多克隆抗体制备的技术概述
多克隆抗体的制备方法
多克隆抗体的制备方法多克隆抗体是由多个不同的免疫细胞（多克隆）产生的抗体混合物，可以识别并结合到目标生物标志物上。
多克隆抗体在科学研究、临床诊断和治疗中具有重要的应用价值。
制备多克隆抗体需要经过一系列复杂的实验流程，下面将详细介绍多克隆抗体的制备方法。
一、抗原的选择在制备多克隆抗体时，首先需要选择一个合适的抗原。
抗原通常是目标生物标志物的蛋白质或多肽片段。
选择抗原的关键因素包括其表达水平、稳定性和纯度。
抗原的选择直接影响到最终多克隆抗体的亲和力和特异性。
二、免疫小动物免疫小动物通常是用于制备多克隆抗体的主要实验动物，例如小鼠、兔子、大鼠等。
在免疫前需要确保小动物健康，并对其进行相应的预处理，如注射驱虫药物、进行适当的接种。
还需要根据具体实验要求决定预免疫、免疫计划以及免疫方案的制定。
三、免疫过程免疫过程是制备多克隆抗体的核心环节。
首先需将抗原与适当的佐剂混合，增强免疫原性，然后用于免疫小动物。
在免疫过程中需要控制免疫剂量和免疫间隔时间，以及监测动物的免疫应答情况。
免疫后还需要定期采集血清样本，监测抗体滴度的动态变化。
四、细胞融合与筛选经过一段时间的免疫后，需要从免疫动物的脾脏或骨髓中收集免疫细胞，然后与肿瘤细胞进行融合，得到杂交瘤细胞。
随后采用限稀稀释法将杂交瘤细胞进行单克隆化分，筛选出高亲和力的多克隆抗体细胞株。
五、生产与纯化经过筛选的多克隆抗体细胞株需要进行扩大培养，生产足够数量的多克隆抗体。
之后通过蛋白质纯化技术，如亲和层析、离子交换层析等手段，从细胞培养上清液中纯化出多克隆抗体。
六、性质鉴定与应用纯化后的多克隆抗体需进行性质鉴定，包括亲和力、特异性、稳定性等方面的测试。
最后经过滤菌毒处理后，多克隆抗体可应用于科学研究、临床诊断、生物药物研发等领域。
多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，需要科学合理地选择抗原、合理设计免疫方案、熟练掌握细胞融合和筛选技术，以及对多克隆抗体进行严格的生产和性质鉴定。
多克隆抗体制备
初次应答(primary response)
机体初次接受适量的抗原刺激后，引起体内抗体产生的过程 称为初次应答，主要特点为： ①机体初次接触抗原后，需经一定的潜伏期血清中才能出现 抗体，潜伏期的长短取决于抗原的性质、抗原进入机体的途 径、所用的佐剂类型、受体情况等，潜伏期之后为抗体的对 数上升期，抗体含量直线上升，然后为持续期，抗体产生和 排出相对平衡，最后为下降期； ②初次应答最早产生的抗体为 IgM，可在几天内达到高峰， 然后开始下降，接着才产生 IgG，IgG 抗体产生的潜伏期比 IgM 长，如果抗原剂量少，可能仅产生 IgM，IgA 产生最迟， 而且含量少； ③初次应答产生的抗体总量较低，维持时间也短，通常以 IgM 为主，且抗体的平均亲和力较低。
鸡
鸡的种系距哺乳动物较远,用以制备抗哺乳动物蛋白 质的抗体具有独特的优点。 鸡的IgG常称IgY,其特点是不会激活哺乳动物的补体 成分C1,也不会与细菌蛋白A或蛋白质G、哺乳动物的 Fc受体或类风湿因子等发生反应。在极端条件下,鸡 IgY的稳定性不如家兔IgG,不过,鸡的IgY在鸡蛋内可保 持稳定达数月之久,纯品IgY在中性缓冲液和冷藏条件 下则可保存数年之久。用鸡IgY已经制备出Fc和单价 的Fab或Fab′等片段。 鸡可将大量IgY输送入鸡蛋黄中, 从鸡蛋中收获抗体 可避免采用损伤性的收集手段。
机体免疫系统受到抗原刺激后，免疫细胞发生一系列变化，并产生一定 免疫效应的过程。 (一) 感应阶段(inductive stage) 称致敏阶段(sensitization stage)，是抗原物 质进入体内，抗原递呈细胞(APC)对其识别、捕获、加工处理和递呈，以 及抗原特异性淋巴细胞(T 细胞和 B 细胞)对抗原的识别阶段。 ( 二) 增生分化阶段(proliferative and differentiative stage) 又称反应阶段 (reactive stage)，是抗原特异性淋巴细胞识别抗原后活化，进行增殖与分 化，以及产生效应性淋巴细胞和效应分子的过程。T 细胞增殖分化为淋 巴母细胞，最终成为效应 T 细胞(或称致敏 T 细胞)，并产生多种细胞因子； B 细胞增殖分化为浆细胞，合成并分泌抗体。一部分 T、B 淋巴细胞在分 化过程中成为记忆细胞(Bm 和 Tm)。在此阶段，有多种细胞间的协作和多 种细胞因子的参加。 (三) 效应阶段(effective stage) 此阶段是由活化的效应细胞(CTL 与 TD 或 TDTH)和效应分子(抗体与细胞因子)发挥细胞免疫效应和体液免疫效应的 过程。这些效应细胞和效应分子共同作用清除抗原异物。
多克隆抗体的制备方法
多克隆抗体的制备方法多克隆抗体的概念：由多个B淋巴细胞克隆所产生的，受到多种抗原决定簇刺激并可与多种抗原表位结合的抗体。
多克隆抗体的制备主要包括以下几个步骤：免疫动物、佐剂、免疫原、免疫、取血等。
多克隆抗体的制备步骤一、器材剪刀(剪兔毛用)一把、弯头眼科手术镊子(游离血管用)一把、直头眼科手术剪(剪血管用)一把，手术刀架，手术刀片，注射器(1ml、10ml，25ml)附针头，兔子固定架，灭菌三角烧瓶(200ml)或平皿(直径18cm)、弯头止血钳四把，直头止血钳两把，手术缝合线，塑料放血管，纱布等。
二、试剂生理盐水(或PBS)弗氏完全佐剂(Freund’s complete adjuvant，FCA)弗氏不完全佐剂(Freund’s incomplete adjuvant，FIA)二甲苯，酒精棉，脱脂棉，2% NaN3三、免疫原：蛋白或KLH偶联的多肽。
每次免疫100-200μg免疫原。
四、兔子的选择兔子的重量应在四斤以上，两耳光滑，明显可见耳静、动脉，健康。
五、免疫用生理盐水稀释免疫原，然后与相应的佐剂进行1:1混合。
抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，将该乳剂在兔子双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后大腿进行肌肉注射。
每个区域大约用1/4的免疫原。
这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答。
注：抗原注射以前需要收集一些正常血清，已备检测抗体时作为阴性对照。
待兔子在新环境中稳定，大概需要四天左右时间，可以进行耳动脉取血。
取血量约5ml足矣。
免疫用的抗原必须纯化，否则影响抗体的质量。
抗原经FCA或FIA充分乳化后才能注射。
将抗原液与佐剂等比例混合后，置于混合器上使之剧烈振荡使抗原充分乳化，乳化过程比较费时、费力，但若乳化不充分，会影响免疫的效果，振荡后，1000rpm离心一分钟，如水相和油相不分层即可注射。
首次免疫用FCA，以后都用FIA。
免疫方法可采用背部多点注射法。
即于家兔脊柱两旁选4-6点皮下注射，每点注0.1ml，间隔2周后再于上述部位选不同点注射(不要选择临近位点，否则溃疡愈合不好)。
多克隆抗体制备
多克隆抗体制备克隆抗体是一种由抗原催化，从单克隆抗体产生来源的原核或真核抗体，由单株抗原调节器培养的克隆表达系统来制备。
它是一种从单克隆抗体产生来源的原核或真核抗体，广泛田间地走在研究免疫体系中，在流行性疾病筛查，检测和新药研发中发挥着重要作用。
经过多次迭代，可以有效的改善克隆的稳定性和效率，也可以有效地延长克隆的可用性。
本文综述了克隆抗体的基本原理及其制备方法。
建立原核或真核克隆抗体的细胞模型包括两个抗原调节器，一个是负调节器，另一个是正调节器。
负调节器通常由带有表达调节核苷酸（如表达强迫蛋白）组成，正调节器由表达调节核苷酸（如自表达调控元件）和表达抗原基因组成。
正调节器激活抗原基因表达，而负调节器则阻止抗原基因表达。
这样，调节器就可以控制抗原表达，从而实现克隆抗体的稳定生产。
为实现克隆抗体的生产，通常用培养的表达系统，在这种系统中，克隆基因可以独立表达，避免基因杂交而形成杂合复合体而影响抗原的活性。
这些系统中可以使用不同负调节因子和促进因子，控制不同抗原表达。
由于克隆抗体是以DNA编码的，因此可以通过多种方式实现克隆抗体制备，例如构建克隆板、复制抗体Gene libraries的构建、克隆表达系统的建立与克隆筛选等方法结合起来实现生产。
克隆板的建立主要利用基因切割和位点突变的技术，来筛选出所需的表达th=基因，从而获得克隆抗体。
复制抗体Gene libraries的构建主要是利用基因组学技术，从自然进化中获取特定抗原表达的基因。
在克隆表达系统建立过程中，会选择合适的负调节因子和促进因子，来实现对特定抗原的表达，并通过克隆筛选实现克隆抗体的连续生产。
克隆抗体被用于一系列疾病、感染和肿瘤等疾病的研究，如癌症、艾滋病和病毒感染研究。
它们由表达抗原的克隆细胞所产生，是一种具有特定抗原结构的特异性抗体，可用于识别肿瘤细胞，检测药物的活性和作为药物的新靶标。
总之，克隆抗体制备技术为研究免疫反应和制备特异性抗体提供了一种有效的平台，其抗击重要疾病的作用无可比拟。
多克隆抗体制备免疫小鼠 (2)
多克隆抗体制备免疫小鼠简介多克隆抗体制备是一种常用的实验技术，用于获得特定蛋白质及其表位的抗体。
免疫小鼠是多克隆抗体制备的常见动物模型之一。
本文将介绍多克隆抗体制备免疫小鼠的一般流程和关键步骤。
流程多克隆抗体制备免疫小鼠的流程主要包括以下几个步骤：1.抗原制备：准备目标蛋白质作为免疫小鼠的抗原，可以是纯化的蛋白质、重组蛋白质或合成的多肽。
2.免疫小鼠：将抗原与适当的佐剂混合，注射到小鼠体内，观察免疫反应情况。
3.收集抗体：采集小鼠的血液样本，离心分离血清，获得抗体。
4.抗体筛选：使用各种筛选方法（如酶联免疫吸附试验、免疫组织化学染色等）筛选出特异性较好的抗体。
5.抗体纯化：通过亲和层析、离子交换层析等技术，对抗体进行纯化，得到高纯度的抗体。
关键步骤抗原制备抗原制备是多克隆抗体制备的关键步骤之一。
抗原质量的好坏直接影响免疫小鼠及最终制备的抗体的质量。
以下是一些常见的抗原制备方法：•纯化蛋白质：通过基于亲和层析、离子交换层析等技术，从含有目标蛋白质的来源中纯化目标蛋白质。
•重组蛋白质：利用基因工程技术在大肠杆菌或其他表达系统中表达目标蛋白质，然后通过亲和层析或其他纯化方法纯化目标蛋白质。
•合成多肽：合成目标蛋白质的特定片段或多肽，用于免疫小鼠。
适当的佐剂适当的佐剂对于免疫小鼠产生良好的免疫响应非常重要。
佐剂的作用是增强抗原的免疫原性和稳定性，促进免疫细胞的活化。
常用的佐剂包括完全佐剂（如完全弗氏佐剂）和不完全佐剂（如不完全弗氏佐剂）。
免疫小鼠免疫将抗原与适当的佐剂混合后，通过皮下注射、腹腔注射等方式将抗原注射到小鼠体内。
注射后，可以观察小鼠的免疫反应情况，如产生抗原特异性抗体。
血液采集和抗体收集一段时间后，如一般在免疫小鼠体内产生可检测到的抗体，可以采用静脉采血的方式采集小鼠的血液。
血液离心后，就可以获得含有抗体的血清。
抗体筛选和纯化获得含有抗体的血清后，可以使用各种筛选方法对抗体进行筛选，如酶联免疫吸附试验（ELISA），免疫组织化学染色等。
多克隆抗体
多克隆抗体多克隆抗体: 原理、应用和优势摘要：多克隆抗体是一种可以广泛应用于生物医学研究、临床诊断和治疗的重要工具。
本文将介绍多克隆抗体的原理、应用和优势，帮助读者更好地了解和使用多克隆抗体。
1. 引言多克隆抗体是由多个不同的B细胞克隆所产生的抗体群体。
相比于单克隆抗体，多克隆抗体具有多种来源细胞、多样性抗体特异性和高抗原亲和力的优势。
2. 多克隆抗体的原理多克隆抗体的制备需要经历免疫原注射、免疫细胞制备、抗体筛选和克隆扩增等步骤。
通过注射抗原刺激机体免疫系统，激发B细胞产生特异性抗体。
然后通过细胞融合技术或酶消化法获得抗体产生的细胞系，最后经过筛选和扩增获得多克隆抗体。
3. 多克隆抗体的应用多克隆抗体在生物医学研究、生物工程和医学诊断等领域具有重要应用价值。
在科研中，多克隆抗体可用于蛋白质表达分析、免疫组化染色、免疫印迹、酶联免疫吸附测定等实验技术。
在临床诊断中，多克隆抗体可用于检测病原体感染、肿瘤标志物和药物浓度。
此外，多克隆抗体还可应用于治疗，如癌症免疫治疗和抗体药物研发。
4. 多克隆抗体的优势相比于单克隆抗体，多克隆抗体具有以下几个优势：4.1 多源性：多克隆抗体通过多个细胞克隆产生，能够识别抗原上的多个不同部位，从而提高抗体的特异性和亲和力。
4.2 可灵敏性：多克隆抗体可以通过融合多个细胞系来增加抗体的生产量，提高实验的灵敏性和可靠性。
4.3 高特异性：多克隆抗体可识别抗原上多个不同的表位，在检测复杂样本中具有更高的特异性。
4.4 宽适应性：多克隆抗体对于不同类型的抗原具有较强的适应性，可以应用于多种研究领域和技术平台。
5. 多克隆抗体的挑战与优势相对应的是多克隆抗体也存在一些挑战。
制备多克隆抗体需要免疫动物，然后通过脾细胞和骨髓细胞等制备免疫细胞，这个过程较为复杂且不易实施。
此外，多克隆抗体的批次间差异性较大，因此需要进行一定的筛选和验证工作。
6. 结论多克隆抗体作为一种重要的实验工具，在生物医学研究、生物工程和医学诊断等领域发挥着重要作用。
多克隆抗体的制备过程及原理
多克隆抗体的制备过程及原理
多克隆抗体是一种由多个不同的B细胞克隆所产生的抗体，能够识别并结合多个抗原表位。
其制备过程主要包括以下几个步骤：
1. 免疫原的选择：选择目标抗原，可以是蛋白质、多肽、细胞表面蛋白等。
2. 免疫动物的选择：根据抗原的物种来源，选择合适的免疫动物，如小鼠、兔子、山羊等。
3. 免疫动物的免疫：将免疫原注射到免疫动物体内，激发免疫反应。
通常采用多次免疫，间隔一定时间进行。
4. 细胞融合：从免疫动物体内提取免疫细胞，通常采用脾细胞或骨髓细胞。
与骨髓或脾细胞进行融合，得到杂交瘤细胞。
5. 杂交瘤细胞筛选：采用筛选培养基，筛选出杂交瘤细胞，一般是通过对杂交瘤细胞进行限稀稀释培养，进行单克隆细胞的筛选。
6. 克隆抗体的生产：将单克隆细胞进行扩增，并进行细胞培养，使其产生大量的抗体。
多克隆抗体制备的原理是利用免疫动物的免疫系统产生多个克隆的抗体。
当免疫
原进入免疫动物体内时，会激发免疫细胞产生对应的免疫反应，形成多个不同的克隆细胞。
这些克隆细胞会产生具有不同的抗体结构的抗体分子。
通过细胞融合和杂交瘤筛选的步骤，可以筛选出产生目标抗原特异性抗体的单克隆细胞，并进行大规模生产。
这样就获得了能够结合多个抗原表位的多克隆抗体。
多克隆抗体制备的技术_PPT幻灯片
• 纯化：盐析法
•
凝胶过滤法
•
离子交换层析法
•
亲和层析法
•
电泳分离法
• 浓缩：吸收浓缩
•
蒸发浓缩
•
超滤浓缩
• 研钵乳化法 • 直接在旋涡振荡器上乳化 • 组织捣碎器乳化 • 注射器乳化 • 胶体磨
二、动物免疫
（一）免疫动物的选择
选择动物时应考虑以下因素： ①抗原来源与动物种属的关系。抗原的来源与免疫 动物种属差异越远，其免疫源性越强，免疫效果越 好，而同种系或亲缘关系越近，免疫效果越差。 ②动物个体的选择。适龄、健康、体重符合要求的 正常动物（以雄性为佳）；抗体需要量少时，选用 家兔、豚鼠和鸡等小动物；抗体需要量大时，可选 用绵羊、山羊、马、驴等大动物。 ③抗原性质与动物种类
•
合成类载体：人工合成的多肽聚合
物
2.连接方法
半抗原与载体的连接有物理法和化学法。
• 物理法 是用物理吸附法将载体与半抗原连 接，其原理是通过电荷和微孔来吸半抗原， 吸附载体主要有PVP和CMC等；
• 化学法 是利用某些功能基团把半抗原连接 到蛋白质类或多肽类聚合物载体上。不同的 半抗原应选用不同的方法进行连接。
（二）免疫方法
• 根据抗原的性质、免疫原性和动物的免疫 反应性来决定免疫途径、免疫次数和间隔 时间等肉注射
•
静脉注射
•
腹腔注射以及淋巴结内注射
• 注射间隔时间：
• 带佐剂的皮内、皮下注射，一般为间隔 2～ 4 周免疫一次。
• 不带佐剂的皮下或肌肉注射，一般为 1～2 周间隔时间；肌肉或静脉免疫的，可 5 天 左右的间隔时间。
抗原的提取与纯化
• 提取：
• 水溶液提取法 • 有机溶剂提取法 • 纯化： • 超滤，盐析，电泳，凝胶过滤，离子交换，
多克隆抗体纯化-、
汇报内容
一 抗体技术的简介
二
多克隆抗体纯化的研究及应用
三
实验思考
一、抗体技术的简介
抗体制备技术的发展阶段
1
2
基因的原核表达及抗体的制备
3
多克隆抗体的纯化技术
1. 抗体制备技术的发展阶段：
抗体：B细胞分泌的能够特异性结合抗原的免疫球蛋白。
1890年Behring等发现抗白喉毒 素抗体，开始了以抗原免疫动物 来获得多克隆抗体(Pabs) 的途径 1975年 kohler等创建杂交瘤技 术制备单克隆抗体(McAb)
强度，中和抗体
表面大量电荷。
中性盐有： 硫酸 铵、 硫酸钠、 硫 酸镁、 氯化钠及 磷酸盐等。
的上清液， 再经 硫酸铵沉淀。
[1]甘丽晶,刘晓波,胡质毅.抗体分离纯化技术研究进展[J].检验医学与临床,2013,04:461-464.
二、多克隆抗体纯化的研究及应用
1 微生物方面的研究应用
2
动物方面的研究应用
4]庞学燕,季昀,王洪荣,魏宗友,王梦芝.奶牛α_s-酪蛋白多克隆抗体的制备、纯化及鉴定[J].动物营养学报,2012,11:2190-2194
3. 植物方面的研究应用
3.1 拟南芥蛋白磷酸酶TOPP4的多克隆抗体纯化
在拟南芥中， 该磷酸酶家族有９个成员， 分别命名TOPP1-9， 这些蛋白
质序列高度保守， 部分序列存在特异性。
3
植物方面的研究应用
4
茶叶方面的研究应用
1. 微生物方面的研究应用
1.1 大肠杆菌O157：H7 多克隆抗体纯化
采用盐析法、亲和层析法和抗原抗体复合物解离法获得其纯化产物 ,比较各纯化产 物的比效价、纯度及交叉反应性。
多克隆抗体的制备
50%饱和硫酸铵盐溶液可沉淀析出血清球蛋白； 8%～12%PEG6000可沉淀IgG。
超滤法： 利用孔径大小不同的特制薄膜对不同分子大小的抗原 物质进行滤筛。
电泳
层析法： 凝胶过滤层析 离子交换层析 亲和层析 疏水层析 反相层析
精分离
蛋白鉴定
抗体亲合常数测定
亲合常数测定采用非竞争酶免疫试验法：
先确定在某一抗原浓度时抗体可以达到饱和；
以该抗原浓度为实验条件，饱和时的OD值作为OD-100， 找出OD-50时的抗体浓度和相应的抗原浓度；
根据公式Ka= n-1
计算抗体的Ka值。
2(n[Ab’]t-[Ab ]t)
t代表测定时的温度； n=[Ab]t/[Ab’]t； [Ab]t 表示抗原浓度较高的Amax的一半； [Ab’]t表示抗原浓度较低的Amax的一半。
免疫原的制备
免疫原（immunogen）： 指能刺激机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞 的抗原最重要的性质是免疫原性（immunogenicity）.
免疫原种类： 天然抗原、人工合成抗原； 蛋白质、多糖、脂类、核酸抗原。
细胞性抗原制备： 绵羊红细胞（SRBC）- 溶血素； 细菌- 抗菌抗体（动物免疫血清）。
白等，其中以牛血清白蛋白最为常用。
（2）多肽类聚合物：是由人工合成的多肽聚合物，也是一类良 好的载体，常用的有多聚赖氨酸。
（3）大分子聚合物：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、羧甲基纤维素 (CMC)等皆可与半抗原结合，加入福氏完全佐剂可诱导动物 产生良好的抗体。
连接方法：
物理法：是用物理吸附法将载体与半抗原连接，其原 理是通过电荷和微孔来吸半抗原，吸附载体主要有 PVP和CMC等；
多克隆抗体的制备,纯化及检测
利用蛋白质免疫印迹法或免疫电泳方法检查抗体产生情况。
二、亲和层析法纯化抗体
【实验原理】
如图所示，亲和层析的高度选择性使得从某一初始材料中纯化，富集某一含量较低的 目的蛋白成为可能，因此亲和层析是蛋白质分离纯化过程中最有效的方法之一。另外，如 果配基与蛋白质的亲和能力很强，也可同时进行样品的浓缩。
适合产生抗体，因此在注射前通常采用一些经典的方法，比如柱层析、分级萃取、亚细胞
分离等进行抗原的分离和纯化。如果多肽抗原在 SDS/PAGE 中为可见的单一带，抗原从凝
胶中的抽提可作为纯化的最后一个步骤。
⒉ 预放血
轻轻的将兔子放在特制兔盒中，处于放松状态的兔子采血会较容易。按压兔子耳根部
直至血管突出,然后将针头插入耳部血管的中上部，观察到进针后小心推出活塞收集血液
前出现凝固可用温水轻擦切口处，再继续收集。收集适量血液后可用消毒后的纱布轻擦患
处，轻按患处 10 秒-20 秒确定血流停止后方可结束。 ⑵ 将血液在 37°C 恒温箱中放置 30 分钟，再在 4°C 放置过夜。用药铲将血凝块从管
壁上拨落，将血液转移至塑料离心管中，4°C，10,000g 离心 10 分钟，收集上清液即为抗 血清，可在-20°C 保存数年。
实验九 多克隆抗体的制备，纯化及免疫电泳
【实验目的】
⒈ 加深对抗体基本知识的了解。 ⒉ 了解多克隆抗体的制备及纯化的基本方法。 ⒊ 了解免疫电泳的基本过程和实验依据。
一、多克隆抗体的制备 【实验原理】
当将抗原注射入实验动物体内时，一系列抗体生成细胞会不同程度的与抗原结合，受 抗原刺激后在血液中产生不同类型的抗体，这种由一种抗原刺激产生的抗体称为多克隆抗 体。多克隆抗体中不同的抗体分子可以以不同的亲和能力与抗原分子表面不同的部分—抗 原决定簇相结合。
多克隆抗体的制备流程及原理
多克隆抗体的制备流程及原理
多克隆抗体的制备流程及原理可以参考以下步骤：
1. 抗原免疫：使用目标抗原免疫动物，例如小鼠，在一定时间间隔内多次免疫。
抗原可以是纯化的蛋白质、多肽片段或者细胞/组织提取物。
2. 细胞融合：将免疫小鼠脾脏与骨髓中的浆细胞混合，然后使用聚乙二醇等方法促使细胞融合，获得杂交瘤细胞。
3. 杂交瘤筛选：将杂交瘤细胞悬浮液分别分装于多个培养皿中，含有杀死未融合细胞的培养基中，通过限制性稀释法或离子交换法，筛选出高产、单克隆抗体的杂交瘤细胞。
4. 单克隆抗体培养与提取：将筛选出的单克隆杂交瘤细胞进行扩增培养，获取大量的细胞。
然后通过细胞培养上清液、腹水或腹水灌洗法获得单克隆抗体。
多克隆抗体制备的原理如下：
多克隆抗体是指由多个不同的抗体产生细胞(即多克隆细胞)产生的一类抗体。
其制备的原理是通过免疫动物多次免疫，激发机体产生大量的抗原特异性抗体。
不同的抗原特异性抗体由不同的抗体产生细胞产生，并经过体内的嫁接与筛选，获
得了多个具有抗原特异性的抗体。
多克隆抗体具有较广泛的抗原特异性，可以识别目标抗原的不同位点，因此可以广泛应用于免疫学、分子生物学、生物医学等领域。
多克隆抗体的制备技术
多克隆抗体的制备技术
多克隆抗体的制备技术是一种利用多个B细胞克隆的方法，用于生产特定抗原的抗体。
具体步骤如下：
1. 抗原制备：首先，需要制备抗原。
抗原可以是蛋白质、病原体、多肽或其他分子，可以通过基因工程技术在大肠杆菌等表达系统中表达、纯化或合成。
2. 免疫小动物：将制备好的抗原注射到小动物体内（如小鼠、兔子或大鼠）作为免疫原。
这样做可以激发动物的免疫系统产生抗原特异性的抗体。
3. 收集抗体：收集免疫小动物产生的抗原特异性抗体。
一般情况下，可以通过静脉采血或收集腹水来获得抗体。
4. 抗体纯化：对采集到的抗体进行纯化，可以使用亲和层析或离子交换层析等技术进行精确的纯化。
5. 克隆：将纯化的抗体进行多次稀释，然后分别稀释至单个细胞级别。
接下来，将单个细胞分别种植在含有培养液的孔中，使其形成克隆。
6. 验证：对每个克隆进行酶联免疫吸附测定（ELISA）或其他检测方法验证抗体的特异性和亲和力。
7. 扩大培养：对验证合格的克隆进行扩大培养，使其产生大量的抗体。
通过以上步骤，可以制备出多个来自不同克隆的抗体，这些抗体可以与同一抗原结合，用于生物学研究、诊断和治疗等领域。
多克隆抗体的制备方法
抗体的制备方法与原理一、抗血清的制备有了质量好的抗原，还必须选择适当的免疫途径，才能产生质量好（特异性强和效价高）的抗体。
（一）用于免疫的动物作免疫用的动物有哺乳类和禽类，主要为羊、马、家兔、猴、猪、豚鼠、鸡等，实验室常用者为家兔、山羊和豚鼠等。
动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量，如一般制备抗r-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清，用于免疫的动物应适龄，健壮，无感染性疾患，最好为///雄性，此外还需十分注意动物的饲养，以消除动物的个体差异以及在免疫过程中死亡的影响。
若用兔，最好用纯种新西兰兔，一组三只，兔的体重以2～3kg为宜。
（二）免疫途径免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等，一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射0.1ml左右。
途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物学活性抗原，一般不宜采用静脉注射。
（三）佐剂由于不同个体对同一抗原的反应性不同，而且不同抗原产生免疫反应的能力也有强有弱，因此常常在注射抗原的同时，加入能增强抗原的抗原性物质，以刺激机体产生较强的免疫反应，这种物质称为免疫佐剂。
佐剂除了延长抗原在体内的存留时间，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激网状内皮系统，使参与免疫反应的免疫活性细胞增多，促进T细胞与B细胞的相互作用，从而增强机体对抗原的细胞免疫和抗体的产生。
常用的佐剂是福氏佐剂（Freund adjuvant）,其成分通常是羊毛脂1份、石腊油5份，羊毛脂与石腊油的比例，视需要可调整为1：2～9（V/V），这是不完全福氏佐剂，在每毫升不完全佐剂加入1～20mg卡介苗就成为完全佐剂。
配制方法：按比例将羊毛脂与石蜡油置容器内，用超声波使之混匀，高压灭菌，置4℃下保存备用。
免疫前取等容积完全或不完全佐剂与免疫原溶液混合，用振荡器混匀成乳状，也可以在免疫前取需要量佐剂置乳钵中研磨，均匀后再边磨边滴加入等容积抗原液（其中加卡介苗3～4mg/ml或不加），加完后再继续研磨成乳剂，滴于冰水上5～10min内完全不扩散为止。
多克隆抗体制备流程_概述及解释说明
多克隆抗体制备流程概述及解释说明1. 引言1.1 概述多克隆抗体制备是一种重要的生物学技术，用于生成大量具有特异性的抗体来识别和结合特定的抗原分子。
这项技术已经广泛应用于医学、生物学和生物工程等领域，对于疾病的诊断、治疗以及基因工程药物研发都起着关键性作用。
1.2 文章结构本文将对多克隆抗体制备流程进行全面概述和解释说明。
首先在引言部分，我们将对文章的整体内容进行简单介绍，并阐明本篇文章的结构。
1.3 目的本文旨在提供一个清晰而详细地描述多克隆抗体制备流程的指南，使读者能够了解到该过程中各个步骤的目标与实施方法。
同时，我们还将涵盖实验操作中需要注意的事项以及可能出现的常见问题及其解决方案，帮助读者更好地开展多克隆抗体制备相关实验工作。
以上是“1. 引言”部分内容，下面将进入“2. 多克隆抗体制备流程概述”的撰写。
2. 多克隆抗体制备流程概述:2.1 抗原选择:在多克隆抗体制备过程中，首先需要选择合适的抗原。
抗原应具备以下特点：足够纯净、增强免疫原性、易于制备和保存，以及与目标分子高度特异性结合。
2.2 免疫动物选择与免疫原制备:在多克隆抗体的制备中，通常以小鼠作为主要的免疫动物。
小鼠免疫系统响应强且易于操作。
然而，在某些情况下，也可选用其他动物如大鼠、兔子等进行免疫。
针对所选抗原，需要将其与适当的佐剂混合以增强其免疫原性，比如与完全佐剂(Freund's adjuvant)或不完全佐剂(完全佐剂的无菌油乳化液形式)混合。
这有助于激发有效的抗体产生。
2.3 免疫程序与方案设计:在完成对抗原和佐剂的混合后，接下来是根据制备目标和实验需求设计合理的免疫程序和方案。
通常包括首次免疫、增强免疫和最后的终次免疫。
在首次免疫后，需要根据抗体滴度等因素评估免疫反应情况，并判断是否需要进行增强免疫。
增强免疫有助于提高抗体产量和质量。
为了更好地激发和筛选出理想的抗体阳性杂交瘤细胞株，还需要在合适的时间点采集血液样本进行检测，评估抗原特异性IgG水平。
多克隆抗体简介
多克隆抗体技术简介一、技术说明由多种抗原决定簇刺激机体。
一系列抗体生成细胞会不同程度地与抗原结合，在血液中相应地产生不同类型的单克隆抗体，这种由一种抗原刺激产生的混杂在一起的单克隆抗体称为多克隆抗体。
通过免疫动物、血清效价检测、采集血清、纯化抗体等过程制备针对同一抗原不同表位的抗体的技术称之为多克隆抗体制备技术。
二、技术原理当抗原注射入实验动物体内时，刺激网状内皮细胞系统，使淋巴结和脾脏的淋巴细胞大量增殖。
首次注射后大约7d，在血清中可以观察到抗体，但抗体的浓度维持在一个较低的水平，大约10d抗体的滴度会达到最大值。
但同种抗原注射而产生的二次免疫应答的结果明显不同，和初次免疫应答相比抗体的合成速度明显增加并且保留时间也长。
进而通过收集动物血清，借助亲和纯化方法将抗体从血清中纯化出来以得到多克隆抗体。
三、技术流程四、研究进展（一）抗原获得方法制备多克隆抗体所用的抗原一般来源有两种，即原核表达和合成多肽。
原核表达可以在较短的时间内获得基因表达产物，所需成本较低，但是也有些外源基因无法进行原核表达。
多肽合成是将分析好的多肽抗原进行固相或液相合成，抗原性高，但成本也高。
因此在实际实验过程中应该把原核表达和多肽合成有效结合起来完成多克隆抗体的制备。
（二）所用动物的选择获得多克隆抗体的最终步骤是动物免疫。
其中选择合适的免疫动物尤为重要。
一般来讲，所选择的蛋白抗原供体与免疫动物种系不可太接近，亲缘太近不易产生良好抗体，甚至不产生抗体(如兔和大鼠、鸡和鸭)。
免疫动物包括家兔、啮齿类、鸡等小型实验动物以及绵羊、马、山羊等大型家畜。
其中家兔是最适合制备抗体的动物；小鼠一般用于单克隆抗体制备，在需要大量抗血清时，主要用大型家畜。
在动物性别、年龄以及数量上的选择一般选用雌性、青壮年期1只以上的个体。
患病或处于感染、饥饿状态均会影响免疫效果，因此应选用健康壮实的动物。
在实际免疫过程中还需要根据不同性质的免疫原选择使用动物进行免疫。
多克隆抗体的制备方法
多克隆抗体的制备方法摘要：一、引言二、多克隆抗体的概念与作用三、多克隆抗体的制备方法1.动物免疫2.融合细胞培养3.筛选与克隆4.抗体检测与纯化四、制备过程中的注意事项五、应用领域与发展前景六、总结正文：一、引言多克隆抗体，作为一种具有广泛应用前景的生物制品，其在科学研究、医学诊断、生物制药等领域具有重要价值。
本文将详细介绍多克隆抗体的制备方法，以期为相关领域的研究者提供参考。
二、多克隆抗体的概念与作用多克隆抗体是指由多个B细胞克隆产生的具有相同抗原结合能力的抗体。
它们可以识别并结合抗原的不同表位，从而提高抗体的针对性和广泛性。
多克隆抗体在免疫检测、疾病诊断、治疗肿瘤和病毒感染等方面具有显著作用。
三、多克隆抗体的制备方法1.动物免疫：选用适合的动物（如小鼠、兔子等）进行免疫，通常采用皮下注射或静脉注射的方式，使动物产生针对特定抗原的免疫应答。
免疫周期一般为2-3周，期间需要多次注射抗原。
2.融合细胞培养：收集免疫动物的脾细胞和骨髓瘤细胞，进行细胞融合。
融合后的细胞能够在体外培养条件下生长繁殖，并分泌针对抗原的抗体。
3.筛选与克隆：筛选出具有特定抗原结合能力的杂交瘤细胞，对其进行克隆化培养。
克隆化培养有助于获得具有相同抗原结合能力的抗体细胞株。
4.抗体检测与纯化：对筛选出的抗体细胞株进行抗体检测，筛选出具有较高抗体滴度的细胞株进行体外培养。
培养后的抗体需进行纯化，以获得高纯度的多克隆抗体。
纯化方法包括柱层析、凝胶过滤等。
四、制备过程中的注意事项1.抗原的选择：选用具有良好免疫原性的抗原，以提高抗体的免疫应答效果。
2.动物免疫方案：根据动物种类和抗原性质制定合适的免疫方案，包括抗原剂量、免疫途径和免疫周期。
3.细胞融合与培养：确保细胞融合充分，避免未融合的细胞或融合细胞的自融合。
培养过程中注意观察细胞生长状态，以保证抗体产量和质量。
4.抗体检测与纯化：采用可靠的抗体检测方法，如ELISA、免疫组化等。
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• 载体：天然蛋白质载体：人血清蛋白，牛 血清蛋白….
•
合成类载体：人工合成的多肽聚合
物
2.连接方法
半抗原与载体的连接有物理法和化学法。
• 物理法 是用物理吸附法将载体与半抗原连 接，其原理是通过电荷和微孔来吸半抗原， 吸附载体主要有PVP和CMC等；
• 化学法 是利用某些功能基团把半抗原连接 到蛋白质类或多肽类聚合物载体上。不同的 半抗原应选用不同的方法进行连接。
多克隆抗体制备的技术
孟琳
抗体的制备技术经历了三代：
• 第一代抗体是传统的抗体制备方法即利用抗原免 疫动物后获得抗体，称为多克隆抗体 （polyclonal antibody）；
• 第二代抗体是通过杂交瘤技术制备出针对抗原中 某一抗原决定簇的抗体称为单克隆抗体 (monoclonal antibody, McAb)；
（二）免疫方法
• 根据抗原的性质、免疫原性和动物的免疫 反应性来决定免疫途径、免疫次数和间隔 时间等
• 免疫途径：皮下注射
•
皮内注射
•
肌肉注射
•
静脉注射
•
腹腔注射以及淋巴结内注射
• 注射间隔时间：
• 带佐剂的皮内、皮下注射，一般为间隔 2～ 4 周免疫一次。
• 不带佐剂的皮下或肌肉注射，一般为 1～2 周间隔时间；肌肉或静脉免疫的，可 5 天 左右的间隔时间。
般不用弗氏完全佐剂，以免卡介苗的干 扰。
2. 佐剂的免疫生物学作用
①增强抗原免疫原性：使无或微弱免疫原性的 物质变成持久或强的免疫原； ②增强机体对抗原刺激的反应性，提高初次应 答和再次应答所产生的抗体滴度； ③改变抗体类型，使产生抗体由IgMG型转变 为IgG型； ④引起或增强迟发性超敏反应。
乳化作用
• 纯化：盐析法
•
凝胶过滤法
•
离子交换层析法
•
亲和层析法
•Hale Waihona Puke 电泳分离法• 浓缩：吸收浓缩
•
蒸发浓缩
•
超滤浓缩
佐剂：弗氏不完全佐剂（incomplete Freund's adjuvant,IFA）
•
弗氏完全佐剂（complete Freund's
adjuvant,CFA）
• 初次免疫时，最好用弗氏完全佐剂，以刺 激机体产生较强的免疫反应。再次免疫时，
一般不用完全佐剂，而采用弗氏不完全佐
剂。但在研究分枝杆菌及相关抗原时，一
• 研钵乳化法 • 直接在旋涡振荡器上乳化 • 组织捣碎器乳化 • 注射器乳化 • 胶体磨
二、动物免疫
（一）免疫动物的选择
选择动物时应考虑以下因素： ①抗原来源与动物种属的关系。抗原的来源与免疫 动物种属差异越远，其免疫源性越强，免疫效果越 好，而同种系或亲缘关系越近，免疫效果越差。 ②动物个体的选择。适龄、健康、体重符合要求的 正常动物（以雄性为佳）；抗体需要量少时，选用 家兔、豚鼠和鸡等小动物；抗体需要量大时，可选 用绵羊、山羊、马、驴等大动物。 ③抗原性质与动物种类
•
筛选和位点特异性整和技术
多克隆抗体制备流程
• （一）抗原的制备 • （二）免疫动物 • （三）免疫血清的收集 • （四）免疫血清的分离纯化
一、抗原的制备
• 可以作为抗原的物质有很多种，一般的科 研实验中，经常使用的抗原有：偶联多肽、 偶联的小分子或化合物、天然或重组蛋白 等等。
• 对可溶性抗原而言，为了增强其免疫原性 或改变免疫反应的类型、节约抗原等目的， 常采用加佐剂的方法以刺激机体产生较强 的免疫应答。
三、动物采血
采集免疫血清前，要预先测试抗体效价测 定，若效价达到要求，应在末次免疫后一周 及时采血，否则抗体效价会下降。 ➢颈动脉采血法 ➢心脏采血法 ➢静脉采血法
四 抗体的分离和纯化技术
• 以理化性质提取均质的免疫球蛋白部分， 去除无关蛋白。
• 从免疫学角度提取与某特定抗原结合的特 异性抗体。用吸附抗原的免疫亲和柱进行 精细纯化。
• 第三代抗体是利用基因工程技术制备而来，称为 基因工程抗体(genetic engineering antibody)。
重组多克隆抗体
• Sarantopoulos首次提出的。
• 模拟了天然多抗的产生过程，克服了抗血 清和单克隆抗体的缺点，成为治疗复杂疾 病安全有效的制剂。
• 技术：全人抗体库的构建
细胞性抗原的制备
• 细胞破碎法：反复冻融法
•
冷热交替法
•
超声破碎法
•
自溶法
•
酶处里法
•
表面活性剂处理法
抗原的提取与纯化
• 提取：
• 水溶液提取法 • 有机溶剂提取法 • 纯化： • 超滤，盐析，电泳，凝胶过滤，离子交换，
亲和层析，高压液相法。
人工抗原
• 半抗原+大分子载体=免疫原
• 半抗原：相对分子量小，不具有免疫原性 多肽，核酸，甾体激素，化学药物