基因图位克隆的策略与途径
图位克隆的基本原理和方法常用资料
基因图位克隆的详细流程与注意事项
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植物基因的图位克隆
植物基因的图位克隆关键词：植物基因、图位克隆、基因功能、实验流程、挑战与解决方案引言随着生物技术的不断发展，对植物基因功能的研究已成为农业、生态学等领域的重要课题。
图位克隆技术作为一种前沿的基因克隆方法，已在许多植物基因的研究中发挥重要作用。
本文将详细介绍植物基因图位克隆的技术原理、应用及面临的挑战和解决方案。
主体部分一、植物基因图位克隆的技术原理和应用植物基因图位克隆是一种基于基因组图谱的基因克隆技术，其基本原理是在基因组图谱中找到与目标基因相关的DNA片段，然后通过分子生物学方法克隆出该基因。
该技术在植物基因功能研究中的应用主要体现在以下几个方面：1、揭示基因与表型特征之间的关系：通过图位克隆技术，科学家们可以克隆出与特定表型特征相关的基因，进而研究其功能和作用机制。
2、发掘抗逆基因资源：植物在逆境条件下常常表现出独特的适应性，图位克隆技术可以帮助我们克隆这些抗逆基因，为作物改良提供宝贵资源。
3、解析植物发育过程中的关键基因：通过图位克隆技术，可以克隆出植物发育过程中发挥关键作用的基因，深入研究其调控网络和作用机制。
二、植物基因图位克隆的实验流程和操作植物基因图位克隆的实验流程包括以下几个主要步骤：1、样本采集：根据研究目标和实验需求，采集不同类型和不同发育阶段的植物组织样本。
2、基因的筛选：利用生物信息学方法和基因组图谱，筛选出与目标表型特征或生理特性相关的候选基因。
3、定位分析：对候选基因进行定位，可以通过比较基因组序列、染色体构象信息等手段，确定目标基因在染色体上的位置。
4、基因克隆：根据定位结果，设计特异性引物，采用PCR等分子生物学方法，克隆出目标基因的完整序列。
5、功能验证：通过转录组分析、蛋白表达及互作等实验手段，验证目标基因的功能及其在植物生长发育和抗逆过程中的作用。
三、植物基因图位克隆的挑战和解决方案尽管植物基因图位克隆技术已取得许多突破性成果，但在实际应用中仍面临一些挑战，如基因表达水平低、基因组规模大等。
基因图位克隆的策略与途径
基因图位克隆的策略与途径拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种模式植物，具有基因组小（125 Mbp）、生长周期短等特点，而且基因组测序已经完成（The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000）。
同时，拟南芥属十字花科（Cruciferae），具有高等植物的通常特点，拟南芥研究中所取得成果很容易用于其它高等植物包含农作物的研究，产生重大的经济效益，特别是十字花科中还有许多重要的经济作物，与人类的生产生活密切有关，因此目前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物学及各国政府的重视。
基因(gene)是遗传物质的最基本单位,也是所有生命活动的基础。
不论要揭示某个基因的功能,还是要改变某个基因的功能,都务必首先将所要研究的基因克隆出来。
特定基因的克隆是整个基因工程或者分子生物学的起点。
本文就基因克隆的几种常用方法介绍如下。
1、图位克隆Map-based cloning, also known as positional cloning, first proposed by Alan Coulson of the University of Cambridge in 1986, Gene isolated by this method is based on functional genes in the genome has a relatively stable loci, in the use of genetic linkage analysis or chromosomal abnormalities of separate groups will queue into the chromosome of a specific location, By constructing high-density molecular linkage map, to find molecular markers tightly linked with the aimed gene, continued to narrow the candidate region and then clone the gene and to clarify its function and biochemical mechanisms.用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先明白基因的DNA序列，也无需预先明白其表达产物的有关信息。
图位克隆
序列(CAPS)，它也是基于PCR 的。
另外，一种更为有效的方法衍生的CAPS (dCAPS) (Michaels and Amasino,1998; Nam et al., 1989)可把任何已知的点突变 作为分子标记，只要在PCR 时引入不配对 的引物，使扩增的序列在一个生态型中具 有限制性酶切位点，而在另一生态型中没 有，以形成多态性。
2.4 目的基因的筛选和鉴定
筛选和鉴定目的基因是图位克隆技术的最后一个 关键环节。当一旦找到与目的基因紧密连锁的分 子标记并鉴定出分子标记所在的大片段克隆后， 就可以利用该克隆为探针进行染色体步移，逐渐 靠近目的基因。
染色体步移是指利用已知的阳性克隆称为 “二次克隆”，如此反复即可取到所需要的克隆，获 得目的基因。染色体步移的主要局限在于当必须经过 一个无法克隆的片段时，步移的过程会被打断；当克 隆的一端是重复序列时，步移的方向会发生偏差。为 克服这些弊端，Tanksley 等(1995)又发展了染色体登 陆的方法。
2.粒是一种含有噬菌体的Cos 位点的质粒载 体， 大小在5~7Kb 左右， 可高效地克隆25~35Kb 的DNA 片段。人工染色体的插入片段最长可达 2Mb 左右，能够覆盖完整的真核基因，最早发展 的人工染色体是YAC。所以当要克隆大片段DNA 时，需要YAC 作载体。以YAC 为载体，可将 300~1 000Kb 的DNA 片段克隆。因此，以YAAC、PAC 等几 种以细菌为寄主的载体系统。
1 图位克隆技术的原理
功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座， 在利用分子标记技术对目的基因精细定位的基础 上，用id 等)，从 而构建基因区域的物理图谱，再利用此物理图谱 通过染色体步移(chromosome walking) 逼近目的 基因或通过染色体登陆(chromosome landing) (Tanksley et al., 1995)方法最后找到包含有该目 的基因的克隆，最后经遗传转化试验证实目的基 因功能。
植物基因克隆的策略及方法
植物基因克隆的策略及方法首先，PCR是植物基因克隆的重要策略之一、PCR（聚合酶链反应）是一种体外复制DNA片段的方法，可以在短时间内扩增大量的特定DNA序列。
通过PCR可以快速准确地克隆植物基因。
PCR的基本原理是利用DNA 聚合酶酶学合成原理，在DNA片段两侧设计引物，将其与DNA片段的两侧结合，在适当的条件下进行DNA的聚合酶链反应，从而扩增目标基因。
PCR方法主要包括加热解性、引物连接、扩增和酶切等步骤。
其次，限制性酶切也是植物基因克隆的重要方法。
限制性酶切是指利用特定的限制性酶将DNA分子切割成特定序列的片段。
通过限制性酶切，可以将目标基因从植物DNA中剪切出来，然后进行进一步处理。
限制性酶切的基本原理是将特定的限制性酶加入反应体系中，该酶能识别和切割DNA的特定序列，从而将目标基因从DNA中剪切出来。
限制性酶切方法主要包括选择合适的限制性酶、反应条件的优化、酶切产物的回收和检测等步骤。
连接是植物基因克隆的另一种重要方法。
连接是指将目标基因连接到特定的载体DNA上，以便在目标植物中稳定地表达。
连接方法主要包括两个步骤：首先，需要处理载体DNA和目标基因的末端，以便它们能够相互连接；其次，利用DNA连接酶将载体和目标基因连接起来。
连接步骤中的处理涉及到DNA末端的修饰和处理，可以通过多种方法如限制性内切酶切割、引物扩增、酶切等进行。
最后，转化是植物基因克隆的最后一步。
转化是指将连接好的目标基因插入到目标植物的基因组中，使其能够在植物体内稳定表达。
转化的方法有多种，包括农杆菌介导的转化、基因枪转化、电穿孔转化等。
其中，农杆菌介导的转化是最常用的方法之一、农杆菌介导的转化是利用农杆菌作为载体将外源DNA导入到目标植物细胞中，通过农杆菌的自然寄生习性以及在植物细胞中特定的植物基因的活性表达，实现目标基因的稳定表达。
总的来说，植物基因克隆的策略和方法包括PCR、限制性酶切、连接和转化。
通过这些方法，可以快速准确地克隆植物基因，实现对植物遗传特性的改变和优化，为农业生产和植物遗传研究提供有力的技术支持。
图位克隆的基本原理和方法
r/r
R/R
P1 纯合突变体
×
P2 ZS97
F1
R/r
F2
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R/r
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primary mapping method
Bulked Segregment Analysis：群组分离分析法。原理是将分 离群体(F2、BC1等)中的个体依据研究的目标性状(如抗病、 感病)分成两组，每一组取样8-15份，在每一组群体中将各个 体DNA等量（等浓度等体积）混合，形成两个DNA池(如抗 病池和感病池)。同时需要构建两个亲本（ZH11/ZS97）的 BSA池。由于分组时仅对目标性状进行选择，因此两个池间 理论上就应主要在目标基因区段存在差异。
精细定位
• 扩大群体，进行精细定位
Complementation test
找到候选基因后可对候选基因进行分析以排除非目标基因， 可以通过比较扩增，测序，表达量检测及目标性状相关的 生化和生理途径等方法来排除。当然最后要说明问题的话 就是构建互补载体做一个互补验证。
将构建的BSA池分别用本室的255对在亲本ZH11/ZS97间存在多态性的SSR标 记进行PCR扩增，经过跑PAGE胶找到与目标性状紧密连锁的标记。
HL15(M )
HL15(W ) ZS97
ZH11
HL15(M ) HL15(W ) ZS97
ZH11
HL15(M) HL15(W) HY5(M) HY5(W) HY3(M) HY3(W) HY2(M) HY2(W) HY1(M) HY1(W) ZS97 ZH11
图位克隆的基本原 理和方法
何宗顺 2011.12.7
图位克隆的基本原理
其基本的原理是： 功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座，通过找到 与目标性状紧密连锁的分子标记，在利用分子标记技术对 目的基因精细定位的基础上，由于水稻全基因组序列的发 布，我们可以得到已定位区段的候选基因，通过对候选基 因进行分析，确定目标基因，最后经遗传转化试验证实目 的基因功能。
文档图位克隆原理及应用
位克隆技术的原理及其在分离玉米基因中的应用刘朝显2010.11.3 2 内容摘要图位克隆技术的基本原理1 图位克隆的技术环节 2 图位克隆在分离玉米基因中的应用 3 一. 图位克隆技术的基本原理 1. 图位克隆（Map-based cloning）: 定位克隆（position cloning）,1986 年首先由剑桥大学的Alan coulson 提出。
正常遗传学 2. 基本原理：根据功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座，在利用分子标记技术对目的基因精细定位的基础上，用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选DNA文库，通过染色体步移(chromosome walking)逼近目的基因或通过染色体登陆(chromosome landing)方法最后找到包含有该目的基因的克隆，最后经遗传转化试验证实目的基因功能。
3 3. 图位克隆技术的优越性与局限性优点：不需要事先了解目的基因的表达产物，这为克隆许多有重要经济价值的农作物基因提供了有效的手段，因为这些基因的产物大多都是未知的。
缺点：基因组中的重复序列导致染色体步移困难，甚至将步移引入歧途。
4 一. 图位克隆技术的基本原理 4. 图位克隆示意图 5 一. 图位克隆技术的基本原理M1 M2 Gene 连锁标记的筛选M1 M2 Gene 初定位M3 M2 Gene 精细定位M3 M4 M5 M6 M7 M8 合成探针筛选基因组文库转基因功能验证BSA，NIL 300左右5000左右二. 图位克隆的技术环节 6 1.定位群体的构建⑴亲本选择原则:选择高度纯合，遗传差异大，DNA多态性丰富的亲本（实现基因精细定位的重要前提）可选用多个亲本进行多态性筛选⑵定位群体的组配：基因的定位是基于分离后代中交换单株出现的频率大小而实现的，因此组配一个遗传信息多群体大小适中的分离群体尤其重要。
BC1,F2 非永久性群体群体类型RIL,DH，NIL 永久性群体 2. 初定位(玉米：100-350株) 近等基因系（near-isogenic line,NIL ）法: 近等基因系是指几乎仅在目标性状上存在差异的两种基因型个体, 这可通过连续回交的途径获得。
目的基因克隆[方案]
![目的基因克隆[方案]](https://img.taocdn.com/s3/m/17a5319082d049649b6648d7c1c708a1284a0a9b.png)
一、目的基因克隆的策略有哪些？其理论依据什么？如何根据具体条件，如目的性状的特点，已知控制目的性状的基因的信息合理选择基因克隆的方法？1、主要有以下几个克隆的策略：（1）PCR法分离目的基因：从蛋白质的一级序列分析得到核酸序列的相关信息，设计简并引物，通过对mRNA进行反转录得到cDNA，以cDNA为模板，然后将目的基因通过PCR方法扩增，或者直接从基因组DNA扩增的方法。
（2）核酸杂交的方法：通过对蛋白质的氨基酸序列分析，设计简并引物，通过核酸杂交的方法从基因文库中筛选得到目的基因。
（3）免疫学筛选法分离目的基因：利用免疫学原理，通过目的蛋白的特异抗体与目的蛋白的专一结合，从表达文库中分离目的蛋白基因。
2、若控制该性状的目的蛋白质不容易分离纯化，这PCR方法比较适宜，若蛋白质分离纯化容易，且有现成的基因文库，则后两种方法较为简单。
二、蛋白组学方法克隆目的基因的理论依据是什么？有哪些技术环节？要用到哪些技术？1、理论依据：以分离纯化的目的蛋白为研究起点，通过对目的蛋白的一级结构分析，获得起码的氨基酸序列信息后，反推可能的DNA序列，然后设计引物，从cDNA中将目的基因扩增出来，或者设计核酸探针，通过杂交技术将目的基因从基因文库中筛选出来。
或通过抗体抗原免疫反应从表达文库中将该基因分离出来。
2、技术环节是确定并制备出高纯度的蛋白质。
3、所需要的实验技术有：蛋白质的双向电泳技术，由第一向的等电聚焦电泳和第二向的SDS-PAGE电泳组成；蛋白质氨基酸序列分析。
三、基因组学方法克隆基因的策略有哪些？各有什么特点？如何选择恰当的基因组学方法克隆目的基因？1、基因文库筛选方法通过对基因文库的筛选将目的基因分离出来，一般有两种方法：核酸杂交法，原理是分子杂交；PCR筛选法，通过ＰＣＲ方法将目的基因分离出来，对于以混合形式保存的文库，先将文库分成几份，每份为一个“反应池”进行PCR反应，待选出阳性池后，将阳性池的混合克隆稀释，然后等量分置96孔板中，进行横向池及纵向池的ＰＣＲ反应，然后将阳性菌落群进行稀释，重复上述工作，直到筛出阳性单克隆。
基因克隆的几种常见方法
基因克隆得几种常见方法基因(ge ne)就是遗传物质得最基本单位，也就是所有生命活动得基础。
不论要揭示某个基因得功能，还就是要改变某个基因得功能,都必须首先将所要研究得基因克隆岀来。
特定基因得克隆就是整个基因工程或分子生物学得起点。
本文就基因克隆得儿种常用方法介绍如下。
1根据已知序列克隆基因对已知序列得基因克隆就是基因克隆方法中最为简便得一种。
获取基因序列多从文献中查取，即将别人报道得基因序列直接作为自己克隆得依据。
现在国际上公开发行得杂志一般都不登载整个基因序列，而要求作者在投稿之前将文章中所涉及得基因序列在基因库中注册，拟发表得文章中仅提供该基因在基因库中得注册号Gcc e ssion number)，以便别人参考与查询。
目前，世界上主要得基因库有1 ) EMBL,为设在欧洲分子生物学实验室得基因库，其网上地址为；(2)Genbank,为设在美国国家卫生研究院(NIH )得基因库，其网上地址为；(3)Sw i ssport与T REMBL, Swissport就是一蛋白质序列库，其所含序列得准确度比较高，而TREMB L只含有从EMB L库中翻译过来得序列。
U前，以Genba nk得应用最频繁。
这些基因库就是相互联系得，在Genbank注册得基因序列，也可能在Swisspo r t注册。
要克隆某个基因可首先通过In t e r net查询一下该基因或相关基因就是否已经在基因库中注存。
查询所有基因文库都就是免费得，因而极易将所感兴趣得基因从库中拿岀来，根据整个基因序列设计特异得引物，通过PC R 从基因组中克隆该基因，也可以通过RT-PCR克隆cDNA。
值得注意得就是，由于物种与分离株之间得差异，为了保证PCR扩增得准确性，有必要采用两步扩增法，即ne s ted PCR。
根据蛋口质序列也可以将编码该蛋口质得基因扩增出来。
在基因文库中注册得蛋口质序列都可以找到相应得D NA或cDN A序列。
如蛋口质序列就是自己测定得，那么需要设计至少1对简并引物(degenerated p rime r ),从cDNA文库中克隆该基因。
图位克隆的基本原理和方法-PPT课件
将构建的BSA池分别用本室的255对在亲本ZH11/ZS97间存在多态性的SSR标 记进行PCR扩增，经过跑PAGE胶找到与目标性状紧密连锁的标记。
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HL15(M )
HL15(W ) ZS97
ZH11
HL15(M ) HL15(W ) ZS97
ZH11
HL15(M) HL15(W) HY5(M) HY5(W) HY3(M) HY3(W) HY2(M) HY2(W) HY1(M) HY1(W) ZS97 ZH11
找到紧密连锁的分子标记之后我们就要进行一个“阳性”检测： 即检测这个找到的分子标记是不是真正的与目标性状连锁。 我们对F2代群体中随机选取一个200左右的小群体，将找到的分 子标记分别扩增这些样，看表型与基因型是否对应。 同时我们可以用这个小群体进行一个初步的基因定位。
9
一. 表型观察
Fine mapping
4
作图群体
将纯合突变体与ZS97进行杂交，对杂交的种子进行基 因型鉴定，找到杂合型种子（即种子能够发生分离）， 将杂合F1代种子种下去后就能得到F2代群体。
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P1 纯合突变体
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primary mapping method
Bulked Segregment Analysis：群组分离分析法。原理是将分 离群体(F2、BC1等)中的个体依据研究的目标性状(如抗病、 感病)分成两组，每一组取样8-15份，在每一组群体中将各个 体DNA等量（等浓度等体积）混合，形成两个DNA池(如抗 病池和感病池)。同时需要构建两个亲本（ZH11/ZS97）的 BSA池。由于分组时仅对目标性状进行选择，因此两个池间 理论上就应主要在目标基因区段存在差异。
图位克隆原理
图位克隆原理图位克隆（Positional Cloning）是一种重要的分子生物学技术，它是通过对特定基因的物理位置进行定位，从而实现对该基因的克隆和研究。
图位克隆技术的原理是基于遗传连锁和物理定位相结合的方法，可以帮助科学家们找到与特定性状或疾病相关的基因。
在图位克隆的过程中，首先需要通过遗传连锁分析确定目标基因的大致位置，然后利用物理定位技术进一步缩小目标基因的范围，最终实现对目标基因的克隆。
下面将详细介绍图位克隆的原理和步骤。
1. 遗传连锁分析。
遗传连锁分析是通过观察不同基因之间的遗传连锁关系，确定目标基因在染色体上的大致位置。
这一步骤通常利用家系分析和连锁图谱构建等方法，确定目标基因与已知标记基因之间的遗传距离和连锁关系。
通过这一步骤，可以初步确定目标基因所在的染色体和染色体区域。
2. 物理定位技术。
物理定位技术是利用分子标记和染色体显微操作等方法，对目标基因进行更精确的定位。
这一步骤通常利用分子标记的特异性杂交和染色体行为的特征等，进一步缩小目标基因的范围，最终确定目标基因的具体位置。
物理定位技术的发展使得科学家们能够更加精确地定位和克隆目标基因。
3. 克隆目标基因。
通过遗传连锁分析和物理定位技术，科学家们可以确定目标基因的大致位置和具体范围，从而利用克隆技术对目标基因进行克隆。
克隆技术通常包括构建基因文库、筛选目标基因、进行测序和功能分析等步骤，最终实现对目标基因的克隆和研究。
总结。
图位克隆技术是一种重要的分子生物学技术，它通过遗传连锁分析和物理定位技术，实现对目标基因的精确定位和克隆。
图位克隆技术的发展为科学家们研究特定性状和疾病相关基因提供了重要的工具和方法。
随着分子生物学和基因工程技术的不断发展，图位克隆技术将在基因定位和克隆研究中发挥越来越重要的作用。
基因图位克隆的原理及应用
基因图位克隆的原理及应用1. 是什么？为何被广泛应用？基因图位克隆是一种常用的分子生物学技术，通过此技术可以将感兴趣的DNA 片段嵌入到目标向量中，并使其稳定地复制和表达。
这种方法被广泛应用于基因功能研究、基因工程、疾病诊断和治疗等领域。
2. 基因图位克隆的原理基因图位克隆的原理主要包括以下几个步骤：步骤一：选择目标向量和宿主细胞目标向量是用来接收外源DNA片段的载体，宿主细胞是容纳目标向量并使其复制和表达的细胞。
常用的目标向量包括质粒、病毒和人工染色体等。
步骤二：限制性内切酶切割目标向量和DNA片段通过使用限制性内切酶，将目标向量和DNA片段进行切割。
切割后的目标向量具有黏性末端，DNA片段的末端与之相互互补。
步骤三：连接目标向量和DNA片段将切割后的目标向量和DNA片段进行连接。
由于末端互补性，它们能够形成稳定的连接。
步骤四：转化宿主细胞将连接好的目标向量转化到宿主细胞中。
转化方法可以采用化学转化、热冲击法或电穿孔法等。
步骤五：筛选和鉴定通过选择适当的筛选标记或报告基因，选择出转化成功的宿主细胞。
并通过PCR、限制性内切酶切割或测序等方法对目标基因进行鉴定。
3. 基因图位克隆的应用基因图位克隆技术有着广泛的应用，以下是其中几个常见的应用领域：(1) 基因功能研究通过将外源基因或片段插入到目标基因中，可以研究其对基因功能的影响。
通过基因图位克隆技术，研究人员可以探索基因的结构和功能，揭示其与生物过程和疾病发生发展之间的关系。
(2) 基因工程基因图位克隆技术被广泛用于基因工程领域，用于构建转基因作物、转基因动物或生物制剂的制备。
通过引入特定的基因或片段，可以实现对目标生物特性的改变，从而实现农作物的抗病性、耐旱性等改良。
(3) 疾病诊断和治疗基因图位克隆技术在疾病诊断和治疗中也有广泛的应用。
通过检测某些特定基因的突变或缺失，可以帮助确定某些遗传疾病的诊断。
此外，基因图位克隆还可用于针对某些基因缺陷进行基因治疗，通过修复或替代缺陷基因来治疗疾病。
基因的图位克隆
要点
1. 克隆基因的意义
2. 基因克隆的常用策略及比较 3. 图位克隆的基本程序和以 xa13为例介绍图位克隆 的详细过程 5. 总结及展望
1.为什么要克隆基因？
克隆基因有助于我们解释基因的生物学
功能、调控模式、进化关系等。
在植物中，大部分基因的功能未知。
Tabata, S. et al. 2000, Nature 408, 796 - 815
功能进行干扰，从而证明特定序列所控制的表型。
正向遗传学：从已有的相对表型的差异开始，去分离引起表型变化的对应核苷酸序列改变。
Janny L. P. at el.2003.TRENDS in Plant Science l.8:484-491
• 基因克隆的主要方法：
• T-DNA标签法：当T-DAN导入植物基因组中，并插入基因的编码区或重要的调控区，
• 基因的抑制表达：通过降低目的基因在细胞的表达水平，
使基因的功能下降甚至消失，来研究基因的功能。
• 基因的超量表达：通过人为的重组DNA手段，在生物体细
胞中大量地、持续的表达目的基因，使目标基因的功能得到超 常发挥。 优点：目的明确，对由基因家族控制的相关形状，抑制表达能同 时降低此基因家族成员的功能；抑制表达和超表达是研究时空表 达的有力工具。
• 原理：在减数分裂︱时期，同源染色体之间配对，非姊妹染色单体发生交换，与目
标基因距离越远，发生交换的频率就越大，距离越近，发生交换的频率就越小（遗传 学第三定律）。（王亚馥，戴灼华. 遗传学.1999，第三章：60-76）与基因发生最小交 换频率的两侧分子标记，就是与基因最紧密连锁的分子标记，这两个分子标记之间的 区段就是包含这个基因的目标区段。
图位克隆
1.1 构建遗传作图群体 用于作图群体的类型可有多种。
一般说来，在这类群体中，异花授粉植物分子标记的检出率较自花授粉植物的高。
但是对于基因的图位克隆而言，培育特殊的遗传群体是筛选与目标基因紧密连锁的分子标记的关键环节。
这些遗传材料应该满足这样的条件，即除了目标基因所在座位的局部区城外，基因组DNA序列的其余部分都是相同的，在这样的材料间找到的多态性标记才可能与目标基因紧密连锁。
目标基因的近等基因系(NILs)是符合条件的一类群体。
近等基因系是指几乎仅在目标性状上存在差异的两种基因型个体，这可通过连续回交的途径获得。
由于NILs的遗传组成特点，一般凡是能在近等基因系间揭示多态性的分子标记就极有可能位于目标基因的两翼附近。
Martin等(1993)就是用RAPD技术分析番茄PTO基因的近等基因系而获得了与该基因表现共分离的分子标记，以该分子标记为探针筛选基因组文库而实现了染色体登陆。
又如在玉米上，利用AFLP技术分析玉米CMS-S型雄性不育的恢复基因及近等基因系，已获得与目标基因紧密连锁的分子标记并以其用作分离RF3基因的探针。
一般说来，当标记为显性遗传时，欲获得最大遗传信息量的F2群体，须借助于进一步的子代测验，以分辨F2中的杂合体。
为此，Michelmore等(1991)发明了分离群体分组分析法(bulked segregant analysis，BSA)以筛选目标基因所在局部区域的分子标记。
其原理是将目标基因的F2(或BC1)代分离体的各个体仅以目标基因所控制的性状按双亲的表型分为两群，每一群中的各个体DNA等量混合，形成两个DNA混合池(如抗病和感病、不育和可育)。
由于分组时仅对目标性状进行选择，因此两个DNA混合池之间理论上主要在目标基因所在局部区域的差异，这非常类似于NILs，故也称作近等基因池法。
研究表明，近等基因系法、分离群体分组分析法再结合AFLP等强有力的分子标记技术使人们能够在短时间内从数量众多的分子标记中筛选出与目标基因紧密连锁的标记。
总结(基因克隆的策略与途径)
因分析 3’ RACE 和5’ RACE 全长基因
构建转化表达载体
转基因
基因克隆的策略与途径
农杆菌介导
转基因 植物
基因枪 其它 Southern blot
表达分析
基因克隆的策略与途径 通过转基因途径进行作物的遗传性状改良 基因
已报道基因 未报道基因
PCR 反应
新基因的克隆
克隆粒载体克隆的方法
1） PCR产物：直接连接于T-Vector 载体。 2） 其它： DNA的酶切 质粒载体酶切 去磷酸化 相应DNA片段 去磷酸化后载体 重组质粒 转化 分析 back
基因分析
受体类型 感受态细胞制备 转化步骤
基因克隆蛋白质途径
目标生物
色谱等技术 等基因系或 拟等基因系
纯化的蛋白质 特异斑点 部分氨基酸 序列测定 抗体制备 （单抗或多抗） 探针 探针
双向蛋白 质电泳
A 探针
Norththern blot Western blot
转代繁殖 性状分析
基因克隆核酸途径示 DD DNA 芯片 (RFLP) 拟等基因 系材料 其它方法 基因组DNA
植物基因克隆的策略规划与方法
植物基因克隆的策略与方法基因的克隆就是利用体外重组技术,将特定的基因和其它DNA顺序插入到载体分子中。
基因克隆的主要目标是识别、分离特异基因并获得基因的完整的全序列,确定染色体定位,阐明基因的生化功能,明确其对特定性状的遗传控制关系。
通过几十年的努力由于植物发育,生理生化,分子遗传等学科的迅速发展,使人们掌握了大量有关植物优良性状基因的生物学和遗传学知识,再运用先进的酶学和生物学技术已经克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆,育性、高蛋白质及与植物发育有关的许多基因。
我们实验室对天麻抗真菌蛋白基因作了功能克隆的研究(舒群芳等,1995;舒群芳等,1997),为了克隆植物基因也探讨了其它克隆方法,本文论述基因克隆的策略、方法及取得的一些进展。
1 功能克隆(functional Cloning)功能克隆就是根据性状的基本生化特性这一功能信息,在鉴定和已知基因的功能后克隆(Collis,1995)。
其具体作法是:在纯化相应的编码蛋白后构建cDNA文库或基因组文库,DNA文库中基因的筛选根据情况主要可用二种办法进行,(1)将纯化的蛋白质进行氨基酸测序,据此合成寡核苷酸探针从cDNA库或基因组文库中筛选编码基因,(2)将相应的编码蛋白制成相应抗体探针,从cDNA入载体表达库中筛选相应克隆。
功能克隆是一种经典的基因克隆策略,很多基因的分离利用这种策略。
Hain等从葡萄中克隆了两个编码白藜芦醇合成的二苯乙烯合成酶基因(Vst1和Vst2),葡萄中抗菌化合物白藜芦醇的存在,可以提高对灰质葡萄孢(Botrytis cinerce)的抗性,在烟草和其它一些植物中无二苯乙烯合成酶,因此克隆该基因经过转基因后,对有些植物产生对灰质葡萄孢的抗性很有意义(Hain 等,1985)。
Kondo等1989年对编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的基因组DNA做了克隆和序列分析(Kondo等,1989)。
周兆斓等构建了水稻cDNA文库,分离了编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的cDNA(周兆斓等,1996)。
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基因图位克隆的策略与途径拟南芥(Arabidopsis thaliana)是一种模式植物，具有基因组小(125Mbp ) 、生长周期短等特点，而且基因组测序差不多完成 (The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000)。
同时，拟南芥属十字花科(Cruciferae),具有高等植物的一样特点，拟南芥研究中所取得成果专门容易用于其它高等植物包括农作物的研究，产生重大的经济效益，专门是十字花科中还有许多重要的经济作物，与人类的生产生活紧密有关，因此目前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物学及各国政府的重视。
基因(gene是遗传物质的最差不多单位，也是所有生命活动的基础。
不论要揭示某个基因的功能,依旧要改变某个基因的功能,都必须第一将所要研究的基因克隆出来。
特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。
本文就基因克隆的几种常用方法介绍如下。
1 、图位克隆Map-based cloning, also known as positional cloning, first proposed b y Alan Coulson of the University of Cambridge in 1986, Gene isolated b y this method is based on functional genes in the genome has a relativel y stable loci, in the use of genetic linkage analysis or chromosomal abnor malities of separate groups will queue into the chromosome of a specific location, By constructing high-density molecular linkage map, to find mole cular markers tightly linked with the aimed gene, continued to narrow the candidate region and then clone the gene and to clarify its function and biochemical mechanisms.用该方法分离基因是按照目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先明白基因的DNA 序列，也无需预先明白其表达产物的有关信息。
它是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。
近几年来随着拟南芥基因组测序工作的完成，各种分子标记的日趋丰富和各种数据库的完善，在拟南芥中克隆一个基因所需要的努力差不多大大减少了(图1)。
目前完成整个拟南芥的图位克隆过程大约需要一年时刻。
在那个 过程中，我们从选择突变体开始，逐步找到和表型有关的基因。
这和反向 遗传学（reverse genetic9的方法正好相反。
图位克隆能实现，关键在于全 基因组测序打算的完成和各种分子标记的发觉。
这些数据被储存在专门的 数据库中（表 1）（ Lukowitz 等，2000）。
表1拟南芥网络资源网站网址Supplemental material for this paper /methods/ppsuppl.html Nottingham Stock Centre ( U.K.) /Recombinant Inbred map /new_ri_map.html Ohio Stock Center (U.S.A.) /aims/TAIR database*， homepageRecombinant Inbred map ( mirror site )CAPS markersSequence tableSNP collectionCEREON collection of polymorphismsSSLP markers/SSLP info/SSLP.htmlTIGR ， genome annotationsDatabase of Ler sequencesKasuza DNA Research Institute ， genome annotationsMIPS genome annotationshttp://websvr.mips.biochem.mpg.de/proj/thal/SINS database of transposon insertions"1995Total ■畑rV3 persod-yBar-s-2002TotH=1 porsion-yvEu-«f Q IN 样an<S vitciblM! rruricoTEOKaii<jhRftj riwj<iMj ：u*ar msarfcor iSr •"皿1曲畑Durid ptiy^ic-aJ m-np (YACta a iXZTlK 如Ptw/wMi map甘耳OffMwviorb marker fmm ¥AC* or ccMTTikdBFbrwrf ?%nJilLc mnpping20 kiap 帕石0|扁0!叭ClTic^^ M *I vunrh r 巾和叭 C«f>Kn dawhiAM.htu ONA voqu 口nee 1 tor -C4Odl<Mil« BV&MtHOGde andUrmn eftr nene? Est^i-aridingMerrily oarwSiCjate ejerwii Fwrn C«K> vwwio*(□住釣口口 «*011 tpri-nwim frewTi Cd-O, rhen aoquencaKey in FHftp«b«ft4Kli G I GHIIFTQ process Fk&t-p4a* nwpijlT'bgi 存Q烈M r*»H<i|irtwri|Gen<?r«it9 ptiyvi^Al mApCo reefer cnrdinlAtnmn 世屛 Final iriftmiifiiioaitloin ofmu 怕"dn*注：The Arabidopsis Information Resource (TAIR )在拟南芥中的图位克隆，在专门大程度上得益于对Col-0生态型测序的完成，因为它是在研究拟南芥时最常用的生态型。
实现基因图位克隆的关键是选择与目标基因连锁的分子标记。
实质上，分子标记是一个特异的DN A片段或能够检出的等位基因，对其有效地利用即可达到图位克隆基因之目的。
迄今为止，已有几十种技术可用于分子标记的选择（Wang等，2000）。
其中最为常用的是简单序列长度多态性（SSLPs）和单核苷酸多态性（SNP s）。
SSLP是基于PCR的分子标记，在拟南芥基因组中有较多分布，而且是共显性的，它的检测专门直截了当，然而我们需要设计引物来检测假定的SSLP 标记；对SNPs标记的检测也比较直截了当，它是拟南芥不同生态型之间基因组中的单个核苷酸的差不，这些差不的核苷酸通常位于非编码区域（Peters 等，2003）。
最常见的用于检测SNPs标记的方法要紧是剪切扩增多态性序列（CAPS），它也是基于PCR的。
另外，一种更为有效的方法衍生的CAPS （dCAPS）（Nam等，1989; Michaels 和Amasino，19 98）可把任何已知的点突变作为分子标记，只要在PCR是引入不配对的引物，使扩增的序列在一个生态型中具有限制性酶切位点，而在另一生态型中没有，以形成多态性。
图位克隆法随着有关配套技术（序列数据库、分子标记等）的日渐成熟，许多拟南芥及一些农作物的基因已被成功的克隆（表2）。
表2用图位克隆方法得到的拟南芥及一些农作物的基因本文拟对图位克隆的研究进展做一介绍，以期对植物遗传育种和分子生物学研究有所关心。
2图位克隆的一样过程因为有了拟南芥的基因组序列和高密度的遗传标记，图位克隆过程就变得相对直截了当。
图2例举了一种高效的拟南芥图位克隆方法。
从基于C ol-0和Ler遗传背景的突变体动身，我们有可能在大约一年时刻内找出与那个突变有关的基因，这其中要紧耗时刻的是五个植物（拟南芥）的生长周期（我们假定每个周期为两个月）。
作为作图过程的第一步，突变体植株将和另外一个生态型（Col-0或者Ler）的植株杂交。
在大多数情形下，用于杂交的突变体植株是作为父本依旧母本是没有关系的。
然后播种F1代种子。
在F1代植物的生长过程中，我们就有可能来对其表现型和基因型进行分析。
F1代植物的表型的显现或者消逝将显示着我们所研究的突变是显性的依旧隐性的。
最好通过对一些标记的分析来确认F1代植物是杂合体，而且在杂交过程中我们没有犯错误。
因此也有必要确认原先的生态型背景。
图2图位克隆过程示意图（Jander 等，2002）F1代植物自交得到F2代种子，大约播种600个个体以进行突变基因的 粗定位（first-pass mapping ,图2）。
在其生长过程中，我们可确定其表型， 大约有150个个体被认为是纯合体（在隐性突变的情形下是纯合突变体， 在显性突变的情形下是纯合野生型）。
然后从这150个个体的叶子或者其它 组织中制备DNA 用于基因型分析。
起先用分布于拟南芥五条染色体上的25个标记（相邻的两个标记之间大约相距 20 cM ）进行分析，确定突变基因 是和哪个或者哪几个标记是连锁的，然后用三点测交的方法来定义一个包 含突变基因的大约20 cM 的遗传间隔。
一旦如此的一个遗传间隔被定义之 后，接下来的工作确实是引入新的标记把那个间隔缩小到大约4 cM 。
一样来讲，利用150个F2代个体是在专门大程度上能找到如此一个遗传间隔的， 距离突变基因最近的两个分子标记将作为侧面标记而用于下面的进一步分 析。
下一步我们将播种一个更大的F2代群体用于突变基因的精细定位（fi ne-resolution mapping ，图2）。
最终目标是将包含突变基因的遗传间隔缩小 到40 Kb 甚至更小（这在拟南芥中大约是 0.16 cM ）。
明显用于作图的F2 代植物rrnjlanl CcHO*outers mu la 砒3grow rF. pla-ris, I 45grow 690 L F piardt e78grepft- 54009F ; [Marts10^progofiy fesling ：1112min m dmwild type LefH l\J F\ goneratian -------------------------d^rnirbantfiTBCiWaiW ：?consider Candida 甩 genesHrarfMM ffiao&n>g -— < 4 cM moMiM eo^BKic4, candidatetfeniiiwh £ir 訐业 丹酚锁阳 600 F ?』a 砒 CO floc 1 SO horrt!础Z 拆. Ihen flenolypeG«i KJ ypa 34MXMOOO F a p^rrts 1B frnd 204300 rocorrtbinaftte ttwi p^ienoiype in F 5ptwicrtypfl!wqutioco DNA押钢沖《cmce^Dys F aphcntMype F.IwfrMMlB maaonu _哥 M kb 伽 oiution considcFcandioale gennal ¥marHarspTi»Oty|X> FrecernbiFianflsmurktr trrurtor 2越多，就越能精确地定位突变基因。