基因定位与克隆

Neurofibroma, NF1 RFLP
Ⅲ
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4.7 kb 3.0 kb
连锁分析
Ⅰ
1 2
Ⅱ
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Neurofibroma, NF1 RFLP
Ⅲ
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连锁分析
1955， 1955，Morton: 优势对数法 (Lod)
+3表示连锁存在 +3表示连锁存在 -2表示连锁不存在
定位克隆
定位克隆(positional cloning)是将遗 定位克隆 是 传病或发育异常畸形与相关表型之间， 传病或发育异常畸形与相关表型之间，和 由这些突变失活的基因所编码的特定蛋白 质之间联系起来， 质之间联系起来，而提供的一种基因定位 克隆方法。 克隆方法。
定位克隆
定位克隆的等级
应用细胞遗传学或连锁分析方法将基 因定位于染色体的特定区域 从该区域内所有可能的候选基因中确 定正确的基因
原位杂交技术
原位杂交(In 原位杂交(In Site Hybridization，ISH)：利 Hybridization，ISH)： 用同位素标记的DNA 探针 用同位素标记的 DNA探针 ， 与玻 探针， 片上的中期染色体进行杂交。 片上的中期染色体进行杂交 。 是 一种直接进行基因定位的方法。 一种直接进行基因定位的方法。
基因定位(gene mapping)： 基因定位(gene mapping)：利用一定 的方法将一个基因确定到染 色体上的实际位置上。 色体上的实际位置上。 基因克隆(gene cloning)： 用一定的 基因克隆 ： 方法把不同位点上的基因分 离出来。 离出来。
连锁分析
连锁分析(linkage analysis)： 连锁分析(linkage analysis)：利用被定位的 基因与在同一染色体上另一遗传座 位相连锁的特点， 位相连锁的特点 ， 将该基因定位在 某一染色体或染色体某一区带上。 某一染色体或染色体某一区带上。
候选克隆
定位候选克隆
GDB或GenBank 或 已知的基因或EST 已知的基因或 与疾病关系
确定致病基因
候选克隆
功能候选克隆
已知基因 GDB或GenBank 或 已定位的疾病 与该基因关系 确定致病基因
本章节重点
定位克隆
定位克隆的基本方法和步骤
收集家系， 收集家系 ， 选择遗传标记进行连锁分 析，对目的基因作图定位 确定候选位置， 确定候选位置 ， 对目的基因进行精细 定位 从候选基因中确定正确的基因
用定位克隆法鉴定的致病基因
年代
1986
疾病
慢性肉芽肿瘤 Duchenne 肌营养不良 视网膜母细胞瘤 囊性纤维变性 Wilms瘤 Wilms瘤 神经纤维瘤Ⅰ 神经纤维瘤Ⅰ型 睾丸决定因子(TDF) 睾丸决定因子(TDF) 无脉胳膜症 脆性X 脆性X综合征 家族性结肠息肉症 Kallmann综合征 Kallmann综合征 无虹膜症 肌强直性肌营养不良 Lowe综合征 Lowe综合征
年代
1996
疾病
Friedreich共济失调 Friedreich共济失调 进行性肌阵挛癫痫 长QT综合征(11号染色体) QT综合征 号染色体 综合征(11号染色体) Werner综合征 Werner综合征 X连锁视网膜色素变性(RP3) 连锁视网膜色素变性(RP3) 多囊肾病2 多囊肾病2型 基底细胞痣综合征 无汗型外胚层发育异常 血色病 Chediak-Higashi综合征 Chediak-Higashi综合征 青年的成年期发病型糖尿病 (MODY)(12号染色体 (MODY)(12号染色体) 号染色体)
体细胞杂交
体细胞杂交
异核细胞
体细胞杂交
合核细胞 杂种细胞
体细胞杂交
两个同种的动物细胞融合后形成的杂 种细胞， 细胞核一般保留双亲的染色体； 种细胞 ， 细胞核一般保留双亲的染色体 ； 不同种动物的细胞融合后， 不同种动物的细胞融合后 ， 细胞核含有双 亲的的染色体， 但随着增殖传代的过程， 亲的的染色体 ， 但随着增殖传代的过程 ， 会出现保留一方染色体， 会出现保留一方染色体 ， 另一方染色体逐 渐丢失的现象。 渐丢失的现象。
Ⅲ
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EcoR EcoRⅠ 3.0 kb
EcoR EcoRⅠ 1.7 kb
EcoR EcoRⅠ
探针
连锁分析
Ⅰ
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Ⅱ
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Neurofibroma, NF1 RFLP
Ⅲ
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3.0 kb 4.7 kb
1.7 kb
连锁分析
Ⅰ
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Ⅱ
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体细胞杂交
微细胞融合( 微细胞融合(microcell fusion)
人工建立的仅含有一条人类染色体 的杂种细胞， 微细胞， 的杂种细胞 ， 即 微细胞 ， 再与啮齿类细 胞进行融合。 胞进行融合。
体细胞杂交
区域定位(regional 区域定位(regional assignment)
依据染色体结构畸变的特点， 依据染色体结构畸变的特点 ， 建立 只含有特殊的部分人类染色体的杂种细 胞，再与啮齿类细胞进行融合。 再与啮齿类细胞进行融合。
血型，血清蛋白，HLA 血型，血清蛋白， DNA RFLP DNA STR & DNA VNTR SNP
遗传标记
重组值＝ 0：10个减数分裂 10个减数分裂 重组值＝ 重组值＝0.3：85个减数分裂 重组值＝0.3：85个减数分裂
连锁分析
连锁分析
Ⅰ
1 2
Ⅱ
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Neurofibroma, NF1 RFLP
体细胞杂交
辐射杂种(radiation 辐射杂种(radiation hybrid)
用含有辐射切割的人类染色体片段 的细胞与啮齿类细胞融合产生的杂种克 隆细胞。 隆细胞。
1975年 Goss和Harris提出 1975年，Goss和Harris提出 1990年 Cox构建单染色体杂种细胞 1990年，Cox构建单染色体杂种细胞 1994年 Walter建立全基因组放射杂种 1994年，Walter建立全基因组放射杂种
定位克隆
Met A A Met Val Ser Leu Gln Pro
T G G T C T C A C T G C A A C C G
T G G Val T C T Ser C A C Leu T G T Stop A A C C G
候选克隆
候选克隆(candidate cloning)是一种 候选克隆 是 用定位和非定位的信息相结合来克隆致病 基因，即根据一些基因的位置、表达、功 基因，即根据一些基因的位置、表达、 能或同源性相结合鉴定候选基因的方法。 能或同源性相结合鉴定候选基因的方法。
HAT选择系统 HAT选择系统
1962，人类HPRT 1962，人类HPRT1964，小鼠TK 1964，小鼠TKH：次黄嘌呤(hypoxanthine) 次黄嘌呤(hypoxanthine) A：氨基喋呤(Aminopterin) 氨基喋呤(Aminopterin) T：胸腺嘧啶(Thymidine) 胸腺嘧啶(Thymidine)
原位杂交技术
原位杂交技术
荧光原位杂交(FISH)： 荧光原位杂交 (FISH) ： 用特殊的荧光素标记 DNA探针 DNA 探针 ， 与玻片上的染色体 探针， 或细胞组织标本进行杂交。 或细胞组织标本进行杂交。
原位杂交技术
网络定位
http://www.ncbi.nlm.nih. http://www.ncbi.nlm.nih.gov http://genome.ucsc. http://genome.ucsc.edu
医学遗传学
基因定位与克隆
本章节重点
基因定位和基因克隆的概念 连锁分析 遗传标记 基因克隆的策略
基因定位(gene mapping)： 基因定位(gene mapping)：利用一定 的方法将一个基因确定到染 色体上的实际位置上。 色体上的实际位置上。
1911年 Wilson将红绿色盲基因定位 1911年，Wilson将红绿色盲基因定位 到X染色体 1968年 Duffy血型基因定位于 1968年，Duffy血型基因定位于1号染 血型基因定位于1 色体
遗传标记
用连锁分析法进行基因定位时需要 的一些已知遗传位点， 的一些已知遗传位点 ， 这些位点应按孟 德尔方式遗传， 德尔方式遗传 ， 且具有多态性以便显示 连锁关系， 这些标记位点称为遗传标记 连锁关系 ， 这些标记位点称为 遗传标记 （genetic marker）。 marker）
遗传标记
连锁分析
多点连锁定位
利用三点杂交法 利用三点杂交法(three point crosses)， 三点杂交法 ， 可将某一致病基因定位于遗传标记的框架 内，更精确的进行基因定位。 更精确的进行基因定位。
多点连锁定位
子代类型 ABC/abc abc/abc ABc/abc abC/abc aBC/abc Abc/abc AbC/abc aBc/abc 重组位置 非重组体 (A，B) –× - C (A， A – × – (B，C) (B， (A， B – × – (A，C) 数 目 853 5 47 95
连锁分析
连锁分析
连锁分析
连锁分析
连锁分析
连锁分析
重组值(recombination fraction)： 重组值 (recombination fraction) ： 是基 因定位时两个基因间遗传图距的 量度，即基因间的遗传距离。 量度，即基因间的遗传距离。 厘摩(centimorgan， 厘摩(centimorgan，cM)
体细胞杂交
体细胞杂交(somatic 体细胞杂交(somatic cell hybridization) 又称细胞融合 又称细胞融合(cell fusion)，是将两个同种和/ 细胞融合(cell fusion)，是将两个同种和/ 或不同种的细胞融合成一个新细胞， 或不同种的细胞融合成一个新细胞 ， 即 杂种 细胞(hybrid cell)。 细胞(hybrid cell)。 病毒诱导的细胞融合—— 病毒诱导的细胞融合——仙台病毒 ——仙台病毒 化学融合技术——聚乙二醇(PEG) 化学融合技术——聚乙二醇(PEG) ——聚乙二醇 电融合技术—— 电融合技术——电穿孔法 ——电穿孔法
HAT选择系统 HAT选择系统
TK－ HPRT－
HAT选择系统 HAT选择系统
TK－ HPRT－
HAT选择系统 HAT选择系统
体细胞杂交
TK: chromosome 17
杂种细胞克隆嵌板
Hybrid clone A B C Human chromosome 1 + + + 2 + + 3 + + 4 + 5 + + 6 + 7 + 8 -
基因克隆
基因克隆(gene cloning)： 用一定的 基因克隆 ： 方法把不同位点上的基因分 离出来。 离出来。
功能克隆
功能克隆(functional cloning)是先研 功能克隆 是 究相关基因的功能，再定位克隆该基因。 究相关基因的功能，再定位克隆该基因。 血红蛋白病
HbS —— 血红蛋白缺陷 血红蛋白缺陷(1949) —— β链 Glu6Val 链 —— 11p(70年代 年代) 年代 GAG → GTG
年代
1993
疾病
Menkes病 Menkes病 X连锁无丙种球蛋白血症 肾上腺白质营养不良 神经纤维瘤Ⅱ 神经纤维瘤Ⅱ型 Huntington病 Huntington病 Von Hippel-Lindou病 Hippel-Lindou病 脊髓小脑性共济失调Ⅰ 脊髓小脑性共济失调Ⅰ型 Wilson病 Wilson病
1989 1990
1991
1994
结节硬化症 多囊肾病1 多囊肾病1型 Wiscott-Aldrich综合征 Wiscott-Aldrich综合征 早发性乳腺癌/卵巢癌 (BRCA1 (BRCA1) 先天性肾上腺发育不良
Biblioteka Baidu
1992
用定位克隆法鉴定的致病基因
年代
1995
疾病
点状软骨发育不全 肢带肌营养不良 眼白化病 毛细血管扩张性共济失调 Alzheimer病 14号染色体 Alzheimer病(14号染色体) 号染色体) Alzheimer病 号染色体) Alzheimer病(1号染色体) 低磷酸盐血性佝偻病 遗传性多发性外生骨疣 Bloom综合征 Bloom综合征