寡聚化和磷酸化α-突触核蛋白在不同年龄段食蟹猴脑不同部位突触小体中的表达分布

寡聚化和磷酸化α-突触核蛋白在不同年龄段食蟹猴脑不同部位突触小体中的表达分布杨巍巍;李昕;李旭冉;李旭颖;于顺【摘要】目的研究寡聚化(oligomer-α-synuclein,oligo-α-Syn)和磷酸化α-突触核蛋白(phosphorylated-α-Synuclein,p-α-Syn)在不同年龄段食蟹猴脑不同部位突触小体中的表达差异.方法酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测oligo-α-Syn与p-α-Syn在不同年龄段食蟹猴脑不同部位突触小体中的表达.结果在老年食蟹猴的前额叶、枕叶、颞叶、海马、纹状体和丘脑中,突触小体中寡聚化与磷酸化α-Syn表达较青年与中年猴显著增加,且差异有统计学意义(P＜0.01).结论食蟹猴颞叶、海马、纹状体和丘脑突触小体中α-Syn寡聚化与磷酸化表达呈增龄性增加.【期刊名称】《首都医科大学学报》【年(卷),期】2015(036)005【总页数】4页(P671-674)【关键词】寡聚化α-突触核蛋白;磷酸化α-突触核蛋白;食蟹猴;突触小体【作者】杨巍巍;李昕;李旭冉;李旭颖;于顺【作者单位】首都医科大学宣武医院神经生物学研究室,北京100053;帕金森病研究北京重点实验室,北京100053;首都医科大学宣武医院神经生物学研究室,北京100053;帕金森病研究北京重点实验室,北京100053;首都医科大学宣武医院神经生物学研究室,北京100053;帕金森病研究北京重点实验室,北京100053;首都医科大学宣武医院神经生物学研究室,北京100053;帕金森病研究北京重点实验室,北京100053;首都医科大学宣武医院神经生物学研究室,北京100053;帕金森病研究北京重点实验室,北京100053;北京脑重大疾病研究院帕金森病研究所,北京100053【正文语种】中文【中图分类】R338帕金森病(Parkinson's disease，PD)是一种以运动障碍为主要临床特征的复杂的神经退行性疾病。

目前，PD发病机制尚不清楚，但研究［1-3］显示PD发生与遗传因素及老龄化密切相关。

α-突触核蛋白(α-synuclein，α-Syn)是路易体的主要成分，是公认的与遗传性和散发性PD发生发展密切相关的蛋白［4-5］。

尽管近年来对α-Syn的研究取得了很多新的进展，但其参与PD的病理生理机制还不是很明确。

近来文献［6］报道在 PD患者脑组织中，90%的寡聚化及磷酸化α-Syn以突触小泡的形式存在于神经元突触前。

但是，突触小泡中寡聚化与磷酸化α-Syn在灵长类动物不同脑区的分布及其增龄性变化尚无人报道。

本课题以灵长类动物食蟹猴为模型，应用酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)证实 oligo-α-Syn 和 p-Syn在不同脑区突触小泡中的表达，观察oligo-α-Syn和p-Syn在不同脑区的表达差异及其与年龄的关系。

1 材料和方法1.1 材料健康食蟹猴(4～16岁)9只，购自广西雄森灵长动物养殖中心，实验动物许可证号:SYXK(桂)2009-0006，所有动物均有详细出生档案和检疫证书，动物研究方案经动物福利委员会(Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC)认证批准。

青年猴3只(4岁)，中年猴3只(10～11岁)，老年猴3只(15～16岁)。

兔抗人S129位点磷酸化α-Syn多克隆抗体(Santa Cruz公司，美国)，鼠抗人α-Syn单克隆抗体3D5由本室制备;生物素化的鼠单克隆抗体(康为世纪标记);4-硝基磷酸二钠盐(pNPP)(Sigma公司，美国);ELISA 96孔酶标板(Corning公司，美国);酶标仪(Tecan公司，瑞士);其他试剂为分析纯。

1.2 方法1)突触小体制备:取猴脑前额叶、颞叶、枕叶、海马、纹状体、丘脑6个部位组织，将血管软脑膜分离干净，滤纸吸干，称质量，以1:10(W/V)蔗糖溶液(0.32 mol)，在冰浴中内切式匀浆器匀浆，超速低温离心机离心，转速1 000 g，10 min后，弃除胞核及较大碎片，取上清，再次离心20 min，转速为15 000 g(4℃)，取沉淀物，即为突触小体。

以Tris-buffer 20 mmol(pH 8.3)悬浮，其蛋白浓度用BCA方法测定，制备好的匀浆置于-80℃低温冰箱中保存备用。

2)寡聚化α-Syn的ELISA检测:用质量浓度为1×10-3g/L的3D5单抗包被96孔酶标板，100 μL/孔，37℃孵育2 h，4℃过夜，PBST洗板。

10%BSA封闭，200μL/孔，37℃孵育2 h，PBST洗板。

加入倍比稀释的重组人α-Syn(0.5，0.25，0.125，0.006 25，0.031 25，0 mol/L)和待测样品，100 μL/孔，37 ℃孵育2 h，PBST 洗板，然后加入生物素化的3D5(1×10-3g/L)100 μL/孔，37℃孵育2 h，PBST洗板，再加入亲和素标记的碱性磷酸酶(1∶5 000)，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h，PBST 洗板，最后加入 pNPP，100 μL/孔，37 ℃显色30 min，405 nm 处测定吸光度值。

每次每个样品重复3孔，重复3次。

3)消化道中磷酸化α-Syn的ELISA检测:用质量浓度为1×10-3g/L的抗磷酸化丝氨酸129位点的兔多克隆抗体包被96孔酶标板，100 μL/孔，37℃孵育2 h，4 ℃ 过夜，PBST 洗板。

10%BSA 封闭，200 μL/孔，37℃孵育 2 h，PBST洗板。

加入待测样品，100 μL/孔，37 ℃孵育2 h，PBST 洗板，然后加入生物素化的3D5(1 ×10-3g/L)100 μL/孔，37 ℃孵育 2 h，PBST洗板，再加入亲和素标记的碱性磷酸酶(1∶5 000)，100 μL/孔，37 ℃孵育 1 h，PBST 洗板，最后加入pNPP，100 μL/孔，37 ℃ 显色 30 min，405 nm 处测定吸光度值。

每次每个样品重复3孔，重复3次。

1.3 统计学方法应用SPSS 18.0统计学软件进行统计分析。

计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间比较使用单因素方差分析法和均数两两比较LSD方法。

以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果2.1 检测寡聚体α-Syn和磷酸化α-Syn的 ELISA标准曲线的建立如图1A所示，本研究建立的检测寡聚化α-Syn的ELISA方法，可以较特异地识别样本中的α-Syn寡聚体，而在含有单体α-Syn溶液中，仅能检测到极低的信号。

根据α-Syn的起始浓度，计算出本方法的最低检测限为～48 ng/孔。

如图1B所示，本研究建立的检测磷酸化α-Syn的ELISA方法，可以较特异地识别样本中的p-α-Syn，而在含有非磷酸化α-Syn溶液中，仅能检测到极低的信号。

2.2 寡聚化α-Syn在不同年龄段猴不同脑区突触小体中的表达比较ELISA结果显示，在老年食蟹猴的前额叶、枕叶、颞叶、海马、纹状体和丘脑的突触小体中，寡聚化α-Syn表达较青年与中年猴显著增加，且差异有统计学意义(P＜0.01);其中，在颞叶、海马、纹状体和丘脑的突触小体中，寡聚化α-Syn呈增龄性增加(图2)。

2.3 磷酸化α-Syn在不同年龄段猴不同脑区突触小体中的表达比较ELISA结果显示，在老年食蟹猴的前额叶、枕叶、颞叶、海马、纹状体和丘脑的突触小体中，磷酸化α-Syn表达较青年与中年猴显著增加，且差异有统计学意义(P＜0.01);其中，在颞叶、海马、纹状体和丘脑的突触小体中，磷酸化α-Syn呈增龄性增加，与食蟹猴不同脑区突触小体中寡聚化α-Syn的改变相一致(图3)。

图1 ELISA法特异识别人寡聚化α-Syn与磷酸化α-SynFig.1 ELISA method to recognize only the oligomeric species or phosphorylation of human α-SynA:Effect of the concentration of α-Syn oligomers on the ELISA response.A solution of α-Syn in PBS at 100 μmol/L was incubated for 3 days at 37 ℃，diluted to 0～0.5 μmol/L in PBS，and transferred to a microtiter plate coated with immobilized mAb 3D5.B:Effect of the concentration of p-α-Syn on the ELISA response.A solution of p-α-Syn standard sample at 100 μmol/L was diluted to 0 ～0.5 μmol/L in PBS，and transferred to a microtiter plate coated with immobilized anti p-α-Syn antibody. α-Syn: α-synuclein.p-α-Syn:phosphorylaton α-synuclein.图2 寡聚化α-Syn在食蟹猴不同脑区突触小体中的表达Fig.2 Expression of oligo-α-Syn in synaptosome in brain regions of cynomolgus monkeysStatistical analysis of the synaptosome-α-Syn oligomers in the prefrontal lobe，occipital lobe，temporal lobe，hippocampus，striatum and thalamus of young，middle-aged，aged monkeys，respectively.*P ＜0.01 vs aged monkeys，#P ＜0.01 vs middle-aged monkeys，n=3.oligo-α-Syn: α-synuclein oligomer.3 讨论利用本室制备的α-Syn单克隆抗体(3D5)同时作为捕获抗体与检测抗体，笔者建立了可以检测寡聚化α-Syn的ELISA方法。

本研究利用α-Syn寡聚体与单体标准品检测此法的敏感度及特异度，发现其只能检测寡聚化α-Syn，并且吸光度值与寡聚化α-Syn浓度呈线性关系，而对于单体形式的α-Syn不识别，提示此法有较高的特异度。