PCR实验室标本管理、生物安全和防污染策略
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。
标本的类型和采集量
标本的类型:血清(浆)、分泌物、痰、 尿和脑脊液等。
标本的采集量:应根据所测病原体而定。 一般来说,如果标本的量对病原体培养够 用的话,则其量亦足以用于核酸提取及其 后的扩增检测
对于定量检测来说,对标本的收集要求更 为精确。
采集质量的评价
血清(浆)标本:溶血、脂血等;
PCR实验室标本管理、生物 安全和防污染策略
广西壮族自治区人民医院检验科 李友琼
标本采集时间对扩增检测结果 的影响
在疾病发展过程中,标本采集过早 或过晚都可能会给出假阴性结果。
标本采集部位的准备
标本采集部位的清洁消毒可去掉污染的微生 物或其他杂物,但应适度,过度清洁消毒有 可 能会去掉或破坏靶微生物,故标本采集部位 的 准备应由训练有素的人员进行。
容器的使用
2.RNA标本处理和保存 对于RNA测定,标本 的 获取、处理和方式对测定结果有决定 性影响。研究表明,用于RNA测定的血浆 标本最好是使用EDTA抗凝(严禁使用肝素, 因其对PCR扩增有几只,且很难在核酸提 取过程中完全去除),抗凝后6小时内分 离血浆保存 ;如使用血清标本,则需尽 快(2小时)分离血清后保存。保存时间 短时(1-2周)可放-20℃下,较长期时应
2、如用于非结核杆菌如肺炎支原体的PCR 检测,痰标本的处理只能室温悬浮于生理 盐水中,充分震荡混匀,促使大块粘状物 下沉,取上清离心,所得到的沉淀物即可 用于核酸提取。
五、棉拭子
使用PCR方法检测性疾病病原体时,临床 标本一般为棉拭子,可将棉拭子置于适量 生理盐水中,充分震荡洗涤后,取上清立 即离心,其后的沉淀即可用于DNA提取。
实验中设立的阴性对照可提示有无假阳性结果出现。 如果一次试验中的几个阴性对照结果中出现一个或 几个阳性结果,提示本次试验中其他标本的检验结 果可能有假阳性。造成假阳性的原因包括样品污染 扩增试剂污染扩增产物交叉污染等
实验室应根据待测靶核酸的特性,对各 种临床样本的运送条件作出相应的规定。
第一节 临床标本的处理和保存
一、血清(浆)标本 1. DNA标本 DNA标本的获取、处理和保存, 可按照一本的血清标本处理程序即可。 2. 保存全血样本用于DNA提取检测,可4℃下短期保 如用于RNA检测, 则应在取血后尽快提取RNA。
标本采集中的防污染
采集中要特别注意污染,防止混入操作 者的头发、表皮细胞、痰液等;
如使用玻璃器皿,必须经高温灭菌,以 使用可能存在的RNase失活。
标本运送
样本一经采集,则应尽可能快的送至检 测实验室。
样本中如加入适当的稳定剂,如用于 RNA测定加入GITC的血清(浆)样本和 用于DNA测定的EDTA抗凝血等,则可在 室温下运送过邮寄。
在-70℃下。
二、全血标本 以全血作为
待测标本时
1. 抗凝剂的选择 以全血作为待测标本 时,一般使用EDTA-Na2或枸橼酸钠, 不可使用肝素。
2. 保存全血样本用于DNA提取检测,可 4℃下短期保存,如用于RNA检测, 则 应在取血后尽快提取RNA。
三、外周血单个核细胞
外周血单个核细胞可从抗凝全血制备,主 要有两条途径,一是使用淋巴细胞分离液 分离制备;二是使用红细胞裂解液,裂解 全血中的红细胞,经生理盐水数次洗涤, 即可看到单个核细胞。
保存 如不立即用于核酸提取,则需保存 于-70℃下。
六、脓液
脓液的处理依情况而定。
如用于分枝杆菌(如结核杆菌)核酸测定 的标本,粘稠的脓液可采用痰标本的处理 模式,先进行液化,再离心取沉淀提取 DNA;水样的脓液则直接离心,沉淀用于 生理盐水洗2-3次后,即可用于DNA提取。
对于用于非分枝杆菌测定的脓液标本,如 过于粘稠,则加入适量生理盐水,充分振 荡后,静置,取上清立即离心,沉淀用于 DNA提取;如为水样,则按上述直接离心 取沉淀即可。
小结
1、标本的收集及适当的预处理,对用于 PCR测定的核酸模板的成功提取,具有决 定性作用。
2、要着重强调的一点是,所有用于上述临 床标本收集的容器如试管或离心管,均应 使用前高压灭菌。
PCR污染与对策
PCR反映的最大特点是具有较大扩增能力与较高的灵 敏性,但令人头痛的问题是易污染,机器微量的污 染即可造成假阳性的产生。
保存 新鲜组织最好是保存于50%乙醇中,具体作 法是,先用生理盐水将组织洗一次,切成宽度小 于1cm的小片,加入适量的生理盐水,然后,边 摇边加入无水乙醇至浓度为50%,这样固定的组 织标本室温下可保存数日,4℃可保存6年。
石蜡切片用于核酸提取,需先用辛烷或二甲苯脱 蜡,再用蛋白酶K消化后可进行DNA提取。
保存 外周血单个核细胞如暂不提取核酸, 可保存于-70℃下。
四、痰
特点 痰属于分泌物,痰标本中含有大量粘 蛋白和杂质。
处理 1、如作结核杆菌DNA测定标本,提 取核酸前,需对标本进行初步处理,即用 1mmol/LNaOH液化。需注意的是,液化时 不能加热,液化时间不能过长。
保存 液化标本如不立即用于核酸提取,可 保存于-70℃下。
保存 沉淀标本的保存条件同样为-70℃。
Biblioteka Baidu 七、体液
临床体液标本包括胸水,腹水,脑脊液, 尿液等,可按水样标本的方式直接离心取 沉淀提取核酸。沉淀样本的保存同上。
八、组织
组织分新鲜组织块和石蜡切片。 新鲜组织块的处理步骤 首先用生理盐水洗两次,
然后将其捣碎或切碎,加入生理盐水后剧烈震荡 混匀,离心,弃上清,再加蛋白酶K消化后提取 核酸。 保存 新鲜组织最好是保存于50%乙醇中,具体作 法是,先用生理盐水将组织洗一次,切成宽度小 于1cm的小片,加入适量的生理盐水,然后,边 摇边加入无水乙醇至浓度为50%,这样固定的组 织标本室温下可保存数日,4℃可保存6年。
分泌物、痰:评价评价内容包括细胞组成, 所需类型细胞的数量和核酸总量。 评价方法:包括肉眼观察,显微镜下观察 和化学分析等。
采样及运输容器
标本的采集材料如棉签应为一次性使用; 运输容器亦应为密闭的一次性装置; 采集所用的防腐剂、抗凝剂及相关试剂材料
不应对核酸扩增及检测过程造成干扰。