止消通脉宁对TGF—β1诱导的人肾小管上皮细胞CTGF、PAI—1、MMP—9mRNA表达的影响

止消通脉宁对TGF—β1诱导的人肾小管上皮细胞CTGF、PAI—1、MMP—9mRNA表达的影响目的观察止消通脉宁药物血清（以下简称“药物血清”）清干预转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导的人肾小管上皮细胞（HK-2）结缔组织生长因子（CTGF）、纤溶酶原激活物抑制物-1（PAI-1）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）mRNA的表达，探讨其在防治肾间质纤维化方面的作用。

方法将HK-2细胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12（1∶1）培养基培养。

实验分为空白对照组、单纯TGF-β1诱导组（TGF-β1 10 ng/mL）、空白血清对照组（TGF-β1 10 ng/mL+10%空白血清）、干预1组（TGF-β1 10 ng/mL+10%低剂量药物血清）、干预2组（TGF-β1 10 ng/mL+10%中剂量药物血清）、干预3组（TGF-β1 10 ng/mL+10%高剂量药物血清）。

药物干预24 h后，荧光定量PCR检测CTGF、PAI-1和MMP-9 mRNA的表达。

结果HK-2细胞经TGF-β1诱导后，CTGF、PAI-1 mRNA表达显著上升，MMP-9 mRNA表达减弱，与空白对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

经止消通脉宁药物血清干预后，CTGF、PAI-1 mRNA表达逐步下降，MMP-9 mRNA 表达逐步上升，与单纯TGF-β1诱导组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

结论止消通脉宁在一定程度上能够抑制TGF-β1诱导的人肾小管上皮细胞纤维化，其机制可能与调节纤维化细胞因子CTGF、PAI-1和MMP-9的mRNA表达有关。

标签：止消通脉宁；转化生长因子-β1；人肾小管上皮细胞；结缔组织生长因子；纤溶酶原激活物抑制物-1；基质金属蛋白酶-9糖尿病肾病（DN）是糖尿病最为常见的慢性微血管并发症之一，严重影响糖尿病患者的生活质量，甚至危及生命。

DN的发病机制尚未明确。

既往认为DN的早期病变部位在肾小球，近年来研究发现肾小管病变及肾间质纤维化的程度与肾功能的相关性更为密切，故肾间质纤维化的机制在DN的发展中越来越受到人们的重视[1]。

目前研究发现，肾间质纤维化的形成与多种纤维化细胞因子相互作用有关，调节纤维化细胞因子的正常表达在一定程度上能够抑制纤维化的发展。

止消通脉宁是北京中医药大学东直门医院著名老中医吕仁和教授治疗DN 的临床经验方，已在临床作为院内制剂应用多年，在治療DN方面具有一定的临床疗效[2-4]。

本实验通过观察止消通脉宁对转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导的人肾小管上皮细胞（HK-2）的结缔组织生长因子（CTGF）、纤溶酶原激活物抑制物-1（PAI-1）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）等纤维化细胞因子mRNA表达的影响，进一步探讨其对肾间质纤维化的作用，为其防治DN肾间质纤维化提供实验依据。

1 实验材料1.1 细胞株HK-2细胞，兰州大学实验中心提供。

1.2 动物Wistar大鼠48只，雄性，体质量（200±20）g，SPF级，甘肃中医学院动物中心提供，动物许可证号：SCXK（甘）2004-0006。

1.3 药物与试剂止消通脉宁颗粒（主要由黄芪、生地黄、鬼箭羽、夏枯草、莪术、大黄、三七等药物组成），北京市金药源药物研究院提供，批号20090701，6 g/袋，成人临床用量1袋/次，3次/d。

DMEM/F12（1∶1）细胞培养基，Gibco公司；胎牛血清，Hyclon公司；EDTA、胰蛋白酶，Amresco公司。

人重组TGF-β1，R&D System公司，根据说明书，用含1 mg/mL牛血清白蛋白的无菌弱盐酸（4 mmol/L）配制为1 ?g/mL的储存液，无菌EP管-70 ℃储存，用时配成10 ng/mL浓度[5]。

人CTGF、PAI-1、MMP-9 mRNA引物均由北京奥科生物技术有限责任公司合成。

1.4 仪器CO2培养箱，HEAL CELL HL90，LIKANG；超净生物安全柜，ESCD CLASS ⅡBSC，Airstream；倒置显微镜，Olympus X-71，Olympus，JAPAN；PCR仪，型号ABI7300，ABI公司；紫外可见分光光度计，UV1100 5970019，上海天美科学有限公司。

2 实验方法2.1 止消通脉宁药物血清制备48只雄性Wistar大鼠饲养于中国人民解放军兰州军区总医院屏障级动物实验室[许可证号：SYXK-（军）2007-022]，普通饲料喂养。

随机分为空白组及止消通脉宁低、中、高剂量，每组12只。

适应性喂养1周后，中药组分别按成人临床用量的5、10、20倍给予大鼠灌胃，空白组灌服同体积生理盐水。

给药前将大鼠禁食12 h，使其处于空腹状态，便于药物的吸收。

每次1 mL/100 g体质量，上下午各1次，间隔12 h，连续灌胃3 d。

于末次灌胃前8 h禁食不禁水；30 min 后，大鼠股动脉无菌采血；静置2 h，3 000 r/min冷冻离心20 min，取上清，将同组血清混合；56 ℃水浴灭活30 min，1.5 mL EP管分装后，-20 ℃低温保存备用。

2.2 细胞培养HK-2细胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 ?g/mL 链霉素DMEM/F12（1∶1）完全培养基，于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养。

每隔2～3 d换新鲜培养基1次，培养融合至80%以上，用含0.25%胰蛋白酶、0.05%EDTA 的消化液消化，用完全培养基终止消化后，1 000 r/min离心5 min。

用新鲜培养基将细胞重悬后进行传代培养。

实验前先用无血清培养基培养24 h使细胞同步化，实验重复3次。

2.3 分组将传代培养的HK-2细胞分为6组。

空白对照组：DMEM/F12培养液；单纯TGF-β1诱导组：DMEM/F12培养液+10 ng/mL TGF-β1；空白血清对照组：DMEM/F12培养液+10 ng/mL TGF-β1+10%空白血清；干预1组：DMEM/F12 培养液+10 ng/mL TGF-β1+10%低剂量止消通脈宁药物血清；干预2组：DMEM/F12培养液+10 ng/mL TGF-β1+10%中剂量止消通脉宁药物血清；干预3组：DMEM/F12培养液+10 ng/mL TGF-β1+10%高剂量止消通脉宁药物血清。

2.4 人肾小管上皮细胞结缔组织生长因子等纤维细胞因子表达测定细胞以6 000个/孔的密度接种于96孔板中，每孔200 ?L，每组设3个复孔，培养过夜。

吸弃细胞上清，加入无血清培养基同步化24 h。

再次弃细胞上清，按照分组加入相应药品的培养液200 ?L，继续培养24 h。

提取RNA进行PCR实验操作。

总RNA的抽提：用枪头吸尽培养基，向各孔中加入125 ?L×2的Washing Buffer。

用枪头吸尽Cell AmpTM Washing Buffer，后向各孔中加50 ?L Processing 溶液，反复吹打Processing液后，移至微量离心管中。

75 ℃水浴5 min，分装得到的细胞裂解液。

将提取出的总RNA进行完整性分析及纯度测定。

反转录反应：根据RT反应体系（见表1），于PCR管中相应体积的5×PrimeScriptTM Buffer，PrimeScriptTM RT Enzyme Mix I，Oligo dT Primer （50 ?mol/L）×1，Random 6 mers，RNase Free dH2O分装，再加入RNA样品，迷你离心机混匀，进行PCR反转录反应（37 ℃、15 min，85 ℃、5 s），反转录所得产物为模板cDNA，-20 ℃保存以备后续扩增用。

此过程均在冰上操作。

PCR扩增反应：根据PCR反应体系组份（见表2），于PCR管中加入相应体积的SYBR Premix Ex TapⅡ（2×），PCR Forward Primer（10 ?mol/L），PCR Reverse Primer（10 ?mol/L），dH20和cDNA模板，迷你离心机混匀。

两步法PCR 扩增程序：①预变性95 ℃、31 s；②PCR反应：95 ℃、5 s，64 ℃、40 s，×50。

上述组份在冰上配置。

结果分析：β-actin被扩增作为对照，荧光实时PCR反应结束后，由实时荧光定量PCR仪自动分析软件Pathogen Suite V1.0软件确定阈值，进而确定各反应样本的CT值，采用相对定量的2-△△CT法分析PCR结果，确定各样本之间基因的表达差异（每种细胞因子单独测定其基因表达）。

3 统计学方法数据符合正态分布，采用SPSS13.0统计软件进行分析，数据用—x±s表示，组间比较采用方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

4 结果荧光定量PCR结果表明，HK-2细胞经TGF-β1 10 ng/mL作用24 h后，促纤维化细胞因子CTGF、PAI-1 mRNA的表达显著增强，MMP-9 mRNA表达减弱，与空白对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），但和止消通脉宁药物血清共同作用后，CTGF、PAI-1 mRNA的表达受到抑制，MMP-9 mRNA表达上调，特别是药物血清高浓度作用更为显著，与单纯TGF-β1诱导组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

结果提示止消通脉宁具有调控TGF-β1诱导HK-2细胞纤维化因子CTGF、PAI-1、MMP-9 mRNA表达的作用，并且各浓度组表现出一定的量效关系，而空白血清无类似作用。

结果见表1。

5 讨论目前认为，几乎所有慢性进行性肾脏疾病都是纤维化破坏过程的结果。

由于肾间质纤维化的程度与肾功能受损的程度密切相关，而且早期肾间质纤维化可完全逆转，近来的研究已集中于肾间质纤维化的分子学发病机制。

哺乳动物体内已发现许多促肾间质纤维化的分子，如TGF-β、CTGF等；同时也发现存在许多抗肾间质纤维化的分子，如MMPs、骨形成蛋白-7、肝细胞生长因子等[6]。

鉴于纤维化的发展与细胞因子网络关系密切，调控纤维化因子的正常表达将成为防治纤维化的一条新途径。

现代医学针对肾间质纤维化的防治措施主要有应用血管紧张素转化酶抑制剂（ACEI）、血管紧张素受体拮抗剂、TGF-β1中和抗体或天然拮抗剂、基因治疗等，但其抗肾纤维化效果并不理想。

近年来，中医药从扶正固本、活血化瘀、清热利湿、化浊排毒等多个角度，由单味中药、中药有效成分及中药复方制剂多方面进行抗纤维化的实验及临床研究，取得了一定的效果[7-10]。

目前研究发现，CTGF作为TGF-β的下游因子，是TGF-β活性的重要调节者，其与受体结合诱导成纤维细胞增生、基质蛋白质合成及整合素的表达。