴别试验：根据每一种药物化学结构的差异及其所引起的理化性质的不同，选用某些特有的、灵敏的定性反应来判断药物的真伪。

8.比移值：薄层色谱法中原点到斑点中心的距离与原点到溶剂前沿的距离的比值。

（百度)9.色谱鉴别法：利用不同物质在不同色谱条件下，产生各自的特征色谱行为（比移值或保留时间）进行的鉴别试验。

标准物质：系指供试品中物理和化学测试及生物方法试验用，具有确定特性量值，用于校准设备、评价测量方法或者给供试药品赋值的物质，包括标准品、对照品、对照药材、参考品。

10.标准品：用于生物鉴定、抗生素或生化药品中含量或效价测定的标准物质。

按效价单位(或μg)计，以国际标准品标定。

11.对照品,：用于结构确切物质（如化学药）分析。

按干燥品（或无水物）进行计算后使用。

12.鉴别：根据药物的某些物理、化学或生物学等特性所进行的试验，以判定药物的真伪。

13.检查：是对药物的安全性、有效性、均一性和纯度四个方面的状态所进行的试验分析。

14.制剂的规格：制剂的规格，系指每一支、片或其他每一个单位制剂中含有主药的重量（或效价）或含量（%）或装量，即制剂的标示量。

中间体有关物质研究指导原则

中间体（仿制）质量研究指导原则一、有关物质1、专属性:定位测试溶液要求：空白溶剂，供试品溶液，各杂质定位溶液及选择性测试溶液各1份。

选择性测试溶液可不必按照限度添加，要保证图谱清晰可辨，美观大方。

波长的确定：通过DAD检测器提取选择性测试溶液光谱图进行选择，确定检测波长，所有杂质都要积分，分离度统计杂质分离最小的, 要求主峰与杂质之间的分离度达到1.5、特定杂质与其他杂质之间的分离度达到1.2，其他杂质之间分离度无要求。

（此处杂质分离度不包含未知杂质间的分离度）。

降解实验：不再开展。

数据要求：选择性测试溶液建议按下表整理波长选择建议按照下表整理，并将各物质的紫外图谱附上。

2、系统适用性：溶液要求：空白溶剂1份，供试品溶液1份。

1份供试品溶液跑6针，正常积分，考察主成分（RSD≤2.0%）和保留时间(RSD≤1.0%)，主峰与相邻峰分离度、理论板数。

系统适用性试验结果3、溶液稳定性：溶液要求：1份空白溶剂，1份供试品溶液。

实验要求：考察8-12个小时内的稳定性即可。

若供试品溶液后期继续使用，则稳定性需继续考察。

数据要求：考察主成分面积，总杂、杂质个数限度参见下表4、检测限与定量限：杂质与主成分均要做。

检测限溶液需求：1份空白溶剂，各杂质及主成分检测限溶液各1份，各运行3针。

定量限溶液需求：1份空白溶剂，各杂质及主成分定量限溶液各1份，空白运行1针，杂质及主成分各运行6针。

数据要求：记录峰面积和保留时间的RSD，峰面积RSD≤20%，保留时间RSD≤1.0%，申报数据整理建议参见以下表格：5、线性与范围：杂质不做溶液要求：空白溶剂，主成分至少7个不同浓度的溶液各1份，以照线性溶液1、线性溶液2方式命名。

点的分布下限包含定量限，上限至主成分150%，中间点最好要均匀分布。

申报数据要求建议参照以下表格，r要达到0.995以上，Y轴截距应在100％响应值的25％以内。

有关物质线性范围试验结果6、重复性和中间精密度：重复性溶液需求：1份空白溶剂， 6份供试品溶液（称取6供试品，）空白溶剂及6份供试品溶液各运行1针。

含量和有关物质方法学验证

含量和有关物质方法学验证（HPLC法）系统适用性试验的配制方法：在100％浓度的主成分溶液中加入1%浓度的杂质对照品，以模拟样品中有可能存在的状态。

介绍配制方法——先配制杂质贮备液，再用供试品溶液（或浓的对照品溶液）来稀释，简便、易行！检测波长的确定涉及到各被检测物质在该波长下的响应因子是否相同，即所谓重量校正因子的问题。

（f=A杂质/A被测成分）选取主成分与各杂质具有相同紫外吸收的波长（f=1.0）。

选取各杂质紫外吸收大于主成分紫外吸收的波长（f>1.0），这样可更加严格控制杂质的限度。

如选取各杂质紫外吸收小于主成分紫外吸收的波长，应必须加入重量校正因子（f<1.0），否则将得到错误的判断。

最小峰面积的设定●其设定，不是绝对值，而是相对值。

●英国药典中有明确的说明：凡有关物质的检测采用HPLC法测定时，均规定舍弃对照溶液主峰面积几分之几的峰面积。

普通样品测定时，通常为1/10~ 1/20（即相当于样品测定浓度的0.1%~0.05%）。

如规定杂质限度为1.0%，对照溶液峰面积为10000，那么，最小峰面积可考虑设定为1000~500左右。

新药稳定性考核时，可设定到0.01%的最小峰面积。

●原料药销售与购买的合同中，为确保双方达成一致意见，此点应予以重视。

检测限（将被测物溶液不断稀释后进样测定，直至被测物峰面积无法检出为止，此时的浓度即为最低检出浓度）：●信噪比的三倍——纯属“纸上谈兵”，实际测定中根本用不上。

●是相对值，不是绝对值。

是相对于供试品溶液浓度的多少分之一而言，一般至少要在5000倍以上。

供试品溶液浓度则应是最低检出浓度的2000～5000倍。

同时还应考虑仪器、色谱柱等因素对最低检出浓度和最大进样浓度的影响(即耐用性因素)，所以供试品溶液的浓度应在保证小于最大进样量的情况下，适当设定得高些，以保证该浓度在任何试验条件下，均有足够的检测灵敏度。

表1为最低检出浓度、最大进样量、供试品溶液和对照溶液间的比例关系(进样量10μl，规定杂质限度1.0％)。

HPLC有关物质分析方法验证

1、专属性
试验方法 • 空白溶剂 • 系统适用性溶液5针 • 中间体及样品 • 中间体与样品混合溶液 • 破坏性试验（酸、碱、氧、高温、光照等，用到不同溶剂的，溶
剂也要进样对照） • 系统适用性溶液1针 • 图谱打印： • 中间体与样品混合溶液、破坏性试验中主成分与主要杂质要打印
出光谱纯度和分离度数据，如short+spectum格式打印。 • 系统适用必至少有一针用extend performance格式打印。 • 必要时提供3D图
如不能测得杂质的相对响应因子，可在线测定杂质的相关数据，如采用二极管阵列检测器测定紫外光谱，当杂质的光谱与主成分的光谱相似，则可采用原料药的响应因子近似计算杂质含量（自身对照法）。
5、响应因子
已知杂质相对与主成分在HPLC上的响应比值
计算方法：
(1)可直接用主成分对照品及杂质对照品进行测定。
化学药物有关物质 HPLC分析方法验证
一、目的了解与规范有关物质方法学验证。
二、验证内容
1、专属性 2、检测限、定量限、 3、线性范围 4、响应因子 5、精密度(重复性、中间精密度和重现性) 6、准确度 7、耐用性
1、专属性
指有其他成分（合成中间体杂质、降解物、副产物等）可能存在情况下采用的方法能准确测定出被测物的特性，能反映该方法在有共存物时对供试物准确而专属的测定能力，是指该法用于复杂样品分析时是否受到相互干扰程度的度量。
2、灵敏度
(2)定量限(LOQ)
指样品中被测物能被定量测定的最低量，结果应具有一定准确度和精密度要求。
2、灵敏度
LOQ试验方法
•空白溶剂 •系统适用性溶液5针 •杂质对照品溶液进1针 •根据上一针杂质对照品的S/N值进行稀释进样 •直到S/N为约10时，平行进样3针。 •系统适用性溶液1针 •图谱打印： •杂质对照溶液及其稀释液均要以performance+noise格式打印。系统适用必至少有一针用extend performance格式打印

专属性方法包括液相色谱法

专属性方法包括液相色谱法液相色谱法（Liquid Chromatography, LC）是一种分离和分析化合物的方法。

它是通过液态流动相将混合物中的化合物分离成单个组分的方法。

液相色谱法可以用于定性和定量分析有机和无机物质。

它在化学、生物化学、药学、环境科学等领域中广泛应用。

液相色谱法的原理是将待分析的混合物通过一个固定相填充的管柱，然后用一种流动相将混合物分离成单个组分。

固定相通常是一种多孔的固体，如硅胶或高性能液相色谱柱。

流动相是一种溶解有机或无机成分的溶剂。

当混合物通过柱时，它们会与固定相发生作用，不同的成分会以不同的速率通过固定相，从而实现分离。

液相色谱法有很多不同的变体，常见的包括高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）、气相色谱法（Gas Chromatography, GC）和液相色谱质谱联用法（Liquid Chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS）等。

其中，HPLC是最常用的液相色谱技术之一，它可以通过增加柱子长度、改变固定相和流动相等参数来提高分离效果。

液相色谱法的应用非常广泛。

在化学领域，它可以用来分离和分析有机物和高分子化合物，如药物、天然产物、蛋白质和多肽。

在环境科学中，它可以用来检测水中的有机和无机污染物。

在生物医学研究中，液相色谱法可以用于药代动力学研究、体内药物分布分析和药物代谢产物的筛选等。

液相色谱法的优点包括分离效果好、分析速度快、样品准备简单、分析范围广等。

然而，它也存在一些限制，如柱塞泄漏、高背压、固定相失效等问题。

为了解决这些问题，人们不断改进液相色谱法的仪器和方法，并提出了各种技术和策略。

总之，液相色谱法是一种非常重要的分析方法，它在各个领域中发挥着重要的作用。

随着科学技术的不断发展，我们可以预期液相色谱法将在未来得到更广泛的应用和发展。

凝胶限度法专属性

凝胶限度法专属性
凝胶限度法是一种常用的化学分析方法，用于确定某种物质在溶液中的浓度范围。

该方法是通过观察溶液中物质形成凝胶或溶胶相变的特性来进行测量和分析的。

凝胶限度法有许多专属性，包括以下几个方面：
1. 灵敏度：凝胶限度法可以提供对浓度范围内物质含量的灵敏度分析。

通过观察溶液的光学、电导率或流变学特性的变化，可以确定物质的浓度区间。

2. 精确度：凝胶限度法通常有较高的精确度，并且可重复性好。

通过采用标准曲线或比色计、电导计等仪器设备，可以获得准确的浓度结果。

3. 适用性：凝胶限度法适用于各种类型的溶液和样品，包括含有胶体颗粒、大分子聚合物或其他高分子物质的样品。

4. 快速性：凝胶限度法通常具有较快的分析速度，可以在短时间内完成样品的测量和分析，提高实验效率。

需要注意的是，凝胶限度法的具体操作步骤和分析流程可能因具体应用领域而有所不同。

在进行任何化学分析时，应根据具体实验要求和标准方法来选择合适的分析技术和方法。