抗菌药物敏感性试验
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抗菌药物敏感性试
• 在贴条过程中， 90mm 平皿只能贴 2 条，同时不同的试纸条高浓度 的一段应该向背；若贴 2 条含有酶抑制剂的试条应将含有酶抑制剂的 一端贴在同一侧。 • 贴条注意事项：试条事先恢复室温： 10 分钟左右。 • 试条的数量与角度： 4-6 条、 1-2 条。 • 贴条的时间：平皿多余水分已经消失。 • 试条的方向：高浓度端向外。 • 贴条的动作：平稳、流畅、不拖拉。 • 气泡的处理：尽量向一端赶。 • 3.孵育同 K-B 法 • 注意孵育时间、环境温度及酸碱度。 • 读数原则：杀菌剂读清晰的边缘见图 1 ，抑菌剂读大菌落与小菌落的 交界见图 2 。变形杆菌读最小的 MIC 值，后两张为含酶抑制剂抗生 素的测试结果。
抗菌药物敏感性试验规范化 卫生部北京医院 艾效曼
•
学习目标 1 、了解抗菌药物敏感性试验的意义、我国抗菌药物敏感性试验应遵循的规 则。 2 、掌握纸片扩散法和 E 试验原理，牢记试验的操作步骤及各步骤中的注意 事项，在日常工作中进行规范化的操作。
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抗菌药物敏感性试验的意义是什么？我国抗菌药物敏感性试验应遵循哪些规 则？ 一、基本内容 药敏试验的意义： （一） 药敏试验的意义： 1.查出耐药，减少治疗错误，便于医生选择个体化疗方案、节省费用。 2. 进行 耐药监测 ，为医院感染控制部门提供防治依据，为经验用药提供可靠 依据。 3.利用耐药监测结果控制抗菌药物应用，减少耐药菌株的出现，延长新药使 用寿命。 4. 为新药的研究和评估提供有价值的信息。 ）、药物敏感试验规则 （二）、药物敏感试验规则
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目前世界上通用的规则是德国和欧洲标准，而我国主要以临床试验室标准化 委员会（ CLSI ），即美国国家实验室标准委员会 (NCCLS) 的规则为标准， 这个标准主要包括 CLSI 纸片扩散法（ M2 ）和需氧菌稀释法（ M7 ）。 ）、抗菌药物敏感性试验结果参照标准 （三）、抗菌药物敏感性试验结果参照标准 1.标准的正确使用 M100 – 即新表 M100-S17 ，每年更新 1 次；包括 M2 和 M7 文件， M2 – 即 纸片扩散法 (DD) 文件 M2-A9 ， M7 – 即 MIC 文件 M7-A7 。 M2 、 M7 文 件每 3 年更新一次 ；使用文件时应注意文件是否已更新，避免使用旧文件造 成判断结果失误。 2.获得文件的方法 如果购买厂家的纸片可向厂家索取标准，每年国际化会议也会颁发此文件的 中心内容。 表内容： （四）、 CLSIM-100 表内容： CLSIM-100 表主要包括版本中的更新要点、各版本抗菌药物分组、 M2 纸片 扩散法用的表、 M7 MIC 用的表、 M7 MIC 用的表及词汇表等内容。
抗菌药物敏感性试验(药敏试验)
A组
B组 C组
常规和首选药物，其结果应常规报告
首选试验选择性报告。包含一些临床 上重要的、特别针对医院感染的药物 替代性和补充性药物
U组
补充性试验，仅用于治疗泌尿道感染 的抗菌药物。
药物选择
表中小框内是一组类似药物，其结果解释
和临床效力相似，不必个个试验。
“或”字表示一群相关药物，其抗菌谱和
第一、二代头孢菌素和氨基糖甙类药物体外
可能有活性但临床无效故不应报告敏感
沙门菌属的肠道外分离株应测试并报告
氯霉素和一种三代头孢菌素的敏感性
肠球菌对头孢菌素类、氨基糖甙类、磺
胺甲恶唑/甲氧苄啶和克林霉素在体外可
能有活性但临床耐药，不能报告敏感。
MRS 应 报 告 耐 受 所 有 β- 内 酰 胺 类 药 物
稀释法
定量测定抗菌药物活性
抗菌药物与肉汤或琼脂培养基混合稀释后
种入试验细菌，孵育过夜。 以能抑制细菌生长的最低浓度为最低抑菌 浓度（MIC） 将MIC与机体血清或体液中可获得药物浓度 相比较来确定恰当的临床疗效
MIC的对数与抑菌环直径关系 ——近似线性负相关
CLSI药物选择原则
上用接种环挑取单个新鲜菌落，悬浮 于生理盐水或肉汤中震荡混匀
与标准比浊管比浊，以有黑字的白纸
为背景调整其浊度相当于0.5号麦氏管。
平板接种
用无菌棉拭子蘸取菌液
在管壁上方旋转挤压几次去掉过多水分
用拭子涂布整个M-H培养基表面，反复
几次，每次将平板旋转60°
最后沿平皿周边绕两圈以保证涂布均匀
过低、过高会使某些药物失去效力（如氨基
糖甙类和大环内酯类）或活性可能增强（如 青霉素类）。
湿度
若使用前琼脂表面过分潮湿，应放35℃
B组 C组
常规和首选药物，其结果应常规报告
首选试验选择性报告。包含一些临床 上重要的、特别针对医院感染的药物 替代性和补充性药物
U组
补充性试验，仅用于治疗泌尿道感染 的抗菌药物。
药物选择
表中小框内是一组类似药物，其结果解释
和临床效力相似，不必个个试验。
“或”字表示一群相关药物，其抗菌谱和
第一、二代头孢菌素和氨基糖甙类药物体外
可能有活性但临床无效故不应报告敏感
沙门菌属的肠道外分离株应测试并报告
氯霉素和一种三代头孢菌素的敏感性
肠球菌对头孢菌素类、氨基糖甙类、磺
胺甲恶唑/甲氧苄啶和克林霉素在体外可
能有活性但临床耐药，不能报告敏感。
MRS 应 报 告 耐 受 所 有 β- 内 酰 胺 类 药 物
稀释法
定量测定抗菌药物活性
抗菌药物与肉汤或琼脂培养基混合稀释后
种入试验细菌，孵育过夜。 以能抑制细菌生长的最低浓度为最低抑菌 浓度（MIC） 将MIC与机体血清或体液中可获得药物浓度 相比较来确定恰当的临床疗效
MIC的对数与抑菌环直径关系 ——近似线性负相关
CLSI药物选择原则
上用接种环挑取单个新鲜菌落，悬浮 于生理盐水或肉汤中震荡混匀
与标准比浊管比浊，以有黑字的白纸
为背景调整其浊度相当于0.5号麦氏管。
平板接种
用无菌棉拭子蘸取菌液
在管壁上方旋转挤压几次去掉过多水分
用拭子涂布整个M-H培养基表面，反复
几次，每次将平板旋转60°
最后沿平皿周边绕两圈以保证涂布均匀
过低、过高会使某些药物失去效力（如氨基
糖甙类和大环内酯类）或活性可能增强（如 青霉素类）。
湿度
若使用前琼脂表面过分潮湿，应放35℃
抗菌药物敏感性试验与耐药检测ppt生物技术实验教学中心课件
8.联合药物敏感试验
1）方法很多，其中纸片法最为常用。先将试验菌均 匀涂布于培养基表面，盖好平皿，放置5分钟，待 平板表面水分吸收后，将两种含药纸片贴于平板 上，两纸片中心距离2--4mm左右。然后35℃ 孵育 过夜，取出观察结果。
2）结果判断 联合药物敏感试验可出现四种结果： A.无关作用： 甲+乙=甲单或乙单 B.拮抗作用： 甲+乙＜甲单或乙单 C.相加作用： 甲+乙=甲单+乙单 D.协同作用： 甲+乙＞甲单+乙单
三、实验操作步骤
（一）纸片扩散法：
1. M-H平板：直径为90mm，厚度 4mm。 2. 菌悬液制备：无菌挑取菌落于无菌生理盐水中，校
正浊度至0.5 麦氏。 3. 用无菌棉签浸入细菌悬液中，将棉签在试管壁上轻
轻挤压以挤去过多的菌液，用棉签以连续划线的方 式均匀涂抹琼脂平板表面三次（每次转60℃）使 菌液均匀分布，最后沿平板内缘涂抹一周。盖上 平板的盖子，放置3~10min。
一、实验目的：
1. 掌握纸片扩散法（K-B法）的原理、操作方法、结 果的判读及临床意义。
2. 了解各种稀释法抗生素敏感性试验的原理、操作 方法、结果判读和临床意义。
3. 掌握纸片扩散法的质量控制，了解稀释法的质量 控制。
二、实验原理
1. 抗菌药物敏感性试验是测定抗生素或其他抗 微生物制剂在体外抑制细菌生长的能力。这 种能力可以通过稀释或扩散方法来测定。
六、影响因素：
1. 培养基：厚度，PH，离子浓度，成份，添加剂； 2. 抗菌药物的配制方法，纸片的含量，大小，
渗透性，保存方式等； 3. 细菌的接种量； 4. 培养的环境，温度与时间； 5. 结果的判断及解释标准等。
4.每个孔加入100ul浓度为105菌悬液（大肠或金 葡），混匀，胶布封口，37°C培养。
细菌耐药性原理-抗菌药物敏感试验kej
该方法结合了稀释法和扩 散法的原理和特点，操作 简便，可得到微生物对抗 菌药物敏感度的定量结果，
但价格较高。
操作方法： 1.挑取16～20h的菌落 2.用无菌生理盐水制备成0.5麦氏比浊管浊度的菌液。
3.用无菌棉签浸入细菌悬液中，将拭子在试管上壁轻轻挤压以挤去过多 的菌液。棉签在三个方向平均涂抹琼脂表面（每次转60℃）使菌液均匀 分布，最后沿平板内缘涂抹一周。
联合药敏试验的方法
• 棋盘稀释法
• 原理 先测定两药单药时各自的MIC值，再将各种稀释度的两药混合， 测定两药联合时各药的MIC值，比较两药联合时MIC值与其单独MIC 值，计算部分抑菌浓度指数(fractional inhibitory concectration，FIC)， 作为协同、相加、无关和拮抗的判断。
大肠埃希菌 头孢噻肟
浓度 0.5
1
2
4 ug/ml
3.抗菌药物敏感性试验的方法
浓度梯度法（E-Test）药敏试验
E-Test即浓度梯度（多点药物浓度法）琼脂扩散试验。E试纸条背面含 有干化、浓度由高至低连续梯度分布的抗菌药，药物浓度按log2梯度递 减。抗菌药物从具有浓度刻度的塑料试纸条中向琼脂中扩散，在试纸条 周围抑菌浓度范围内受试菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈，抑 菌圈与试纸条的横向相交处的读数刻度为MIC值。
抗菌药物的临床实践
剂量 方案
血药浓度/时间
药代动力学 PK
其他组织或体液药 物浓度/时间
感染部位药物 浓度/时间
药理学或 毒副作用
抗菌作用/ 时间
药效动力学 PD
＋ PK：反应体内药物浓度 变化与时间关系
PD：反应抗菌药物在体 外抗菌活性变化过程
MIC MBC PAE MPC
但价格较高。
操作方法： 1.挑取16～20h的菌落 2.用无菌生理盐水制备成0.5麦氏比浊管浊度的菌液。
3.用无菌棉签浸入细菌悬液中，将拭子在试管上壁轻轻挤压以挤去过多 的菌液。棉签在三个方向平均涂抹琼脂表面（每次转60℃）使菌液均匀 分布，最后沿平板内缘涂抹一周。
联合药敏试验的方法
• 棋盘稀释法
• 原理 先测定两药单药时各自的MIC值，再将各种稀释度的两药混合， 测定两药联合时各药的MIC值，比较两药联合时MIC值与其单独MIC 值，计算部分抑菌浓度指数(fractional inhibitory concectration，FIC)， 作为协同、相加、无关和拮抗的判断。
大肠埃希菌 头孢噻肟
浓度 0.5
1
2
4 ug/ml
3.抗菌药物敏感性试验的方法
浓度梯度法（E-Test）药敏试验
E-Test即浓度梯度（多点药物浓度法）琼脂扩散试验。E试纸条背面含 有干化、浓度由高至低连续梯度分布的抗菌药，药物浓度按log2梯度递 减。抗菌药物从具有浓度刻度的塑料试纸条中向琼脂中扩散，在试纸条 周围抑菌浓度范围内受试菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈，抑 菌圈与试纸条的横向相交处的读数刻度为MIC值。
抗菌药物的临床实践
剂量 方案
血药浓度/时间
药代动力学 PK
其他组织或体液药 物浓度/时间
感染部位药物 浓度/时间
药理学或 毒副作用
抗菌作用/ 时间
药效动力学 PD
＋ PK：反应体内药物浓度 变化与时间关系
PD：反应抗菌药物在体 外抗菌活性变化过程
MIC MBC PAE MPC
4.抗菌药物的敏感性试验
肠球菌属：青霉素 、万古霉素 、甲氧苄啶/磺胺异
噁唑 、庆大霉素、环丙沙星、红霉素、氨苄西林
不动杆菌属：头孢他啶 、亚胺培南、阿米卡星、哌拉 西林/他唑巴坦、头孢吡肟 、头孢曲松 、环丙沙 星、米诺环素； 洋葱伯克霍德菌：头孢他啶 、米诺环素、甲氧苄啶/磺 胺异噁唑 、美罗培南 ；
嗜麦芽窄食单胞菌：甲氧苄啶/磺胺异噁唑、左氧氟沙 星、米诺环素 ；
嗜血杆菌属：氨苄西林、甲氧苄啶/磺胺异噁唑、头孢
他啶、美罗培南、阿奇霉素、环丙沙星、头孢克洛；
淋病奈瑟菌：头孢曲松、环丙沙星、青霉素、大观霉素、
四环素 ；
肺炎链球菌：红霉素 、苯唑西林 、甲氧苄啶/磺胺异噁唑、 克林霉素、左氧氟沙星、四环素、万古霉素 ； 除肺炎链球菌外的其他链球菌：红霉素、青霉素、克 林霉素、万古霉素、头孢曲松、左氧氟沙星。
5.盖上平板的盖子，放置培养箱内孵育，放置3~10分钟 后贴上标准抗生素纸片。
6.根据选择的菌株挑选相应的抗菌纸片。
肠杆菌科：氨苄西林、阿米卡星、哌拉西林/ 他唑巴坦、头孢噻肟、环丙沙星、亚胺培 南、氨曲南、庆大霉素； 铜绿假单胞菌：头孢他啶、庆大霉素、哌拉西林、 阿米卡星、环丙沙星、头孢吡肟、亚胺培南； 葡萄球菌属：头孢西丁、青霉素、红霉素、万古霉 素、环丙沙星、庆大霉素、利福平 ；
操作方法：1.抗菌药物的稀释和融解
2.抗菌药物母液的稀释
3.在微量聚乙烯微板孔中加入各种不同浓度的抗生素
100μ l，从低浓度往高浓度加样，不需要更换吸管。
4.挑选18~24小时的菌落置M-H肉汤增菌4~6小时。
5.制备0.5麦氏比浊管，然后1:200稀释，使之最终 浓度105 CFU/ml。
6.孵育后形成一椭圆形抑菌圈，抑菌圈和试条的相交
医院抗菌药物敏感性试验的技术要求(2022年版)
(2022年版)1范围 (2)2 术语和定义 (2)3 常规药敏试验的药物选择和报告 (4)4 药敏试验方法 (7)5 各种属细菌药敏试验 (12)6 质量控制(Quality control, QC) (17)7 商品化药敏试验检测系统的性能验证 (19)附录 A (资料性附录) 临床各种属细菌的药敏试验方法和试验条件 (23)附录 B (资料性附录) 不常见苛养菌和非苛养菌药敏试验折点 (27)1 范围本标准规定了临床抗菌药物敏感性试验的技术要求，包括常规药敏试验的药物选择和报告、药敏试验方法、各种属细菌药敏试验、常见菌特殊耐药表型检测、药敏试验的质量控制、商品化药敏试验检测系统的性能验证。
本标准合用于开展临床微生物学检验的各级临床实验室。
2 术语和定义下列术语和定义合用于本文件。
2.1抗微生物药物敏感性试验 Antimicrobial susceptibility testing指检测微生物(本行业标准特指细菌)对抗微生物药物(本行业标准特指抗菌药物)的体外敏感性，以指导临床合理选用药物的微生物学试验，简称药敏试验。
2.2最低抑菌浓度 Minimal inhibitory concentration；MIC指在琼脂或者肉汤稀释法药物敏感性检测试验中能抑制肉眼可见的微生物生长的最低抗菌药物浓度。
2.3折点 Breakpoint能预测临床治疗效果，用以判断敏感、中介、剂量依赖型敏感、耐药、非敏感的最低抑菌浓度(MIC)或者抑菌圈直径(mm)的数值。
2.3.1敏感 Susceptible；S当抗菌药物对分离株的MIC值或者抑菌圈直径处于敏感范围时，使用推荐剂量进行治疗，该药在感染部位通常达到的浓度可抑制被测菌的生长，临床治疗可能有效。
2.3.2中介 Intermediate； I当菌株的MIC值或者抑菌圈直径处于中介时，该数值接近药物在血液和组织中达到的浓度，从而治疗反应率低于敏感菌群。
该分类意味着采用高于常规剂量治疗时或者在药物生理浓集的部位，临床治疗可能有效。
微生物学检验(第3版)药物敏感试验
抗生素的种类 一.目的：
四、氨基糖苷类抗生素 按其来源分为：①由链霉菌属发酵滤液提 取获得，有链霉素、卡那霉素、妥布霉素、 核糖霉素、巴龙霉素、新霉素；②由小单 胞菌属发酵滤液中提取，有庆大霉素、福 提霉素；③半合成氨基糖苷类，有阿米卡 星、奈替米星、地贝卡星等。
抗生素的种类 一.目的：
五、喹诺酮类抗生素 第一代为窄谱抗生素，有新恶酸、奈啶 酸和恶喹酸。 第二代为广谱类抗生素，抗菌强度依次 为环丙沙星、氧氟沙星、洛美沙 星、氟咯沙星、培氟沙星、诺氟 沙星。 第三代为超广谱类抗生素，有司帕沙星、 妥舒沙星、左氟沙星等。
纸片的名称，然后用棉试子蘸取菌液，在试管内
壁轻挤去多余菌液后均匀涂布于整个平板表面3次， 每次旋转平板60度，最后沿平板内缘涂一周。放 置约5分钟后用镊子分别挟取所选择的药敏纸片贴 上。室温放置10分钟左右，恒温箱培养24h。
验操实作
• (4)、MH平板涂布均匀，放置5分钟再贴纸 片，纸片放置应该迅速准确，不得在平板 上拖动纸片，纸片间的距离和位置要均匀。 离平板边缘不小于15mm，两纸片间距离不 小于24mm。
实验原理 1.原理：
实验操作（接种与培养）
• (1)、取待测菌平板，观察菌落形态，涂片镜检， 革兰阴性杆菌做氧化酶试验，革兰阳性球菌做触 决定选择何组、何种药敏纸片。
酶实验。并根据实验结果对该菌株作出初步判断，
药敏试验选择纸片
• 触酶阳性的G＋球菌：青、苯唑、克林、庆大、环
丙沙星、万古、红霉素、头孢唑林 庆大、环丙沙星、万古
(一）苛养菌药敏试验抗生素的选用
A组一级试验并常规报告的抗微生物药 , 如肺炎链球菌用红霉素和青霉素。 B组一级试验有选择报告的抗微生物药 , 如肺炎链球菌用头孢噻肟或头孢曲松 。 C组补充试验有选择报告的抗微生物药， 如肺炎链球菌用头孢呋辛 。
抗菌药物敏感试验
操作方法：1.抗菌药物的稀释和融解
2.抗菌药物母液的稀释
3.在微量聚乙烯微板孔中加各种不同浓度的抗生素 100μl，从低浓度往高浓度加样，不需要更换吸管。
4.挑选18~24小时的菌落置M-H肉汤增菌4~6小时。
5.制备0.5麦氏比浊管，然后1:200稀释，使之最终 浓度105 CFU/ml。
除肺炎链球菌外的其他链球菌：红霉素、青霉素、克 林霉素、万古霉素、头孢曲松、左氧氟沙星。
7.用无菌镊子或纸片分配器将抗菌纸片粘贴于M-H琼脂 的表面，一旦纸片贴上，不能移动；各抗菌纸片中 心距离应大于24mm，纸片距平板内缘应大于15mm。
8.经过35℃16～24h孵育。
9.取抑菌环直径，根据 CLSI（clinical and laboratory standards institute ）标准，报 告细菌对该抗生素 敏感(susceptible,S)、 耐药(resistant,R)、 中介(intermediate,I)。
纸片扩散法（KirbyBauer法）
原理：
将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测 试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼 脂中水分溶解后不断向纸片周围扩散形成递减 的梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内测试 菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈 即为抑菌圈。
抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏 感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。
第四章 抗菌药物的敏感性试验
药敏试验的意义
1、可预测抗菌治疗的效果 2、指导临床抗菌药物的使用 3、发现或提示细菌耐药机制，帮助临床医生合理使 用抗菌药物 4、监测细菌的耐用性，分析耐药菌的变化，预防和 控制耐药菌感染的发生和流行
抗菌药物的敏感性试验
常用方法：
抗菌药物敏感性试验执行标准
抗菌药物敏感性试验执行标准抗菌药物敏感性试验是临床微生物学中非常重要的一项实验，它可以帮助医生选择最有效的抗菌药物来治疗感染性疾病。
执行标准的严格性和准确性对于试验结果的可靠性至关重要。
下面将介绍抗菌药物敏感性试验执行标准的相关内容。
首先，进行抗菌药物敏感性试验前，需要准备好所需的培养基、试验材料和各种试剂。
同时，要做好实验室的消毒和无菌操作，以确保试验的准确性和可靠性。
在进行试验时，需要按照严格的操作规程进行。
首先，要准备好待测菌株的悬浮液，然后按照一定比例将其接种到含有不同浓度抗菌药物的琼脂平板上。
接种后，要在恒温培养箱中进行培养，培养时间一般为16-18小时。
培养结束后，需要观察菌落的生长情况，并进行相关的数据记录和分析。
根据菌落的生长情况和抗菌药物的浓度，可以判断出菌株对抗菌药物的敏感性。
在记录和分析数据时，要注意细致入微，确保数据的准确性和可靠性。
在执行标准中，对试验结果的解释和判定也非常重要。
根据试验结果，可以判断出菌株对抗菌药物的敏感性、耐药性或者中间敏感性。
这些判定对于临床治疗具有指导意义，可以帮助医生选择最合适的抗菌药物来治疗感染性疾病。
此外，在执行标准中，还需要对试验过程中可能出现的干扰因素进行控制和排除。
比如，培养条件、试剂质量、操作技术等都可能对试验结果产生影响，需要在试验过程中进行严格的控制和调节。
总的来说，抗菌药物敏感性试验执行标准的严格性和准确性对于试验结果的可靠性至关重要。
在实验过程中，需要严格按照操作规程进行，确保试验过程的准确性和可靠性。
同时，对试验结果的解释和判定也非常重要，可以帮助医生选择最合适的抗菌药物来治疗感染性疾病。
在执行标准中，还需要对试验过程中可能出现的干扰因素进行控制和排除，以确保试验结果的准确性和可靠性。
抗菌药物敏感试验实验
阿米卡星（AMK）、环丙沙星（CIP） 4.庆大霉素稀释液：1支/桌（256U/ml） 5. 其它：MH肉汤、无菌刻度管、无菌棉签、镊子、
无菌试管、刻稀释法
K-B法操作方法
操作注意事项：
菌液应在15分钟内接种完毕 接种后，平板放置时间不要超过5min 注意纸片距离
肉汤稀释法操作方法
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
M-H肉汤(ml)
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
抗生素(ml) 菌液(ml)
2
2
2
2
2
2
2
2
2弃 －
去
0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
35℃孵育16~18h，观察结果
实验内容
第二次 1.观察K-B法的结果 2.观察肉汤稀释法的结果
K-B法结果解释
测量抑菌圈直径，参照CLSI的标准解释结果。
20mm
金黄色葡萄球菌抗菌药物敏感性试验结果判断
大肠埃希菌抗菌药物敏感性试验结果判断
实验目的 1.掌握纸片扩散法（K-B法）和肉汤稀释法
的原理、操作方法、结果的判读及其临床 意义。 2.掌握纸片扩散法和肉汤稀释法的质量控制。
实验内容 纸片琼脂扩散法（K-B法） 肉汤稀释法
实验器材
1. 菌种： 金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌 2. 培养基：水解酪蛋白琼脂（MH琼脂）、MH肉汤 3. 抗菌纸片：青霉素（PEN）、庆大霉素（GEN）、
无菌试管、刻稀释法
K-B法操作方法
操作注意事项：
菌液应在15分钟内接种完毕 接种后，平板放置时间不要超过5min 注意纸片距离
肉汤稀释法操作方法
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
M-H肉汤(ml)
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
抗生素(ml) 菌液(ml)
2
2
2
2
2
2
2
2
2弃 －
去
0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
35℃孵育16~18h，观察结果
实验内容
第二次 1.观察K-B法的结果 2.观察肉汤稀释法的结果
K-B法结果解释
测量抑菌圈直径，参照CLSI的标准解释结果。
20mm
金黄色葡萄球菌抗菌药物敏感性试验结果判断
大肠埃希菌抗菌药物敏感性试验结果判断
实验目的 1.掌握纸片扩散法（K-B法）和肉汤稀释法
的原理、操作方法、结果的判读及其临床 意义。 2.掌握纸片扩散法和肉汤稀释法的质量控制。
实验内容 纸片琼脂扩散法（K-B法） 肉汤稀释法
实验器材
1. 菌种： 金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌 2. 培养基：水解酪蛋白琼脂（MH琼脂）、MH肉汤 3. 抗菌纸片：青霉素（PEN）、庆大霉素（GEN）、
抗菌药物的敏感性试验及报告解读
明确提出在二级以上医院设立感染科与感染临床药师（第12、
13条），及临床微生物室（第14条）
6
Company name
概况和制定过程
第一章 总则
第六章 附则 第五章 法律责任
共六章 53条
第二章 组织机 构和职责
• 组织医院管理、临床、药学 、微生物检验、感染等方面 专家起草《抗菌药物临床应 用管理办法》
19
Company name
培养条件（一）
需氧菌： 35℃ ±2 ℃ ，16-18小时 嗜麦芽窄食单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌：20-24小时 葡萄球菌：33-35 ℃ ，OXA、MET、NAF、VAN24小时 肠球菌：VAN 24小时 溶血性链球菌、肺炎链球菌、奈瑟氏菌属等：20-24小时
20
Company name
操作：
无菌棉签蘸取菌液，在管壁内将多余菌液旋 转挤去后，在琼脂表面均匀涂布接种3次， 每次旋转平板60度，最后沿平板内缘涂抹1 周。 室温干燥或35℃干燥5-15分钟 用纸片分配器或无菌镊子将药物纸片紧贴于 琼脂表面 纸片间距 20mm 纸片离平板内缘 15mm
15
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抗生素药敏试验质控
• 4月11日起征求全国意见
• 制定《抗菌药物临床应用分
第三章 抗菌药物 级管理目录》
临床应用管理
• 4月15日期征求全国意见
第四章 监督管理
7
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第三章 抗菌药物临床应用管理
• 三级医院 不得超过50种，二级医院 不得超过35种 • 同一通用名称药品的品种，注射剂型和口服剂型各不得超过2种，处方组成
葡萄球菌属 Mueller-Hinton（MH）琼脂
关于抗菌药物敏感性试验(药敏试验)课件
纸片周围一定距离范围内试验菌生长受抑 制，从而形成无菌生长的透明圈即抑菌环。
抑菌环大小反映测试菌对测定药物的敏感 程度
抑菌环大小除与细菌的敏感性有关外还与 其它诸因素相关。
稀释法
定量测定抗菌药物活性 抗菌药物与肉汤或琼脂培养基混合稀释后
种入试验细菌，孵育过夜。 以能抑制细菌生长的最低浓度为最低抑菌
关于抗菌药物敏感性 试验(药敏试验)
目的
指导临床医生针对各类临床感染患者选择 最佳抗菌药物
一定区域内积累对公共卫生有关的重要耐 药的微生物流行病学资料
根据细菌对药物敏感谱进行菌种鉴定
药敏试验原理
纸片扩散法
把含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测 试细菌的琼脂平板上
纸片中药物吸收琼脂水分溶解后通过弥散 作用形成递减的浓度梯度
按 抑 菌 环 直 径 判 断 细 菌 的 敏 感 性 ， 应 依 据 CLSI的解释标准，报告细菌对测试药物敏 感、中介、耐药。
结果判断
在清楚抑菌环内有独立的菌落生长提示
接种的菌落不纯，需要重新分离、鉴定和 药敏试验
抗菌药物选择出的高频突变耐药株
变形杆菌属的菌株可扩散到某些抗菌药物 的抑菌环内，故在明显抑菌环内有薄膜状 爬行生长可以忽略。
治疗对基本药物过敏的患者
治疗少见菌的感染
流行病学调查为目的向感染控制部门报告
试验方法—纸片扩散法
改良Kirby-Bauer法(K-B法)
试验材料
培养基
非苛氧菌用Mueller- Hinton（M-H）琼
脂
药物纸片 直径6mm纸片，每片吸水量约20μl
菌液比浊管 0.5号麦氏（McFarland）标准比浊管，
置35℃孵育2-6 h 用无菌生理盐水或肉汤校正，使其浊度至
抗菌药物的敏感性试验
目前，我国抗菌药物的应用现状是临床无指征治疗性、预防性用药严重及选择错误的品种、剂量及疗程。
而不合理用药可导致治疗失败、不良反应增多、细菌耐药性增长迅猛、医药资源大量消耗等不良后果。
而我们应该如何为临床正确选用抗生素呢？正确的答案是，我们应该根据感染菌株的药物敏感性试验合理选用抗生素。
抗菌药物的敏感性试验就是测定抗菌药物在体外抑制病原微生物生长的效力。
目前，我科遵循美国临床实验室标准化研究所（CLSI）2010版抗微生物药物敏感性试验执行标准进行操作。
由于CLSI标准的公认程度和准确性，许多国家都采用该标准。
该标准根据不同的细菌分类（如肠杆菌科、葡萄球菌属、铜绿假单胞菌等）制定可选用的抗生素及其药敏试验的判读标准，并将它们分成四组：A组：一级试验并常规首选报告的抗微生物药物；B组：一级试验，临床使用的主要抗生素（尤其在院内感染时）有选择报告的药物；C组：补充试验，有选择报告的药物；U组：补充试验，仅用于泌尿道感染细菌的抗微生物药物。
CLSI标准所制定的三级划分制及临床意义如下：高度敏感（S）：用该种药物常用剂量治疗有效；中介（I）：仅在应用高剂量抗菌药物时才有效，或者细菌处于体内抗菌药物的浓缩部位（如尿液、胆汁等）才被抑制；耐药（R）：药物对某一细菌的MIC高于药物在血或体液中可能达到的浓度，有时细菌能产生灭活抗菌药物的酶，则不论其MIC值大小如何，均应判定该菌为耐药。
在临床实践中，我们常可以听到一些关于细菌药敏试验与临床药效不符的抱怨。
这一现象的出现，国内外的一些文献认为主要与以下几方面有关。
①与临床是否正确地获得合格的标本至为相关；我们应规范标本的取材、送检及减少送检污染部位的标本（如：痰、咽拭子等）。
②可能出现真菌等二重感染。
③CLSI药敏标准制定中的局限性。
④细菌感染的诊断是否正确。
⑤药敏试验操作不当。
⑥用药剂量不足或出现耐药菌株。
⑦一般医院的微生物实验室做细菌培养仅限于需氧非苛养菌的检测。
抗菌药物敏感性试验
转60℃）使菌液均匀分布，后沿平板内缘涂抹一周。 4)用镊子将E-test试条的抗菌药物的一面贴向琼脂表面，有刻度的一
面向外。 5)孵育，置平板于35℃孵育16-24h。
20
6.孵育后形成一椭圆形抑菌圈，抑菌圈和试条的相交处的刻度即 为抗菌药物对该菌的最低抑菌浓度(MIC) 。
椭圆形细菌生 长抑制区
24
抑菌浓度指数（FICI）
FICI ＝
A药联合时的MIC A药单测的MIC
＋
B药联合时的MIC B药单测的Hale Waihona Puke ICFICI ﹤1为协同作用；
FICI =1为累加作用；
FICI﹥1 为拮抗或无关作用，无关时药物组合的MIC 等于浓度高的药物的MIC。
25
2、抗菌药物的杀菌活性 （1）最低杀菌浓度（MBC）
11
（5）孵育：放于35℃孵箱中，通常于16-18h后，测量抑菌环直径。
12
（6）测量抑菌环直径
13
（7）与解释标准核对得出结论 敏感(susceptible, S)：所分离菌株能被测试药物使用推荐剂量时在感 染部位可达到的药物浓度所抑制。 耐药 (resistant, R)：所分离菌株不被测试药物常规剂量可达到的药 物浓度所抑制。
时的抗菌效果，其结果可以表现为协同、拮抗、累加和无关。
23
2）部分抑菌浓度指数（FICI）测定： 测定A、B两种药的MIC值，根据MIC值将两药配成不同浓度的
含药肉汤，将各浓度的A药和B药肉汤两两等量混合，组成棋盘模式 不同药物组合的含药肉汤。观察孵育后各行列中不长菌的最低药物 浓度管，即为药物组合的MIC值。
26
（2）时间杀菌试验（time-kill assay）
1）概念：是指能够使试验菌减少99.9%以上的最低药物浓度。 2）操作方法：分别取高于MIC值的各管中的菌药混合肉汤划线接种于
面向外。 5)孵育，置平板于35℃孵育16-24h。
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6.孵育后形成一椭圆形抑菌圈，抑菌圈和试条的相交处的刻度即 为抗菌药物对该菌的最低抑菌浓度(MIC) 。
椭圆形细菌生 长抑制区
24
抑菌浓度指数（FICI）
FICI ＝
A药联合时的MIC A药单测的MIC
＋
B药联合时的MIC B药单测的Hale Waihona Puke ICFICI ﹤1为协同作用；
FICI =1为累加作用；
FICI﹥1 为拮抗或无关作用，无关时药物组合的MIC 等于浓度高的药物的MIC。
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2、抗菌药物的杀菌活性 （1）最低杀菌浓度（MBC）
11
（5）孵育：放于35℃孵箱中，通常于16-18h后，测量抑菌环直径。
12
（6）测量抑菌环直径
13
（7）与解释标准核对得出结论 敏感(susceptible, S)：所分离菌株能被测试药物使用推荐剂量时在感 染部位可达到的药物浓度所抑制。 耐药 (resistant, R)：所分离菌株不被测试药物常规剂量可达到的药 物浓度所抑制。
时的抗菌效果，其结果可以表现为协同、拮抗、累加和无关。
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2）部分抑菌浓度指数（FICI）测定： 测定A、B两种药的MIC值，根据MIC值将两药配成不同浓度的
含药肉汤，将各浓度的A药和B药肉汤两两等量混合，组成棋盘模式 不同药物组合的含药肉汤。观察孵育后各行列中不长菌的最低药物 浓度管，即为药物组合的MIC值。
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（2）时间杀菌试验（time-kill assay）
1）概念：是指能够使试验菌减少99.9%以上的最低药物浓度。 2）操作方法：分别取高于MIC值的各管中的菌药混合肉汤划线接种于
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三、浓度梯度纸条扩散法药敏试验
又称E试验（E test），融合了纸片法操 作简单和稀释法可定量的有点，也适用于慢生 长菌。但成本贵。
药敏纸片换成特制的药敏纸条，培养后读 取细菌停止生长处在纸条上相应的药物浓度指 示值，即为该药物对该试验菌的MIC值。
三、浓度梯度纸条扩散法药敏试验
细菌生长区
E test 塑料
一、β-内酰胺酶的检测
2、超光谱β-内酰胺酶的检测
超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）由革兰氏 阴性杆菌产生，质粒编码，活性可被β-内酰 胺酶抑制剂（如克拉维酸）抑制。包括筛查 试验和确认试验。
ESBLs阳性提示该菌可能对青霉素类、头 孢类和单环抗生素耐药。
临床上需常规检测的细菌包括大肠埃希 菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌和奇异变 形杆菌。
二、药敏试验常用抗菌药物 的选择与分组
（一）常用抗菌药物 β-内酰胺类、糖肽类、氨基苷类、大环
内酯类、四环素类、喹诺酮类、磺胺类、甲 氧苄氨嘧啶等。
二、药敏试验常用抗菌药物 的选择与分组
• β-内酰胺类抗生素（β-lactams）系指 化学结构中具有β-内酰胺环的一大类抗 生素，包括青霉素与头孢菌素，碳青霉烯 类和单环类，以及β-内酰胺酶抑制剂 （克拉维酸、舒巴坦和三唑巴坦）的复方 制剂等。抗菌机制是抑制细菌的细胞壁合 成。
• 此类抗生素具有杀菌活性强、毒性低、适 应证广及临床疗效好的优点。
二、药敏试验常用抗菌药物 的选择与分组
青霉素和头孢菌素类的基本结构
二、药敏试验常用抗菌药物 的选择与分组
（二） 抗菌药物的选择原则 1.致病菌的固有耐药特点 革兰氏阴性杆菌对万古霉素均耐药。 革兰氏阳性球菌对氨曲南固有耐药。 2.本地流行株的耐药谱和耐药趋势
头孢噻肟或头孢 曲松
乙基西梭霉素
氯霉素
甲氧苄啶/磺胺甲 恶唑
庆大霉素 环丙沙星 氯霉素 利福平 四环素
庆大霉素 （只用于高 水平耐药筛 选）
链霉素（只 用于高水平 耐药筛选）
D组
作为补充 只用于尿 路感染
羧苄西林 西诺沙星 呋喃妥因 复方新诺明
羧苄西林 洛美沙星 复方新诺明
洛美沙星和诺 环丙沙星
氟沙星
细菌耐药概念
多重耐药（MDR）
指细菌同时对三种以上结构不同（作用机制不同）抗菌药物耐药， 如头孢菌素、喹诺酮类、氨基糖苷类；
泛耐药（ PDR）
指细菌不仅对头孢菌素类、碳青霉烯类、β-内酰胺酶 抑制剂复方制剂耐药，同时也对氟喹诺酮类和氨基糖苷类等 抗菌药物耐药。
超级细菌
并非科学概念，一般指PDR与部分MDR，没有确切定义，包括耐甲 氧西林葡萄球菌/耐万古霉素金葡菌（MRSA/VRSA）、耐万古霉素肠球菌 （VRE）、耐多药绿脓假单胞菌（MDR-PA），PDR鲍曼不动杆菌（PDRAB）、同时产ESBL和AmpC酶的肠杆菌、产金属碳氢霉烯酶肠杆菌（包括 产NDM-1细菌）等。
（三）中介（Intermediate,I） 3.若某药物在高剂量时是安全的（如
β-内酰胺类药物），中介意味着高剂量给药 可能奏效。
4.判断药敏试验结果时，中介数据位置 处于敏感和耐药之间，可作为缓冲带，对于 药物毒性范围较窄的药物有重要意义。
三、药物试验结果的表示 及其临床意义
（四）剂量依赖敏感（Susceptible-dose dependent, SSD）
四、细菌的耐药机制
（一）细菌产生灭活抗生素的各种酶 1.β-内酰胺酶（青霉素酶、头孢菌素酶等） 2.氨基糖苷修饰酶
四、细菌的耐药机制
（二）细菌改变药物作用的靶位 （三）细菌限制抗菌药的进入和对药物的主
动外排 （四）细菌生物膜的形成
四、细菌的耐药机制
抗生素靶位点改变
孔蛋白改变，细胞壁/膜 通透性改变
≥13
—
≥15
13～14
≥15
14～22
≥23
15～20
≥21
11～15
≥16
相应MIC值 (μg/ml)
耐药
敏感
β-内酰胺酶 ≤0.12
≥4
≤2
—
≤4
≥8
≤4
≥8
≤0.5
≥4
≤0.5
≥8/152 ≤2/38
二、稀释法药敏试验
稀释法药敏试验直接测定的是抗菌药 物的最小抑菌浓度，又称为MIC测定。
以肉汤培养基或琼脂培养基将抗生素 做不同浓度的稀释，种入待检细菌，35oC 孵育24h，定量测定抗菌药物对被测菌的 最低抑菌浓度（MIC）或最低杀菌浓度 （MBC）。
一、药敏试验的目的和适应证
（二）适应证
1.当某些致病菌或条件致病菌的药敏特 点不能从其种属特征上了解时，或其药敏结 果易变时，这些菌的临床分离株才必须进行 药敏试验，如葡萄球菌、肠杆菌科的细菌、 非发酵菌等。
（一）药敏试验的目的和适应证
2.下述不必做药敏试验 （1）自标本中分离出多种细菌，可能来 自环境或正常菌群的污染。 （2）对某抗菌药物高度敏感而从未见耐 药报告的致病菌。 （3）正常寄生部位的条件致病菌和非致 病菌。
二、药敏试验常用抗菌药物 的选择与分组
3.药物的活性和毒性 4.药物的价格和供应情况 5.代表药物的正确选择 相同类别的抗菌药物，对常见致病菌具 有相似的作用机制，可选一个作为代表药物。
二、药敏试验常用抗菌药物 的选择与分组
目前，我国绝大多数临床微生物实 验室均参考美国临床和实验室标准学会 (CLSI) 推荐的对各类细菌进行常规药敏 试验和报告时的选药指南。
金黄色葡萄球菌抗菌药物敏感性试验评价结果
抗菌药物
青霉素 苯唑西林 万古霉素 庆大霉素 红霉素 克林霉素 磺胺药
纸片含药量
10U 1μg 30μg 10μg 15μg 2μg 1.25/23.75μg
耐药 ≤28 ≤10 — ≤12 ≤13 ≤14 ≤10
抑菌圈直径(mm)
中介
敏感
—
≥29
11～12
灭活酶产生
第二节抗菌药物敏感性试验
一、纸片扩散法药敏试验 二、稀释法药敏试验 三、浓度梯度纸片扩散法药敏试验
一、纸片扩散法药敏试验
1、原理 含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测
试菌的琼脂平板上，纸片所含的药物吸取琼 脂中的水分溶解后便不断向纸片周围区域扩 散，形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌 浓度范围内的细菌生长被抑制，形成透明的 抑菌圈。
一、纸片扩散法药敏试验
抑菌圈的大小反 映测试菌对测定药物 的敏感程度，并与该 药对测试菌的最低抑 制浓度（minimal
inhibitory concentration，
MIC）呈负相关，即抑 菌圈愈大，MIC愈小。
一、纸片扩散ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ药敏试验
2、结果判读 用刻度尺量取抑 菌圈直径，根据CLSI 标准判读结果；报告 细菌对该抗生素是 敏感（S）、耐药（R） 或中介（I）。
有几种不同含义：
1.抗菌药物对感染菌的MIC接近该药在血 液和组织中的浓度，感染菌的临床应答率可 能低于敏感菌。
2.据药代动力学分析，若某药在某些感 染部位被生理性浓缩，则中介意味着该药治 疗该部位的感染可能有效。（喹诺酮类在尿 中浓度较高）。反之，则选择其他药物。
三、药物试验结果的表示 及其临床意义
第一节 概述
一 、药敏试验的目的和适应证 二 、药敏试验常用抗菌药物的选择与分组 三 、药物试验结果的表示及其临床意义 四 、细菌的耐药机制
一、药敏试验的目的和适应证
（一）目的 1.指导临床医师合理选择抗生素。 2.预测抗菌药物治疗的效果。 3.监测耐药性，分析耐药菌变迁，掌握耐药 菌感染流行病学，控制和预防耐药菌感染 的发生和流行（院内和院外感染）。
抗菌药物敏感性试验 和细菌耐药性检测
教学目的与要求
• 掌握：敏感、中介、耐药、SDD和不敏感的概念。 • 熟悉：药敏试验的目的和适应证；常用抗菌药物；
药敏试验用药的选择；药敏试验用药的分组；细菌 的耐药机制。
• 了解：抗菌药物药效动力学评价的其他试验；最小 防突变浓度；抗菌药的PK/PD理论和抗菌药物敏感 折点的建立；细菌耐药基因的检测。
指抗菌药对感染菌的MIC接近该药物在血 液和组织中的浓度，感染菌的临床应答率可能 低于敏感菌；若高剂量使用该药物仍然安全时， 高剂量给药可能奏效。主要用于真菌的药敏试 验。
三、药物试验结果的表示 及其临床意义
（五）不敏感（Nonsusceptible,S） 当新的抗菌素问世时，尚未发现耐药株，
早期的解释标准只有敏感折点；某个分离株的 MIC值高于敏感折点的时候，报告为不敏感。
头孢吡肟 头孢哌酮 氨曲南 亚胺培南 丁胺卡那 妥布霉素 环丙沙星
青霉素 苯唑西林
青霉素或氨 苄西林
万古霉素
克林霉素
阿奇霉素或 红霉素
甲氧苄啶/磺 胺甲恶唑
万古霉素
CLSI推荐的选药标准
肠杆菌科细菌 铜绿假单胞菌 葡萄球菌属 肠球菌属 和不动杆菌属
C组
补充选择 性报告
头孢他啶 氨曲南 卡那霉素 乙基西梭霉素 四环素 氯霉素
诺氟沙星
呋喃妥因
呋喃妥因
复方新诺明 四环素
二、药敏试验常用抗菌药物 的选择与分组
（三）药敏试验用抗菌药物的分组 美国临床和实验室标准委员会（CLSI）
将抗菌药物的选择分成 A、B、C和U组。 1.A组，为常规药敏试验的首选药物，其
结果应常规报告。 2.B组，包含一些临床上重要的特别针对
医院感染的药物，也可以作为首选药物，但 只是选择性地报告给临床。A组同类药物耐药 时，可选择性地报告B组中的一些结果。
二、药敏试验常用抗菌药物 的选择与分组
3.C组，为一些替代性或补充性的抗菌药物。 4.U组，包含某些仅用于治疗泌尿道感染的 抗菌药物(如呋喃妥因和喹诺酮类）。
三、药物试验结果的表示 及其临床意义