NF-κB-p65信号分子参与重组蛋白药物Kallistatin抑制人脐静脉内皮细胞侵袭作用

NF-κB-p65信号分子参与重组蛋白药物Kallistatin抑制人脐静脉内皮细胞侵袭作用黄恺飞【摘要】The effection and the molecular mechanism of recombinant Kallistatin (rhKal) on the anti-invasion of endothelial cell were studied by transfected NF-κB-p65 eukaryotic expression plasmid. HUVEC cells were transfected by NF-κB-p65 eukaryotic expression vector which was constructed by genetic recombination technology. The expression of p65 protein was also detected by Western blotting. The invasion of transfected HUVEC cells was detected by Transwell chamber after treated with recombinant Kallistatin. The expression of invasion associated protein was detected by Western blotting in endothelial cells which were transfected by NF-κB-p65 expression vector. The results showed that the expression of p65 was significantly increased after transfected with NF-κB-p65 eukaryotic expression vector. Overexpression of p65 gene can reverse the inhibitory of invasion on HUVEC cells by rhKal. Overexpression of p65 gene can significantly increase downstream target genes of NF-κB signaling pathway after treated with rhKal. In conclusion, This study showed that the recombinant Kallistatin could inhibit HUVEC cell invasion in vitro, and its molecular mechanism may be related to the NF-κB signaling pathway.%通过构建NF-κB-p65真核表达质粒，研究NF-κB-p65在重组Kallistatin (rhKal)抑制内皮细胞侵袭中的作用及其分子机制。

利用基因重组技术构建NF-κB-p65真核表达质粒载体，转染入HUVEC细胞，检测NF-κB-p65蛋白表达变化；Transwell小室观察重组Kallistatin对转染NF-κB-p65真核表达质粒HUVEC细胞侵袭的影响；Western blotting检测过表达p65对重组Kallistatin对内皮细胞侵袭相关蛋白抑制作用的影响。

人脐静脉内皮细胞转染NF-κB-p65真核表达质粒载体后，细胞内p65蛋白表达明显升高；p65过表达可以逆转rhKal对HUVEC 细胞体外侵袭的抑制作用；过表达p65可以明显抵抗rhKal对NF-κB信号通路下游相关靶基因的抑制作用。

研究表明重组Kallistatin明显抑制HUVEC细胞体外侵袭，其分子机制可能与NF-κB信号通路相关。

【期刊名称】《生物学杂志》【年(卷),期】2015(000)003【总页数】5页(P4-8)【关键词】Kallistatin;HUVEC;NF-κB;侵袭;信号通路【作者】黄恺飞【作者单位】厦门市医药研究所药物研发中心，福建厦门361008; 厦门南方海洋研究中心，福建厦门361008【正文语种】中文【中图分类】R363.1Kallistatin（Kal）又称组织激肽释放酶结合蛋白，具有独特的丝氨酸蛋白酶抑制剂活性，随后发现其参与高血压［1-2］、炎症［3-4］、血管生成［5-6］、肿瘤［7-8］等多种疾病的发生和发展过程，是一个极具临床应用前景的蛋白类药物。

近些年来，Kallistatin的抗血管生成作用倍受大家的关注［9-10］。

血管生成过程伴随着血管内皮细胞的增殖、迁移和重构。

抑制血管内皮细胞的增殖或侵袭成为抗血管生成的重要靶标之一。

p65具有TAD反式激活结构域，是NF-κB家族中含量最丰富、功能最重要的亚基，其参与了多种靶基因的表达调控，从而影响了多种生理还能，是目前研究NF-κB信号通路的关键分子［11］。

目前认为NF-κB刺激癌症发生与刺激促进肿瘤转移、细胞生长、抑制凋亡、促进血管生成等密切相关［12-13］。

本研究首先通过基因工程方法获得高纯度的Kallistatin蛋白；构建NF-κB-p65真核表达质粒载体，转染HUVEC细胞；观察重组Kallistatin对转染NF-κB-p65真核表达质粒HUVEC细胞侵袭的影响；最后检测过表达p65对重组Kallistatin对内皮细胞侵袭相关蛋白抑制作用的影响，明确NF-κB-p65信号分子在Kallistatin抑制人脐静脉内皮细胞侵袭中的作用。

1.1材料1.1.1 试剂转染试剂Lipofectamin TM 2000（美国Invitrogen公司）；RPM I1640培养基、胎牛血清（GIBCO公司）；琼脂糖（赛百盛公司）；限制性内切酶（NEB公司）；Taq polymerase、dNTP（Takara公司）；蛋白裂解液、蛋白提取试剂（海门碧云天公司）；双抗（青链霉素）（Hyclone公司）；硝酸纤维素（NC）膜（厦门泰京生物有限公司）；NF-κB65,NF-κB50,ICAM-1,MMP-2,MMP-9, VEGF,酶标二抗多克隆抗体（武汉博士德公司）；YPD液体培养基、BMG培养基、FM 21基础发酵培养基（由本实验室配置），细胞培养板（CorningCostar公司）；Thincert小室（Greiner公司）。

1.1.2 仪器和细胞株荧光倒置显微镜（日本Nikon）；多功能酶标仪（美国MD公司）；PCR仪（美国Bio-RAD公司）；水平、垂直电泳槽(美国Bio-RAD公司）；CO2培养箱（新加坡ESCO公司）；人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC细胞）由本实验室提供。

1.2 方法1.2.1 rhKal蛋白的表达和纯化取实验室保存的含有pPIC9-Kal质粒的GS115 (His4)菌30μL接入8m L YPD液体培养基中，恒温摇床内，28℃，220 r/min培养18～24 h，D（λ）值达到0.5以上，培养的发酵种液再以1∶50的比例接种于250 m LBMG培养基中，诱导表达16 h左右，当D（λ）值达到0.5以上，并镜检没有染菌，再以1∶20比例接种于4 L FM 21基础发酵培养基中扩大培养。

连续培养108 h放罐后，菌液10000 r/min，4℃离心30m in，弃菌体，收集上清进行纯化。

Western blotting方法对重组Kallistatin蛋白进行鉴定。

1.2.2 p65真核表达载体构建人脐静脉内皮细胞用含有10%小牛血清的RPM I-1640培养基，放置于37℃、5%CO2和100%湿度条件下培养，利用酸性异硫氰酸胍法提取总RNA，用M-MLV逆转录酶和Oligo(dT)18引物逆转录合成cDNA第一链，并作为模板进行PCR扩增。

根据GenBank中人p65序列（登录号：RELA NM-021975）设计引物，上游引物P1：5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3'，下游引物P2：5'-TTATTAGGAAAGGACAGTGGG-3'，分别引入了Xho I/Kpn I酶切位点。

PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2min，共30个循环；72℃延伸10m in；4℃保存。

将PCR扩增得到的p65片段切胶回收后，同时与质粒GV141一起进行Xho I/Kpn I酶切，纯化试剂盒纯化酶切PCR 产物，4℃下T4连接酶连接过夜。

连接产物转化入大肠杆菌DH 5α中保存，筛选阳性克隆菌，提取质粒进行PCR、酶切验证，并测序。

重组质粒GV141-p65经鉴定引物为上游：CCACCTCGACGCATTGCTG；下游：TTATTAGGAAAGGACAGTGGG。

1.2.3真核表达质粒p65 cDNA细胞转染转染前1 d将HUVEC细胞培养于含10%胎牛血清的1640培养基中，调整细胞浓度为3×105/m L，接种于24孔培养板中培养24 h，待达到80%～90%细胞融合，弃上清，用无血清1640培养基洗涤细胞2～3次，加Opti-MEM I无血清培养基培养细胞，准备转染。

移去24孔板中的原培养基，用Opti-MEM I培养基清洗细胞3次。

将转染混合液加入细胞板中，每孔100μL，轻轻混匀。

空质粒以200μLOpti-MEM I无血清培养基代替。

用Opti-MEM I培养基补液到总体积500μL，培养12 h。

用10%1640培养液洗细胞3遍，加入1m L 1640完全培养基继续培养。

1.2.4 Transwell侵袭小室实验HUVEC细胞分别转染p65cDNA及GV141空载体24 h后，加入80μg/m L rhKal继续培养20 h后，制备成单细胞悬液，调整浓度为2.5×105个/m L；加入Thincert侵袭小室，培养20 h后，取出Thincert小室，擦除膜表面细胞；沿小室边缘将膜切下，膜下表面向上放入24孔培养板的孔中；甲醇∶冰醋酸（3∶1）固定10min，10%姬姆萨染液染色15～30m in；漂洗干净后随机选取6个视野计数细胞（呈紫色，200×）。

1.2.5 Western blotting实验取20μL蛋白质样品，进行12%SDS-PAGE电泳；半干式电转移法将凝胶上的蛋白质转移到NC膜上，恒流1 mA/cm2，3 h；将NC膜在丽春红中染色30 s，dH2O脱色至有清晰条带，将右上角剪去以区分蛋白面；将NC膜用封闭液室温封闭1.5 h；PBST洗膜2～3次，每次5～10min。