常用酶标抗体制备的技术与方法

(一)酶标抗体的条件

1.纯度高、含杂蛋白少,用IgG优于血清抗体，用Fab优于IgG。

2.特异性强即抗IgG与IgG在免疫电泳上只有一条沉淀线,与IgG的全血清也只有一条沉淀线,这才算是特异性的单价抗体。

3.效价高一般琼脂扩散鉴定为1：64以上才算合格。

(二)酶标记方法

1.交联法交联法通常用的交联剂是戊二醛，戊二醛商品大多为25%的水溶液，利用戊二醛分子上对称的两个醛基，分别与酶和蛋白质分子中游离的氨基、酚基等以共价键结合而进行标记。标记时应尽量采用新鲜纯品，当戌二醛的OD235nm/OD280nm<3时，即为好的交联剂。

戊二醛交联法又分为一步法和二步法。

(1) 一步法：即把酶、戊二醛和抗体一起加入进行交联。然后透析出过量的戊二醛而制备出具有高分子量的酶结合物。由于抗体分子量大(16万)，酶分子量小(4万),抗体分子的氨基数比酶蛋白分子氨基数多得多，结果生成的抗体-戊二醛或抗体-戊二醛-抗体多而造成酶标物的活性小。一步法操作：①抗IgG-AKP的制备：将10mgAKP溶于含有5mg抗IgG的1mlPBS(0.01Mol/L pH7.0)中，在冰浴中缓缓搅拌，尽量避免气泡产生，完全溶解后，缓缓滴加1%戊二醛溶液4ml，使戊二醛的最终浓度为0.2%，移至室温中静置2h~3h后，以0.01Mol/L pH7.0 PBS 液4℃充分透析或以SephadexG25柱除去过量的戊二醛，4℃保存备用(也可保存于50%甘油中置低温冰箱);②抗IgG-HRP的制备：将12mgHRP溶于含5mg抗IgG 的1mlPBS(0.1Mol/L pH6.8)中,缓慢搅拌下加入1%戊二醛溶液4mL，置室温2h~3h，充分透析或以SephadexG25除戊二醛，小量分装后保存于低温冰箱，避免反复冻融。或冷冻干燥保存。

(2) 二步法：是先使酶与戊二醛反应,除去未反应的戊二醛，再使已“活化”的酶分子与抗体分子的氨基结合，最后加入少量的赖氨酸封闭被戊二醛激活的酶的残基。二步法操作：将10mg的酶溶于0.2ml含1.25%戊二醛的0.1mol/L pH6.8 PBS 中室温放置18h，充分透析或以SephadexG25柱除去未反应的戊二醛。加生理盐水至1ml然后加入1ml(含5mg)的抗体溶液和1ml 1Mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液，混合后4℃冰箱放置24h，加入0.1ml 0.2mol/L赖氨酸，置室温2h，以0.15Mol/L

pH7.2 PBS液充分透析，离心去沉淀，上清液即为酶结合物，再进一步以硫酸铵沉淀纯化后应用。AKP一般不采用二步法,而只用一步法。

改良HRP二步标记法：取HRP10mg溶于0.4ml,0.25Mol/L pH6.8PBS液中或0.05Mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液中，加入25%戊二醛0.1ml，37℃温育2h后加入冰冷的分析纯的无水乙醇2ml，2 500r/min离心沉淀10min~15min，倾去溶液。沉淀以80%乙醇4ml~5ml混悬，同上离心，倾去乙醇，将管倒置，使乙醇充分流出。沉淀用1ml 0.05Mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液溶解，加入0.5ml~1ml 抗IgG 抗体溶液(含抗体15mg左右)，放在冰箱内过夜后，加KH2 PO4，使近中性即可应用。

2.氧化法采用过碘酸钠，过碘酸钠是强氧化剂，能将HRP的甘露糖部分(与酶活性无关的部分)的羟基氧化成醛基，然后与抗体的氨基结合,形成酶标抗体。(1)氧化法操作过程如下：将5mgHRP溶于新配制的1ml 0.30Mol/LpH8.1重碳酸钠中，加0.1 ml 1%氟二硝基苯(FDNB)无水乙醇溶液,在室温中混合后，再加入1ml 0.04Mol/L~0.08Mol/L过碘酸钠(NaIO4)，置室温中轻搅30min，在溶液呈黄绿色时，加1ml 0.16Mol/L乙二醇溶液，在室温中放置1h，使氧化反应中止，然后在4℃中对0.10Mol/L pH 9.5重碳酸钠缓冲液透析，换液3次。在3ml HRP-醛基溶液中，加入5mg(溶于1ml的碳酸盐缓冲液中)，室温置2h~3h，加入5mg 氢化硼钠(NaBH4)，于4℃冰箱放置3h或过夜，然后用PBS液充分透析，离心去沉淀物。上清液即为酶结合物，纯化后使用。

(2)改良过碘酸钠法：①取5mg HRP溶于0.5ml双馏水中，加入新配制的0.06Mol/L NaIO4水溶液(10ml双馏水+128mg NaIO4) 0.5ml，混匀，置4℃30min;②取出后加入0.16Mol/L乙二醇水溶液(10mlH2O+0.09ml乙二醇)0.5ml，室温放置30min;

③加入含5mg纯化抗体的水溶液1ml，混匀，并装入透析袋，对0.05Mol/L pH 9.5碳酸盐缓冲液缓缓搅拌透析6h(或过夜)，使之结合;④加入NaBH4溶液(5mg/ml)0.2ml，混匀，置4℃2h;⑤在以上溶液中缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液，混匀，4℃30min，离心，去上清，沉淀以少许0.02Mol/L pH7.4 PBS液溶解，装入透析袋，以同样液体在4℃透析除盐过夜;⑥次日取出离心，以除去不溶物，即得酶-抗体(HRP-IgG)结合物，以0.02Mol/L pH 7.4 PBS液加至5ml;⑦效价测定合格后，加入等量优质甘油，分装小瓶，低温保存。