荧光标记复合扩增

荧光标记复合扩增试剂盒概述

一、荧光标记复合扩增检测技术简介

DNA分析近十几年来才应用于法医学的鉴定，在这期间，DNA分型技术取得了两次重大突破。1985年，Jeffereys等学者建立了第一代分型技术——DNA指纹技术，其本质是以DNA分子杂交为核心的限制性片段长度多态性分析，实现了物证鉴定由排除到认定的飞跃口]。进入20世纪90年代，Mullis和Saiki等学者发明并改进的PCR技术被用于法医DNA 分析，从而建立了以PCR为基础的第二代DNA分型技术。其本质是应用PCR技术扩增人类基因组DNA中高度多态性位点，扩增产物经过片段长度多态性分析或序列多态性分析研究不同个体间DNA分子水平上的差异及其遗传规律。此技术一经出现，便在个体识别亲子鉴定中发挥了重要作用。经过近十多年的发展，法医DNA分析已建立了DNA指纹技术，PCR扩增片段长度多态性分析技术和线粒体DNA测序等三大主要技术，结合在它们基础上发展出的一些新技术方法，如小卫星重复单位多态性分析(PCR—MVR)、单链构象多态性分析(PCR—SSCP)、等位基因特异性引物PCR扩增(PCR—SSP)等，共同形成了目前的法医DNA 分析技术。

在一个PCR体系中同时扩增多个基因座的方法叫做复合扩增(multiplexing PCR)。单个基因座等位基因数量少，信息量有限，如果多个基因座扩增条件基本相似，就可以将多个基因座的引物加入一个扩增管中进行复合扩增，一次电泳检测，可在短时间内获得多个基因座的分型结果，提高单次检测的信息量，提高个人识别率，也可降低成本和检材的消耗，减少操作强度，对微量检材的鉴定特别有价值，有利于复核鉴定。

STR荧光标记检测技术是指将荧光染料标记到其中一个引物(一般选正链)的5'端,使随后的每一个PCR扩增产物都带有一个荧光染料分子。这种带有荧光分子的DNA片段在电泳时从阴极向阳极电泳迁移,迁移速度按片段分子量由小到大排列,当片段通过到阳极端的激光扫描窗口时,荧光染料分子的共辄双键受到激发,发出一定波长的荧光,被扫描仪CCD接收,每一个带荧光染料的DNA片段按各自通过激光扫描窗口的实际时间(real time)被记录下来,出现一个荧光吸收峰,以荧光峰来表示每一个片段,峰值高低与扩增片段数量呈正相关,而峰出现的时间与片段大小呈正相关,片段小,出现峰时间短。根据同一泳道内标准分子量(简称为内标)的迁移率得到每一泳道迁移率的标准曲线,计算出待测样品的分子量大小,应用ABI 3130XL型基因分析仪片段分析精确度可达0.5bp。利用片段分析软件将测定的样品片段大小与同-一批加样的等位基因标准物(ladder)的片段大小比对,进行基因型命名(图1为荧光标记复合扩增检测技术原理)。因此,这种复合检测体系可以同步检测多个STR基因座,该检测体系可以根据等位基因片段所带的劳光颜色不同加以区别,即使等位基因片段长度有重叠的基因座,也可采取不同的荧光标记,区分不同基因座的等位基因。目前STR检验主要应用多色荧光标记复合扩增毛细管电泳自动检测技术。

图1 荧光标记复合扩增检测技术原理

应用基于荧光标记复合扩增结合毛细管自动电泳技术而幵发的各种商业化试剂盒,是目前法医STR检验的主要技术手段。目前，国内外用于生物检材个体识别检验、亲子鉴定和构建DNA数据库的商品化STR复合试剂盒主要有：IdentifilerTM、SINOfiler（美国ABI公司）、PowerplexTM16（美国Promega公司）、DNATyperTM15 plus（公安部物证鉴定中心）、Goldeneye16A（北京基点认知技术有限公司）、AGCU（无锡中德美联生物技术有限公司）。它们最多可获得18个常染色体STR基因座的分型结果。

二、法医DNA鉴定常用试剂盒

1、Applied Biosystems公司（美国）：Identifiler PCR扩增试剂盒

英文名称： AmpF/STR® Identifiler® PCR Amplification Kit

产品概述AmpF STR Identifiler PCR扩增试剂盒可以在单次PCR反应中同时扩增15个STR 基因座和Amelogenin性别基因。Identifiler试剂盒中进行复合扩增的四核苷酸位点包括CODIS所必需的13个核心STR位点，即CSF1PO、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、FGA、TH01、TPOX、和vWA。获得的数据可以满足ENFSI（欧洲法医学网）与Interpol（国际刑警组织）的要求。另外两个四核苷酸位点（D2S1338与D19S433）与先前同FSS（英国法庭科学服务机构）联合开发的SGM Plus扩增试剂盒相一致。相比之前所有的AmpF STR试剂盒，包含了上述STR位点的Identifiler 试剂盒是功能最强大的一个试剂盒。

6-FAM dye: CSF1PO, D7S820, D8S1179, D21S11

VIC dye: D2S1338, D3S1358, D13S317, D16S539, TH01

NED dye: D18S51, D19S433, TPOX, vWA

PET dye: Amelogenin, D5S818, FGA

特点：

（1）单管同时扩增16个位点，包括15个STR个体识别位点以及一个性别鉴定位点Amelogenin

（2）实验流程简单，一个反应管，一次进样，一个泳道分析

（3）采用与其他试剂盒完全相同的引物序列，不同试剂盒的结果具有可比性

（4）五色荧光技术，在维持扩增产物大小不变的条件下，有效提高了单个泳道分辨的片段

数

（5）最大扩增产物小于350碱基，扩增容易，峰高均一

（6）提供完整的解决方案，由试剂、仪器、软件、技术支持等构成完整的体系

2、Yfiler PCR扩增试剂盒

英文名称： AmpF/STR® Yfiler® PCR Amplification Kit

产品概述AmpF STR Yfiler PCR扩增试剂盒是一种能在单个PCR反应中复合扩增Y染色体上的17个STR基因座的STR分析试剂盒。该试剂盒包含了被定义为欧洲小单倍型的核心基因座，以及由DNA分析方法科学工作组（SWGDAM）所推荐的位点和另外六个高度多态性基因座，提高了Yfiler试剂盒单倍型分析的识别能力。

特点：

（1）单管同时扩增17个Y染色体STR位点

（2）试验流程简单，一个反应管，一次进样，一个泳道分析

（3）五色荧光技术，有效提高了单个泳道分辨的片段数

（4）最大扩增产物小于350碱基，扩增容易，峰高均一

（5）不和女性DNA反应，适用于混合斑等检材的检验

（6）灵敏度高，在混合样品中含有多量的女性DNA也可测到男性的基因型在男性家系排查和亲缘关系分析中有独特的作用

3、STR MiniFiler PCR扩增试剂盒

英文名称： AmpF/STR® MiniFiler™PCR Amplification Kit

产品概述： STR MiniFiler PCR扩增试剂盒是世界上第一个为法医案件样本设计的商品化小片段STR扩增试剂盒.通过革新引物设计,改进PCR扩增条件和优化缓冲体系,MiniFiler 试剂盒可以提供更灵敏,更完整的DNA分型结果.与其他AMPF STR系列的试剂盒相比,MiniFiler 试剂盒更能提高疑难案件样本的识别能力,从而使更多涉及犯罪和失踪人员的案件得以解决.包含Identifiler试剂盒中片段最大、最难扩增的8个基因座：D13S317、D7S820、D2S1338、 D21S11、D16S539、D18S51、CSF1PO和FGA，同时含有Amelogenin基因座，可以进行性别检验。

特点：

（1）使用五色荧光标记技术

（2）能克服法医学样本中常见的抑制物如血红素和腐殖酸的影响

（3）能补充AmpF STR Identifiler,Profiler Plus,Profiler Plus ID,Cofiler,Sefiler和SGM Plus PCR （4）试剂盒扩增所丢失的信息，使得原本扩增失败或等位基因丢失的大片段基因座得到检验

（5）低至125pg的模板DNA也能获得完整的分型图谱具有较高的个体识别能力

（6）对于陈旧骨骼、腐败样本和其它困难生物检材有独特的作用

（7）为疑难样本的STR扩增提供最佳结果。

4、Sinofiler 16位点STR荧光检测试剂盒

英文名称： AmpF/STR® Sinofiler™PCR Amplification Kit

美国ABI公司根据中国人群的特点，开发研制了Sinofiler试剂盒,该系统与Identifiler体系相比,不再含有多态性不理想的THO1和TPOX两个基因座,而用D12S391、D6S1043基因座取而代之。

特点：

（1）单次PCR反应同时扩增15个STR基因座及Amelogenin性别基因

（2）本试剂盒含有AmpF/STR® Identifiler® PCR扩增试剂盒所扩增的13个基因座，以及在中国人群中能提供较多信息的D6S1043 和D12S391基因座