多克隆抗体制备的技术概述

• 纯化：盐析法
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凝胶过滤法
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离子交换层析法
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亲和层析法
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电泳分离法
• 浓缩：吸收浓缩
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蒸发浓缩
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超滤浓缩
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筛选和位点特异性整和技术
多克隆抗体制备流程
• （一）抗原的制备 • （二）免疫动物 • （三）免疫血清的收集 • （四）免疫血清的分离纯化
一、抗原的制备
• 可以作为抗原的物质有很多种，一般的科 研实验中，经常使用的抗原有：偶联多肽、 偶联的小分子或化合物、天然或重组蛋白 等等。
• 对可溶性抗原而言，为了增强其免疫原性 或改变免疫反应的类型、节约抗原等目的， 常采用加佐剂的方法以刺激机体产生较强 的免疫应答。
三、动物采血
采集免疫血清前，要预先测试抗体效价测 定，若效价达到要求，应在末次免疫后一周 及时采血，否则抗体效价会下降。 ➢颈动脉采血法 ➢心脏采血法 ➢静脉采血法
四 抗体的分离和纯化技术
• 以理化性质提取均质的免疫球蛋白部分， 去除无关蛋白。
• 从免疫学角度提取与某特定抗原结合的特 异性抗体。用吸附抗原的免疫亲和柱进行 精细纯化。
佐剂：弗氏不完全佐剂（incomplete Freund's adjuvant,IFA）
•
弗氏完全佐剂（complete Freund's
adjuvant,CFA）
• 初次免疫时，最好用弗氏完全佐剂，以刺 激机体产生较强的免疫反应。再次免疫时，
一般不用完全佐剂，而采用弗氏不完全佐
剂。但在研究分枝杆菌及相关抗原时，一
（二）免疫方法
• 根据抗原的性质、免疫原性和动物的免疫 反应性来决定免疫途径、免疫次数和间隔 时间等
• 免疫途径：皮下注射
•
皮内注射
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肌肉注射
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静脉注射
•
腹腔注射以及淋巴结内注射
• 注射间隔时间：
• 带佐剂的皮内、皮下注射，一般为间隔 2～ 4 周免疫一ห้องสมุดไป่ตู้。
• 不带佐剂的皮下或肌肉注射，一般为 1～2 周间隔时间；肌肉或静脉免疫的，可 5 天 左右的间隔时间。
• 研钵乳化法 • 直接在旋涡振荡器上乳化 • 组织捣碎器乳化 • 注射器乳化 • 胶体磨
二、动物免疫
（一）免疫动物的选择
选择动物时应考虑以下因素： ①抗原来源与动物种属的关系。抗原的来源与免疫 动物种属差异越远，其免疫源性越强，免疫效果越 好，而同种系或亲缘关系越近，免疫效果越差。 ②动物个体的选择。适龄、健康、体重符合要求的 正常动物（以雄性为佳）；抗体需要量少时，选用 家兔、豚鼠和鸡等小动物；抗体需要量大时，可选 用绵羊、山羊、马、驴等大动物。 ③抗原性质与动物种类
• 载体：天然蛋白质载体：人血清蛋白，牛 血清蛋白….
•
合成类载体：人工合成的多肽聚合
物
2.连接方法
半抗原与载体的连接有物理法和化学法。
• 物理法 是用物理吸附法将载体与半抗原连 接，其原理是通过电荷和微孔来吸半抗原， 吸附载体主要有PVP和CMC等；
• 化学法 是利用某些功能基团把半抗原连接 到蛋白质类或多肽类聚合物载体上。不同的 半抗原应选用不同的方法进行连接。
细胞性抗原的制备
• 细胞破碎法：反复冻融法
•
冷热交替法
•
超声破碎法
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自溶法
•
酶处里法
•
表面活性剂处理法
抗原的提取与纯化
• 提取：
• 水溶液提取法 • 有机溶剂提取法 • 纯化： • 超滤，盐析，电泳，凝胶过滤，离子交换，
亲和层析，高压液相法。
人工抗原
• 半抗原+大分子载体=免疫原
• 半抗原：相对分子量小，不具有免疫原性 多肽，核酸，甾体激素，化学药物
多克隆抗体制备的技术
孟琳
抗体的制备技术经历了三代：
• 第一代抗体是传统的抗体制备方法即利用抗原免 疫动物后获得抗体，称为多克隆抗体 （polyclonal antibody）；
• 第二代抗体是通过杂交瘤技术制备出针对抗原中 某一抗原决定簇的抗体称为单克隆抗体 (monoclonal antibody, McAb)；
般不用弗氏完全佐剂，以免卡介苗的干 扰。
2. 佐剂的免疫生物学作用
①增强抗原免疫原性：使无或微弱免疫原性的 物质变成持久或强的免疫原； ②增强机体对抗原刺激的反应性，提高初次应 答和再次应答所产生的抗体滴度； ③改变抗体类型，使产生抗体由IgMG型转变 为IgG型； ④引起或增强迟发性超敏反应。
乳化作用
• 第三代抗体是利用基因工程技术制备而来，称为 基因工程抗体(genetic engineering antibody)。
重组多克隆抗体
• Sarantopoulos首次提出的。
• 模拟了天然多抗的产生过程，克服了抗血 清和单克隆抗体的缺点，成为治疗复杂疾 病安全有效的制剂。
• 技术：全人抗体库的构建