_抗体效价的Elisa测定教学文案
ELISA法测定小鼠血清中流脑抗体效价
· 实验研究 · ７７
基础 。灭活Ａ组 链球菌 可导致这些 膜蛋 白含 量发生变 化 ，影 响ＲＢｃ膜 的功 能 ，进而导 致ＲＢＣ形态 改变 ，发生溶血 现象 。在实 验中还发现一 些ＲＢＣ膜 蛋白含量发生改变 ，其作用及 影响尚需要进一步探讨 。
本课题 完成之际 ，得 到了形态学 实验室尤敏 和庄宝祥 老师 ，生物 化学 与分子生物学 教研室主任 王小柯教授 和陈永老师 ，病 原生物学教 研室 岳启安教授 ，外语教学部 陈晓 日老师 的大力支持和 帮助 ，在此一 并致谢 。 参考 文 献 ［１】 Ｆｕｋｕｉｚｕｍｉ Ｔ’Ｉｎｏｕｅ Ｈ，Ｔｓｕｊｉｓａｗａ ｅｔ ａ１．Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ
［９］ Ｒｙｂｉｃｋｉ ＡＣ，Ｈｅａｔｈ Ｒ，Ｗｏｌｆ儿 ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｆ ｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ４．２ ｉｎ
ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ ａ ｐａｔｉｅｎｔ ｗ ｉｔｈ ａ Ｃｏｏｍ ｂｓ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ ａｎｅｍ ｉａ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ ｒｏｌｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ４．２ ｉｎ ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ａｎｋｙｒｉｎ ｏｎ
ａｎｔｉｇｅｎｓ ｔｈａｔ ｒｅａｃｔ ｔｏ ｓａｌｉｖａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｔｏｎｓｉｌｌａｒ
ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｒｍａｌｉｎ－ｋｉｌｌｅｄ Ｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ ｉｎ ｒａｂｂｉｔｓ［Ｊ］．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ，２０００，６８（２）：７２５—７３ １． 【２】 Ｆｕｋｕｉｚｕｍｉ Ｔ，Ｉｎｏｕｅ Ｈ，Ｔｓｕｊｉｓａｗａ Ｔ，ｅｔ ａ１．Ｔｏｎｓｉｌｌａｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ
_抗体效价的Elisa测定共52页
11、获得的成功越大，就越令人高兴 。野心 是使人 勤奋的 原因， 节制使 人枯萎 。 12、不问收获，只问耕耘。如同种树 ，先有 根茎， 再有枝 叶，尔 后花实 ，好好 劳动， 不要想 太多， 那样只 会使人 胆孝懒 惰，因 为不实 践，甚 至不接 触社会 ，难道 你是野 人。(名 言网) 13、不怕，不悔(虽然只有四个字，但 常看常 新。 14、我 惜我的 身体， 我用智 慧和知 识充实 我的头 脑。 15、这世上的一切都借希望而完成。 农夫不 会播下 一粒玉 米，如 果他不 曾希望 它长成 种籽； 单身汉 不会娶 妻，如 果他不 曾希望 有小孩 ；商人 或手艺 人不会 工作， 如果他 不曾希 望因此 而有收 益。-- 马钉路 德。
拉
60、生活的道路一旦选定，就要勇敢地 走到底 ，决不 回头。 ——左
56、书不仅是生活，而且是现在、过 去和未 来文化 生活的 源泉。 ——库 法耶夫 57、生命不可能有两次，但许多人连一 次也不 善于度 过。— —吕凯 特 58、问渠哪得清如许，为有源头活水来 。—— 朱熹 59、我的努力求学没有得到别的好处， 只不过 是愈来 愈发觉 自己的 无知。 ——笛 卡儿
血清抗体效价的检测方法
血清抗体效价的检测方法
血清抗体效价的检测方法主要包括免疫双向扩散法和酶联免疫吸附法（ELISA）。
免疫双向扩散法是一种简便的方法，其基本原理是抗原和抗体在同一凝胶内扩散，相遇后形成特异性的沉淀线。
具体操作步骤是将抗原与抗体分别加入同一凝胶板中两个相隔一定间距的小孔内，使两者进行相互扩散，当抗原抗体浓度之比相适宜时，彼此相遇形成一白色弧状沉淀线。
然而，该方法敏感性较低，易出现假阴性结果。
另一种常用的方法是酶联免疫吸附法（ELISA）。
该方法具有较高的灵敏度，将抗原置于反应板上，然后加入处理过的血清、组织液等检测样品液。
如果测试样本中有抗体，会与抗原结合。
然后加入酶标记的抗体，与样品中的抗体结合。
添加显色剂，显色后，通过吸光度测定抗体含量。
请注意，具体采用哪种检测方法可能需要根据具体情况进行选择，建议您咨询专业医师。
血清抗体效价的测定
实验报告
10.选择波长630nm，将酶标板置于载板台上，开始扫描，测定OD值。
结果如下所示：
思考题：
1.查阅资料，了解共有哪些类型的ELISA实验，以及本实验中所用ELISA属于哪一类？答：本实验中所用ELISA属于间接法ELISA。
①直接ELISA
原理：将抗原与固相载体连接，洗涤除去未结合的抗原及杂质。
加酶标抗体进行孵育。
固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。
彻底洗涤未结合的酶标抗体。
此时固相上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。
加底物反应。
直接法主要用于测定抗原。
②间接法ELISA
原理：将抗原与固相载体相连结，形成固相抗原。
洗涤除去未结合的抗原及杂质。
加入特异性一抗与固相抗原相结合，形成固相抗原抗体复合物。
经洗涤后，加酶标二抗。
固相免疫复合物中的抗体与酶标二抗结合，从而间接地标记上酶。
洗涤后，加底物显色。
③双抗夹心法ELISA
原理：双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子，但不适用于小分子抗原。
将特异。
抗体效价的Elisa测定-PPT精选文档
显示出生物放大作用，灵敏度ng,pg
60年代初期，Averameas & Ram等
Evaluation only. techniques) 建立了免疫酶技术 (immuห้องสมุดไป่ตู้oenzymatic
蛋白及酸性磷酸酯酶---抗体，统称为酶标记物或酶结
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酶联免疫测定仪的使用。
2.基本原理 免疫酶技术 : 酶标 Ab/Ag, 酶结合物的酶在免疫反应后， 作用于厎物后显色，根据颜色的有无和深浅，定量测定 Evaluation only. Ab/Ag。
eated with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0 免疫反应：一次或数次 具Ag,Ab特异的免疫学反应 Copyright 2019-2019 Aspose Pty Ltd.
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图二
间接型Elisa
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Ag-Ab-抗Ab-HRP
间接ELISA测定抗体的效价
间接ELISA测定抗体的效价【目的】测定样品中抗体的效价（Titer）【基本原理】将特异性抗原包被在固相载体上，加入含待测抗体的样品，使之与固相抗原结合（Ag-Ab），再加入酶标记的抗抗体（亦称二抗），与上述Ag-Ab复合物结合形成Ag-Ab-α-Ab-E复合物。
此时加入底物，复合物上的酶则催化底物而显色，以酶与底物的显色反应程度来确定待测抗体的效价。
由于每步之间均有冲洗步骤，因此若样品中不含相应的抗体，酶标抗体则将被洗掉，底物不显色而呈阴性反应。
间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。
1.包被固相载体常用聚苯乙烯微孔板，因为聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。
吸附主要为物理吸附，不发生化学反应，效果与缓冲液的浓度、pH、温育时间，载体表面性质等有关。
缓冲液宜偏碱性，离子强度较低，有利于蛋白质的吸附。
2.封闭由于血清中含有高浓度的非特异性抗体，因此在间接法中，抗原包被后一般用无关蛋白质(例如牛血清蛋白)再包被一次，以封闭固相上的空余间隙。
可用含1％BSA、1％明胶3－5％脱脂奶粉封闭。
酶标抗体可以用含BSA的PBS稀释，以减少非特异性吸附。
3.温育温育最好用水浴，室温也可，微孔板浮在水浴面可使温度迅速平衡。
且板上应加盖，避免蒸发。
应用酶促反应动力学原理，低温可提高结合率，高温可加速反应。
4.待测样品待测样品溶液中需不存在与标记酶相同的酶、底物、酶抵制剂和其它干扰因素，以防止干扰作用。
在检测过程中样本须先行稀释到适当浓度(1:40~1:200)，以避免过高的阴性本底影响结果的判断。
5.洗涤洗涤实验操作过程中决定实验成败的一个关键步骤。
目的是除去未结合的免疫反应物，终止抗原抗体的继续结合，除去标本中与反应无关的成分和游离的酶结合物以及反应过程中吸附在固相载体上的非特异性干扰物。
洗涤次数一般为3～4次，每次3分钟,要微微震荡，特别是最后一次，如有酶结合物的非特异吸附及残留，会使空白值升高，所以要使洗涤彻底。
抗体效价文档
抗体效价1. 简介抗体效价是用于衡量抗体对特定抗原的亲和力和活性的指标。
抗体效价通常用于评估抗体在抗体结合反应中的强度，并可用于确定抗体的适用范围和最佳使用浓度。
本文将介绍抗体效价的定义、测定方法以及影响抗体效价的因素。
2. 定义抗体效价是指一定条件下抗体与抗原相互作用的强度。
它通常用于评估抗体的亲和力和活性，衡量抗体与抗原结合的强度。
抗体的效价越高，其与抗原的结合能力越强，抗体的活性也就越强。
3. 测定方法3.1 双抗体夹心ELISA法双抗体夹心ELISA法是一种常用的测定抗体效价的方法。
该方法的原理是将待测抗体与特定抗原结合，然后通过加入二抗进行检测。
具体步骤如下：1.在96孔板中涂布目标抗原。
2.加入一定浓度的待测抗体，并孵育一段时间，使抗体与抗原结合。
3.清洗孔板，去除未结合的抗体。
4.加入二抗，它会与待测抗体结合。
5.加入底物并进行反应，测定反应产物的吸光度。
根据吸光度值可以计算出抗体的效价。
3.2 免疫沉淀法免疫沉淀法也是一种测定抗体效价的常用方法。
该方法的原理是将待测抗体与特定抗原结合，然后通过沉淀的方式去除未结合的抗体。
具体步骤如下：1.在待测抗原的溶液中加入一定浓度的待测抗体，并孵育一段时间，使抗体与抗原结合。
2.加入沉淀剂，将未结合的抗体和抗原沉淀下来。
3.用洗涤液清洗沉淀后的样品，去除沉淀剂。
4.进行离心，将沉淀物与上清分离。
5.用适当的缓冲液溶解沉淀物，获得抗体效价。
3.3 其他方法除了双抗体夹心ELISA法和免疫沉淀法，还有其他一些测定抗体效价的方法，如放射免疫法、荧光免疫法等。
这些方法各有特点，适用于不同类型的抗体和抗原。
4. 影响因素抗体效价受多种因素影响，包括抗体和抗原的浓度、孵育时间、温度等。
以下是一些常见的影响因素：4.1 抗体浓度抗体浓度是影响抗体效价的关键因素之一。
一般来说，抗体浓度越高，效价也就越高。
但是，过高的抗体浓度可能会造成非特异性结合，降低效价的准确性。
血清效价检测
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血清效价检测
一、技术说明
抗体效价测定是指测定抗体的物理状态及其在体内的滞留时间，以其与抗原反应的多少来表示其免疫效果。
本实验是采用间接ELISA检测血清效价。
二、技术原理
利用酶标记的抗体以检测已与固相结合的受检抗体。
三、技术流程：
（一）实验准备
（1）实验材料：免疫抗原
（2）试剂和耗材：1x PBS（pH7.2)：8gNaCl,0.2g KCl,3.62gNa2HPO4.12H2O, 0.24g KH2PO4定容至1L；BSA、PBST、HRP标记羊抗鼠二抗、TMB、1M HCl、酶标板。
（3）仪器和设备：恒温培养箱、酶标仪
（二）实验步骤
（1）抗原包被：抗原(PBS稀释，终浓度2μg/mL，100μL/孔)，4℃包被过夜。
（2）封闭：2%BSA(150Μl/孔)，37℃封闭2h。
（3）一抗孵育：血清首孔稀释1000倍后逐级稀释3倍梯度（PBS稀释，100μL/孔），37℃孵育1h，PBST洗5次，每次150μL。
（4）二抗孵育：加入对应二抗（Goat-anti-mouse-IgG-HRP，1%BSA稀释，100μL/孔）37℃孵育1h，PBST洗5次，每次150μL。
（5）显色：加入TMB100μL,室温避光显色10min。
（6）终止读数：加入100μl/孔1M HCl，终止反应，OD450读数。
自制多克隆抗体效价ELISA测定方法
自制多克隆抗体效价ELISA测定方法实验目的ELISA 方法检测自制多克隆抗体效价。
实验试剂均为常规试剂，尽量购买同一批次试剂，以保证实验的均一性。
实验设备和材料可拆卸ELISA板为JET公司产品。
操作步骤（一）最佳包被浓度的确定（方阵法）将重组蛋白1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400倍稀释，以100 μL每孔于四度包被过夜，PBST洗涤三次，每次350 μL，在滤纸或其他吸水纸上拍打干净，用5%的脱脂奶粉37℃封闭2 h，用阴性血清和阳性血清分别稀释1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12 800、1:25600倍稀释作为一抗，100 μL每孔，37℃孵育1 h，PBST洗涤三次后，用HRP标记的羊抗鼠二抗（具体浓度参考不同公司说明书的ELISA工作浓度），100 μL/孔，37℃孵育1 h，PBST洗涤三次后，加入新鲜配制的显色液，50 μL/孔，37℃作用15～30 min，加入终止液，50 μL/孔，然后在酶标仪上读取OD450 nm吸光值。
以阳性血清孔的OD值接近1.0，P/N 最大的抗原血清稀释度作为抗原最佳包被浓度。
（二）效价测定最佳包被浓度100 μL每孔包被ELISA板，4℃放置过夜，PBST洗涤三次，每次350μL，在滤纸或其他吸水纸上拍打干净。
5%脱脂乳37℃包被2 h，PBST洗涤三次，每次300 μL，在滤纸或其他吸水纸上拍打干净。
将阴性和阳性血清1:400开始进行四倍比稀释后，稀释12孔，以100 μL/孔加入ELISA板作为一抗37℃孵育1 h，PBST洗涤三次，每次350 μL，在滤纸或其他吸水纸上拍打干净。
加入HRP标记的羊抗鼠二抗，100 μL/孔，37℃孵育1 h，PBST洗涤三次每次350 μL，在滤纸或其他吸水纸上拍打干净。
加入新鲜配制的显色液，50 μL/孔，37℃作用15-30 min，加入终止液，50 μL/孔，然后在酶标仪上读取OD450 nm吸光值。
ELISA法测定单克隆抗体的效价的操作步骤
ELISA法测定单克隆抗体的效价的操作步骤摘要：ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。
免疫酶技术是将酶标记在抗体/抗原分子上，形成酶标抗体/酶标抗原，称为酶结合物。
该酶结合物的酶在免疫反应后，作用于底物使之呈色，根据颜色的有无和深浅，定位或定量抗原/抗体。
找产品，上生物帮>> >>一、实验目的1、深入了解ELISA法测定抗体效价的原理。
2、掌握ELISA法测定单克隆抗体效价的方法。
间接ELISA效价图二、实验原理ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。
免疫酶技术是将酶标记在抗体/抗原分子上，形成酶标抗体/酶标抗原，称为酶结合物。
该酶结合物的酶在免疫反应后，作用于底物使之呈色，根据颜色的有无和深浅，定位或定量抗原/抗体。
ELISA法是免疫酶技术的一种，其特点是利用聚苯乙烯微量反应板(或球)吸附抗原/抗体，使之固相化，免疫反应和酶促反应都在其中进行。
在每次反应后都要反复洗涤，这既保证了反应的定量关系，也避免了末反应的游离抗体/抗原的分离步骤。
在ELISA法中。
酶促反应只进行一次，而抗原、抗体的免疫反应可进行一次或数次，即可用二抗(抗抗体)、三抗再次进行免疫反应。
目前常用的几种ELISA方法有：测定抗体的间接法，测定抗原的双抗体夹心法和测定抗原的竞争法等。
本实验采用间接法测定单克隆抗体效价。
其主要过程为：首先将已知定量抗原吸附在聚苯乙烯微量反应板的凹孔内，加待测抗体，保温后洗涤以除去未结合的杂蛋白质，加酶标抗抗体，保温后洗涤，加底物保温30分钟后，加酸或碱终止酶促反应，用目测或光电比色测定抗体含量。
三、仪器、原料和试剂仪器聚苯乙烯96孔酶标板、微量移液管、酶联免疫阅读仪、水浴锅。
原料单克隆抗体试剂1、抗原及酶标记抗体①抗原：兔抗人IgG(RabbitAanti-humanIgG，CodeNo.A0423);②酶标抗抗体：兔抗鼠IgG-HRP(RabbitAnti-mouseIgG-HRP，CodeNo.P0260);均为DAKO公司产品，使用时按照说明书要求稀释。
实验六抗体效价的Elisa测定(共34张PPT)
3 按“READ”键，酶标板推进入仪器，开始读数并计数，打
印机输出数据。
4 按“MAIN MENU”键回到主菜单，关闭电源。
酶标板的清洗：采用ELx50TM型微孔板洗板机，注射泵驱
动的液体输送，氧化物酶：10－20pg
碱性磷酸酶：10－50pg
Anti-human immunoglobulin coupled to an enzyme. This is the second antibody, and it binds to human antibodies.
substrate which changes color when cleaved by the enzyme attached to the second antibody.
petitive elisa same epitope Coat with bait pr
Incubate with primary antibody anti bait pr and various concentration prey protein
4. 操作方法
4.1 包被特异性抗原:固体抗原(如蛋白质)用包被液稀释至10Oμg/ml，每凹孔 加100μL，加盖置4℃过夜(37 ℃ 2h)【已完成】
次日倾去凹孔内液体，用滴管取洗涤液在每孔中加满稀释/洗涤液洗涤3次， 首次洗涤静置2min后倾去，后两次静置1min。将反应板扣放在滤纸上，以除净液
体。
4.2 封闭: 每孔中加满封闭液（约300ul多），加盖或用封口膜封板，置37℃恒
温箱60min，倾去孔内液体，按上法洗涤3次。
4.3 加待测血清(内含抗体)、阴性血清(无 抗体)及稀释液(PBS/Tween):
ELISA酶联免疫吸附(ELISA)法检测抗体的效价 华中农业大学免疫学基础及免疫学技术
免疫标记技术
1.定义：
将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用放射 性同位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原，通 过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。
2.分类：
ü 放射免疫测定法：131I，32P ü 免疫荧光技术：FITC，PE ü 免疫酶测定法：HRP，AP
ü 洗涤液：含0.05% Tween 20的0.01M pH7.4 PBS（氯化钠 8.5g,十二水磷酸氢二钠2.85克或二水磷酸氢二钠1.13克， 氯化钾0.2克，磷酸二氢钾0.27克，蒸馏水1000毫升 ）
ü 底物溶液：TMB溶液 ü 2M H2SO4 （市售浓硫酸为18.4M，根据要配制的2M硫酸体
酶联免疫吸附试验
（以间接性ELISA为例）：
实验材料
ü 牛血清白蛋白（BSA)—— 抗原，2%（W/V）溶液，PBS 配制
ü 小鼠抗血清—— 待测样品，用PBST从1：1000开始倍 比稀释，连续稀释8个稀释度
ü HRP标记羊抗小鼠IgG —— 二抗（按说明书稀释使用， 用PBST稀释）
ü 包被缓冲液：0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液（NaHCO3 1.59克，NaHCO3 2.93克，加水至1L）
• 阳性：显色为黄色 • 阴性：无色
1 23 4
阴性 阴性 阳性 阳性
注意事项
• 洗涤彻底，避免交叉污染。 • 按顺序加样，孔底无气泡。 • 包被和温育在湿盒内进行。
12 34
空 阴阳待 白 性性测
3.加二抗：
甩干孔内液体 以洗涤液（200色：
各孔加入酶标二抗100μL/孔 37℃，保鲜膜包好，45min
甩干孔内液体 以洗涤液（200μL/孔）洗涤4次，3min/次
18多克隆抗体制备——抗体效价的检测(ELISA)
间接ELISA法效价检测抗血清效价通过间接ELISA法来确定抗原最佳包被浓度 (方阵滴定，也叫棋盘滴定法) 。
以兔高免血清多抗效价检测为例1. 抗原用包被缓冲液CBS (0.05M碳酸盐缓冲液，pH9.6)按1μg/ml浓度用作连续1:2倍比稀释，每个稀释度包被一行（12孔/行）,100μl/孔加入酶标板中，覆膜密封（防止水分挥发）4℃包被过夜(12h以上)。
2. 次日甩掉板中液体，在吸水纸上拍干板子，每孔加入150μl封闭液(含2% BSA的包被缓冲液CBS），室温（25℃）2h以上。
3. 用洗涤液PBST[含0.05% Tween-20的PBS(pH7.4)]洗板3次，此时将待测高免阳性血清和空白阴性血清用抗体稀释液（含1% BSA 的PBS缓冲液,pH7.4）分别从1:500开始做连续1:2倍比稀释，按下图分布模式100μl/孔，37℃ 1h。
4. 取出拍干，洗涤液洗板3次，每孔加入100μl二抗工作液（用抗体稀释液1:3000稀释HRP标记羊抗兔IgG，Frdbio，Cat No.:SAB90200H）,37℃孵育1h。
5. 取出拍干，洗涤液洗板3次，每孔加入100μl单组份TMB底物（Frdbio,Cat No.:ELS0010），室温孵育5～20min（根据颜色的改变速度）。
6. 每孔加入50μl终止液（0.5M H2SO4）。
7. 在酶标仪上读取450nm/630nm的吸光度。
标准的结果分布模式应该如上图所示： ELISA酶标板显色由阴阳性区域第一行第一列孔向外显均匀放射状递减；如果在包被梯度方向上OD450过高无梯度，应该继续降低包被浓度；反之，则增加。
同理，如果在免疫血清稀释度方向上OD450过高无梯度，则应继续加大稀释度，反之，则减小。
8. 最佳包被浓度的确定:阳性血清区域内某个孔对应的OD值与其上/其左孔OD值恰好为2倍关系且OD值不低于1.2,且此孔对应的阴性血清区域OD值与空白对照孔OD值无差异，此孔包被的抗原浓度的2倍确定为抗原的最佳包被浓度。
实验六抗体效价的Elisa测定
自动酶标仪（Elx800UV）使用程序
1 开机，进行System self-test…
2 按“DEFINE”键，进入“SELECT ASSAY NUMBER”， 用 “NUMERIC”或“OPTION”键输入测试号（注：assay 01 为quick read，最大测试号为55）；按“ENTER”键修改 测试的“NAME”；再按“ENTER”键进入下列菜单：
(1)聚苯乙烯微量反应板应选择高质量、非特异性吸附小的产品。包 被物应具有较高的纯度，其浓度一般在1～100μ g之间，在偏碱条件下易吸 附于反应板的凹孔中，4℃放置过夜较理想，若暂时不用，可加入终浓度为 0.02% NaN3，4℃贮存，也可倾去包被液，干燥后置硅胶干燥器中，室温存 放3个月以上不影响测定效果。
Anti-human immunoglobulin coupled to an enzyme. This is the second antibody, and it binds to human antibodies.
substrate which changes color when cleaved by the enzyme attached to the second antibody.
7 1:100,000
板，置37℃恒温箱1h，使抗体与固相
8 1:500,000
抗原进行特异性结合，反复洗涤3次。
1 PBS/Tween
2 1:100阴性血清
3 1:1,000
4 1:5,000
5 1:10,000 6 1:50,000
阳性血清
7 1:100,000
8 1:500,000
4.4 加酶标抗体:加入HRP-抗体(抗抗体，本实验中已经根据说明书 稀释一千倍)，每孔加l00μ L，封板后置37℃温育lh，按上法至 少洗涤5次，最后用蒸馏水洗涤2次，扣在滤纸上吸干水分。
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petitive elisa same epitope
Coat with bait pr Incubate with primary antibody anti bait pr and various
concentration prey protein(竞争同一表位。
外套与诱饵蛋白 培养初级抗体抗诱饵蛋白及不同浓度的猎物蛋白)
酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay 简称为Elisa)-----是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技 术。本法兼有灵敏度高和特异性强两方面的优点。
1974年 Voller等 用聚苯乙烯微量反应板作为免疫吸附剂吸附抗体(抗 原)，再与相应的酶标记物结合 操作更方便，易重复 灵敏度可高达ng（10-9g）至pg(10-12g)，
HIV (human immunodeficiency virus) detection
Partially purified, inactivated HIV antigens
antigens pre-coated onto an ELISA plate
部分纯化，灭活病毒抗原 抗原涂到酶标板
Patient serum which contains antibodies. If the patient is HIV+, then this serum will contain antibodies to HIV, and those antibodies will bind to the HIV antigens on the plate.病人血清中含有抗体。如果病人是艾滋病毒+，那么这个血清含有
4.3 加待测血清(内含抗体)、阴性血清(无抗体)及稀释液 (PBS/Tween):
待测血清按倍比法用稀释液稀释(1:100、1:200等)，阴性血清也稀释 成1:100，取不同稀释度的待测血清，阴性血清及稀释液(PBS/Tween) 各1OOμL加至相应的凹孔中，加盖或封板，置37℃恒温箱1h，使抗体 与固相抗原进行特异性结合，反复洗涤3次。
Patient A O.055
Patient B 0.412
Patient C 1.999
Assay Control 0.123
Protein protein interaction---ELISA
1. Direct elisa different epitope Coat with prey protein Incubate with bait protein Pimary Ab anti bait protein ----直接酶联免疫吸附试验不同表位 外套与猎物蛋白 孵化与诱饵蛋白 原发性抗体抗诱饵蛋白
实验五 酶联免疫吸附测定BSA抗体效价
1.目的要求 (1)学习酶联免疫吸附测定的基本原理。 (2)掌握酶联免疫吸附测定技术，抗体的效价测定及 酶联免疫测定仪的使用。
2.基本原理
免疫酶技术:酶标Ab/Ag,酶结合物的酶在免疫反应后， 作用于厎物后显色，根据颜色的有无和深浅，定量测定 Ab/Ag。
免疫反应：一次或数次 具Ag,Ab特异的免疫学反应
艾滋病毒抗体，这些抗体可以绑定到病毒抗原板
Anti-human immunoglobulin coupled to an enzyme. This is the second antibody, and it binds to human antibodies.抗人免疫球蛋白耦合酶。这是继抗体，并结合人类抗体
substrate which changes color when cleaved by the enzyme attached to the second antibody.
基板而改变颜色，当裂解酶附二抗体
positive
negative
Positive Control 1.689
Negative Control 0.153
超微结构及分子水平上, 分析方法，对体液中的半
对抗原抗体反应进行定 抗原、抗原或抗体进行定
性和定位研究
性和定量测定
酶标技术
酶------性能稳定、经济易得、底物无色、产物显色， 便于检测 常用的酶:碱性磷酸酯酶、辣根过氧化物酶(horserad peroxidase简称HRP)、葡萄糖氧化酶、半乳糖苷酶等。
(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
免疫标记技术
标记抗体或抗原
荧光素、放射性同位素、酶、 铁蛋白、胶体金及化学(或生物) 发光剂
镜检观察或进行自 动化测定
荧光显微镜，射线测量仪，酶标 检测仪，电子显微镜和发光免疫 测定仪等
直接在细胞、亚细胞、 应用各种液相和固相免疫
4. 操作方法
4.1 包被特异性抗原:固体抗原(如蛋白质)用包被液稀释至10Oμg/ml， 每凹孔加100μL，加盖置4℃过夜(37 ℃ 2h)，次日倾去凹孔内液体， 用滴管取洗涤液在每孔中加3～4滴，静置3min后倾去，重复3次，将反 应板扣放在滤纸上，以除净液体。
4.2 封闭: 每孔中加入200－400μL封闭液，加盖或用封口膜封板，置 37℃恒温箱60min，倾去孔内液体，按上法洗涤3次。
酶促反应：只进行一次
显示出生物放大作用，灵敏度ng,pg
60年代初期，Averameas & Ram等
建立了免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)
利用特殊的交联剂研制出辣根过氧化物酶---人血清白 蛋白及酸性磷酸酯酶---抗体，统称为酶标记物或酶结 合物，用于抗原或抗体的示踪、定位或定量测定
戊二醛法， 过碘酸氧化法 将酶与Ab交联在一起
Ag-Ab黄色，OD450)+H2O
图一 直接型Elisa
图二 间接型Elisa
图三 双抗体夹心型ELISA
图四 固相抗体竞争型ELISA 未知抗原量=A（1）-A（2）
每次反应后都要反复洗涤？ 1. 保证反应的定量反应 2. 防止重叠反应，引起非特异现象。